Summary
Представлен протокол для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток яичников, используя специально сделанную фотоакустическую систему потока и целевые фолиевую кислоту, покрытые наночастицами сульфида меди.
Abstract
Многие исследования показывают, что перечисление циркулирующих опухолевых клеток (КТК) может показать обещание в качестве прогностиконного инструмента для рака яичников. Текущие стратегии обнаружения КТК включают цитометрию потока, микрофлюидные устройства и цепную реакцию полимеразы в реальном времени (РТ-ПЦР). Несмотря на последние достижения, методы выявления ранних метастазов рака яичников по-прежнему не имеют чувствительности и специфичности, необходимых для клинического перевода. Здесь представлен новый метод обнаружения циркулирующих опухолевых клеток яичников с помощью фотоакустической цитометрии потока (PAFC), используя пользовательскую трехмерную (3D) печатную систему, включая камеру потока и шприц-насос. Этот метод использует фолиевую кислоту крышкой медных сульфидных наночастиц (FA-CuS NPs) для целевой SKOV-3 раковых клеток яичников ПАФК. Эта работа демонстрирует сродство этих контрастных агентов для раковых клеток яичников. Результаты показывают, NP характеристики, PAFC обнаружения, и NP поглощения флуоресценции микроскопии, тем самым демонстрируя потенциал этой новой системы для обнаружения яичников CtCs в физиологически соответствующих концентрациях.
Introduction
Рак яичников является одним из самых смертоносных гинекологических злокачественных новообразований и привело, по оценкам, 184800 смертей во всем мире в 2018году 1. Многочисленные исследования показали корреляцию между прогрессированием рака яичников (т.е. метастазированием) и наличием КТК2,3,4. Наиболее распространенным методом обнаружения и изоляции CTCs использует систему Cellsearch, которая нацелена на рецептор EpCam5. Выражение EpCam, однако, downregulated в эпителии к мезенхимальному переходу, который был замешан в метастазах рака6. Несмотря на достижения, современные клинические технологии по-прежнему страдают от низкой точности, высокой стоимости и сложности. Из-за этих недостатков, новые технологии для обнаружения и перечисления яичников CTCs стала важной областью для исследований.
Недавно PAFC стала эффективным методом неинвазивного обнаружения раковых клеток, анализа наноматериалов и выявления бактерий7,8,9. PAFC отличается от традиционной цитометрии потока флуоресценции, обнаруживая аналиты в потоке с помощью фотоакустики. Фотоакустический эффект генерируется, когда лазерный свет поглощается материалом, который вызывает термоэластичную экспансию, производя акустическую волну, которая может быть обнаружена ультразвуковым преобразователем10,11. Преимущества PAFC по сравнению с традиционными методами цитометрии потока включают простоту, простоту перевода в клинические условия, и обнаружение CtCs на беспрецедентных глубинах в образцах пациента12,13. Недавние исследования использовали системы PAFC для обнаружения клеток с использованием эндогенного и экзогенного контраста14,15. Ближайшие инфракрасные (NIR) светопоглощающие контрастные вещества, такие как индоцианин зеленый краситель, и металлические NPs (например, золото и CuS) были использованы для селективной маркировки клеток и тканей в сочетании с фотоакустической визуализации16,17,18. Благодаря улучшенной глубине проникновения NIR света в биологических тканях, фотоакустическое обнаружение амортизаторов может быть выполнено на больших глубинах для клинического применения. Из-за своего большого потенциала для использования в клинике, сочетание целевых NIR контрастных агентов с PAFC вызвало значительный интерес для обнаружения КТК.
PAFC в сочетании с целевыми контрастными агентами обеспечивает улучшенный подход к высокопроходимым анализам образцов пациентов с повышенной точностью и целенаправленным обнаружением КТК. Одной из основных стратегий обнаружения КТК является специфическая таргетинг мембранных белков, присутствующих на клетке интереса. Одной из примечательных характеристик КТК яичников является переэкспрессия рецепторов фолиевой кислоты, расположенных на их внешней мембране19. Таргетинг фолиевой рецептор является идеальной стратегией для выявления КТК яичников в крови, потому что эндогенные клетки, которые имеют более высокое выражение рецепторов фолиевой кислоты, как правило, светятся и имеют ограниченное воздействие кровотока20. Медь сульфидНых NPs (CuS NPs) недавно были признаны за их способность целевой фолиевой рецепторов, выраженных на раковых клетках21. В сочетании с их биосовместимостью, простотой синтеза и поглощением глубоко в NIR, эти контрастные агенты NP делают идеальную стратегию таргетинга для обнаружения КТК яичников с использованием PAFC.
Эта работа описывает подготовку FA-CuS NPs и их использование для обнаружения раковых клеток яичников в фотоакустической системе потока. CuS NPs модифицируются с фолиевой кислотой, чтобы специально целевой Яичников CTCs и излучают фотоакустический сигнал, когда стимулируется с 1053 нм лазера. Результаты свидетельствуют об успешном обнаружении раковых клеток яичников, инкубированных с помощью этих фотоакустических контрастных агентов в системе PAFC. Эти результаты показывают обнаружение раковых клеток яичников вплоть до концентрации 1 клетки / Л, и флуоресценция микроскопии подтверждает успешное поглощение этих частиц SKOV-3 раковых клеток яичников22. Эта работа содержит подробное описание синтеза ФА-Кус-НП, подготовки образцов для флуоресценции, построения фотоакустической системы потока, а также фотоакустического обнаружения раковых клеток яичников. Представленный метод показывает успешную идентификацию КТК яичников в потоке с использованием FA-CuS NPs. Будущая работа будет сосредоточена на клиническом применении этой технологии в целях раннего выявления метастазов рака яичников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез и функционализация наночастиц
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез FA-CuS NPs достигается с помощью одного метода синтеза горшка, адаптированного из ранее опубликованного протокола21.
ВНИМАНИЕ: Весь синтез должен происходить в вентилируемом химическом капоте дыма.
- Перед синтезом процедите около 300 мл деионированной (DI) воды, хотя и стерильный фильтр 0,2 мкм.
- Очистите стеклянную круглую нижнюю колбу 250 мл с моющим раствором и промойте водой DI. Добавьте 0,0134 г CuCl2 в 100 мл воды DI, чтобы создать раствор 1 мМ.
- Добавьте 0,015 г фолиевой кислоты (FA) в раствор CuCl2 и перемешайте в течение 5 минут с помощью магнитной панели перемешивания.
- Добавьте Na2S'9H2O (0,024 г в 100 л DI воды) в течение примерно 10 с в реакционную смесь, используя пипетку 200 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления Na2S'9H2O, решение изменит цвет от светло-желтого до темно-коричневого. - Cap реакции и место в масляной ванне, установить до 90 градусов по Цельсию, и продолжать перемешивание с магнитной панели перемешать. Примерно через 15 минут, или когда масляная ванна достигла 85-90 градусов по Цельсию, позвольте реакции продолжиться в течение дополнительного часа. Ваша смесь должна постепенно превращаться в темно-зеленый цвет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы вентиляционные системы при нагревании реакции смеси, чтобы избежать давления накопления. - Удалите реакционный сосуд из масляной ванны и кратко охладьте при комнатной температуре примерно 10-15 мин, прежде чем перейти в ледяную ванну.
- После того, как реакция смесь остыла ниже 20 градусов по Цельсию, настроить рН до 10 с использованием 1M NaOH, чтобы растворить оставшиеся фолиевой кислоты в раствор.
- Очистите реакционную смесь FA-CuS с помощью колонки центрифугации 30 kDa. Добавьте раствор в 15 мл партий в колонку и центрифуги на 3082 х г в течение 15 минут.
- После того, как вся реакционная смесь была сконцентрирована, рекомбинируйте концентрированные фракции и промойте 4x с 15 мл рН 10 NaOH в 30 kDa центрифугации колонки.
- Для измерения массы возьмите 1/3 раствора (66 л) и разделите на три стеклянных флакона. Высушите в вакуумной духовке на ночь при температуре 40 градусов Цельсия под вакуумом 27 мм рт. ст.
- Растворите остальные 2/3 концентрированного раствора в 250 Л ПБС и храните при 4 градусах Цельсия до дальнейшего использования.
- Перед использованием FA-CuS NPs, sonicate их в течение 30 минут в ванной звуковой на высокой обстановке.
2. Характеристика NP
- Выполните динамическое рассеяние света (DLS) Добавить 10 л концентрированной FA-CuS NPS в раствор pbS от шага 1.1.14 до 2 мл воды DI. До характеристики DLS, sonicate частиц в течение 30 минут в ванной звуковой на высокой настройки и фильтр через 0,2 мкм стерильный фильтр для удаления остаточной пыли.
- Выполните передачу электронной микроскопии (TEM) : Добавить 10 зл концентрированных FA-CuS NPS в растворе PBS к куску вощеной бумаги. Перевернуть медную сетку с покрытием в верхней части капли и дайте сесть на 2 мин. Коснитесь края сетки с покрытием formvar к листу фильтровальной бумаги, чтобы удалить лишнюю жидкость. Дайте воздуху высохнуть. Изображение медной сетки, используя электронный микроскоп при ускоренном напряжении 80 кВ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные результаты характеристики FA-CuS NPS представлены на рисунке 1.
3. Культура клеток
- Этот протокол использует ячейки SKOV-3. Если не указано иное, культура SKOV-3 клетки в 5A среде Маккой дополняется 10% FBS, 100 U/mL пенициллин, и 100 мкг /мл стрептомицина, и поддерживать на 37 градусов по Цельсию в увлажненных 5% CO2 инкубатора.
4. Флуоресцентные метки FA-CuS NPS для микроскопии
- Добавьте Техасско-красный-X секвинимиловский эфир (0,2 мг, растворенный в ДМСО с концентрацией 10 мг/мл) к раствору, содержащему 2 мг НП FA-CuS в 1 мл 0,1 М NaHCO3 (рН-9) буфера.
- Перемешать реакционную смесь с помощью магнитного перемешивания бар для 1 ч, вдали от света при комнатной температуре.
- Концентрируйте реакционную смесь в 4 мл 30 kDa MWCO центробежающей колонке, вращаясь при 4000 х г в течение 10 мин.
- Вымойте концентрированный раствор 3x с 4 мл 0,1 М NaHCO3 буфера (pH No 9) в колонке центрифугации. Впоследствии промойте концентрированный раствор 4 мл воды DI 3x или пока только следовое количество флуоресценции остается видимым в проточном путепуте с помощью УФ-VIS.
5. FA-CuS NPS Поглощение яичников раковых клеток
- До инкубации с FA-CuS NPs, инкубировать SKOV-3 клетки в колбе T75 с 8-15 мл фолиевой кислоты свободной RPMI-1640 средств массовой информации с 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин, по крайней мере 24 ч.
- Семенные клетки в 0,5 мл фолиево-кислотно-свободного RPMI-1640 полный рост средств при плотности 0,1 х 106 клеток / мл в 24 хорошо пластины.
- На следующий день, инкубировать клетки с 400 мкг/мл FA-CuS NPS в 0,5 мл фолиевой кислоты свободной RPMI-1640 полный рост средств для 2 ч.
- После этой инкубации, trypsinize клетки с 0,5 мл 0,25% трипсин с ЭДТА. Добавить по крайней мере 1 мл фолиевой кислоты свободной RPMI-1640 полный рост средств для нейтрализации трипсина, и центрифуга клеток на 123 х г в течение 6 мин.
- Удалите супернатант, resuspend клетки в 2 мл PBS, и центрифуга на 123 х г в течение 6 мин. Выполните этот шаг мытья 2x, чтобы удалить любые несвязанные NPs.
- Приготовьте клетки в 1,2 мл PBS с 2% Tween раствором.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и трипан синий. Далее разбавляют клетки, если количество клеток слишком высоко. Разбавить клетки в PBS с 2% Tween к выбранной концентрации для обнаружения.
- Ячейки теперь готовы к анализу системой PAFC.
6. Флуоресценция Микроскопия FA-CuS NPS поглощения
- Повторите шаги, перечисленные в шаге 5.1 и приступить к протоколу ниже для микроскопии.
- Семенные клетки при плотности 0,1 х 106 клеток/мл в 0,5 мл фолиево-кислотно-свободного RPMI-1640 полный рост носителя на стеклянных крышках в 24 хорошо пластины.
- На следующий день, инкубировать клетки с флуоресцентно помечены FA-CuS NPs в тройня, в концентрациях 100 мкг/мл, 200 мкг/мл, 300 мкг/мл, и 400 мкг/мл в 0,5 мл фолиевой кислоты свободной RPMI-1640 полный рост средств массовой информации.
- Инкубировать клетки с NPs для 2 ч в инкубаторе 37 кС
- После этого инкубационного периода, мыть клетки 3x с PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех шагов мыть, тщательно добавить раствор на стороне пластины хорошо, чтобы не беспокоить клетки. После добавления осторожно наклоните пластину и снимите раствор со стороны колодца. - Инкубировать клетки с 0,5 мл 3,7% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 минут и передать стеклянные крышки на новый 24 хорошо пластины.
ВНИМАНИЕ: ПФА является известным канцерогеном. У всех фиксации в вентилируемый химический дым капот и носить соответствующие средства индивидуальной защиты. - Инкубировать клетки в растворе 3,7% PFA с 0,1% Triton-X в PBS в течение 5 мин.
- Вымойте клетки с 0,5 мл PBS 3x в течение 5 минут каждый и передать крышки на новую пластину.
- Инкубировать клетки с 0,5 мл раствора PBS, содержащего DAPI (20 л/мл раствора запаса 0,5 мг/мл используется для окрашивания) в течение 5 мин, вдали от света.
- Вымойте клетки с PBS 3x.
- После окончательной стирки PBS, смонтировать крышки на слайдах с монтажом среды.
- Клетки теперь готовы к изображению флуоресценцией микроскопии. На рисунке 2 показан пример типичной клеточной характеристики флуоресценцией микроскопии.
7. Архитектура системпотока потока
- Конструкция камеры потока
ПРИМЕЧАНИЕ: SolidWorks файл 3D печатных поток танк можно найти в дополнительных материалов.- Используя предоставленный файл SolidWorks, 3D печать потока бакса с помощью термопластика ABS или PLA пластика. Размеры приведены ниже, если SolidWorks недоступен. На рисунке 3А показано представление этой модели. Корпус цистерны составляет 2,5 см х 1,5 см х 7,5 см. Дальние концы цистерны потока включают отверстия диаметром около 5 мм, позволяющие входить в трубку, содержащую капиллярную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цистерна потока имеет отверстие 1 см, перпендикулярно ориентации капиллярной трубки, для размещения ультразвукового преобразователя. Цилиндрическая экструзия с тем же внутренним диаметром, что и отверстие, простирается на 6 мм в бак. Для визуализации в режиме реального времени цистерна потока имеет слот 1 мм х 3 мм прямо под капиллярной трубкой. - После печати 3D-резервуара потока, очистить и собрать систему для использования.
- Поместите стекло крышки над 1 мм х 3 мм слот и 1 см отверстие в системе потока.
- Тщательно запечатайте с силиконом, чтобы предотвратить утечку.
- Приготовь капиллярную трубку в силиконовые вылеченные трубки. Вставьте трубки в камеру потока, хотя сторона цистерны потока такова, что стеклянная капиллярная трубка находится прямо над и перед 3 мм слот и 1 см отверстие.
- Печать трубки с помощью силикона, чтобы предотвратить утечку.
- Используя предоставленный файл SolidWorks, 3D печать потока бакса с помощью термопластика ABS или PLA пластика. Размеры приведены ниже, если SolidWorks недоступен. На рисунке 3А показано представление этой модели. Корпус цистерны составляет 2,5 см х 1,5 см х 7,5 см. Дальние концы цистерны потока включают отверстия диаметром около 5 мм, позволяющие входить в трубку, содержащую капиллярную трубку.
- Настройка системы фотоакустического потока
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3B и рисунке 3C показан пример архитектуры системы потока.- Подключите преобразователь к ультразвуковому импульсизатору/приемнику. Усиль сигнал с 59 дБ усиления.
- Подключите выход фильтра к многоцелевому перенастраиваемому осциллоскопу, оснащенный встроенным набором программируемых полевых ворот.
- Соедините одну из трубок, идущих из камеры потока, к Т-соединению, соединенному с двумя шприц-насосами на каждой ветке.
- Заполните один из шприц насосов с воздухом, а другой насос с образцом для анализа. Установите насос, содержащий воздух, на скорость потока 40 л/мин, и насос, содержащий образец, на скорость потока 20 л/мин. В результате двухфазный поток будет производить объемы выборки в размере 1 Зл. При такой скорости потока система будет тестировать примерно 6,4 образца в минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания последовательного распределения клеток, слегка вихрь каждого образца непосредственно перед тестированием. Кроме того, поверните шприц каждые несколько минут, чтобы предотвратить клетки от оседания в растворе. - Соедините оставшуюся трубку, выходя из системы потока, в контейнер с 10% отбеливателем, чтобы избавиться от клеток после выхода из системы потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем использовать систему потока, проверьте утечки, так как они могут повлиять на поток. Клетки должны содержаться в закрытой системе для поддержания биологической безопасности во время процедуры. - Конструкция 3D печатного бака позволяет последовательно и повторяемое выравнивание между преобразователем и лазерным светом с минимальной калибровкой. При правильном размещении в пользовательском баке, кварцевая капиллярная трубка гарантирует, что преобразователь и лазер напрямую выровнены.
- Поместите участок кварцевой капиллярной трубки в прямое соответствие с преобразователем, в поле зрения микроскопа, что позволяет тщательно ежся над образцом оптического волокна таким образом, чтобы оно освещало всю ширину трубки.
- Излучайте образец с помощью оптического волокна, направляющего диод-накачанный твердотельный лазер, работающий на длине волны 1053 нм. Инцидент с лазерным светом на образце и преобразователь, используемый для измерения фотоакустического эффекта, не сфокусированы.
- Энергия лазерного инцидента на образце составляет около 8 мДж, а скорость лазера 10 Гц достаточна для осветления каждого образца несколько раз при прохождении через систему.
- Поместите систему потока поверх перевернутого микроскопа и убедитесь, что как лазерный импульс, так и путь образца видны по мере того, как образец проходит через систему потока. Запись потока с помощью микроскопа установленной камеры.
- Запись ультразвуковых приобретений с использованием программного обеспечения для сбора данных (см. Таблица материалов). Триггер ультразвука и импульсного лазера с помощью FPGA. Используйте PBS с 2% Tween, и FA-CuS NPs в концентрации 100 мкг/мл в PBS 2% Tween, как отрицательный и положительный контроль, соответственно.
- Используя микроскоп-установленную камеру, записываете и стрельбу лазера и проход образцов, хотя система потока. Эти записи будут использованы для корреляции акустического сигнала, записанного преобразователем, с пуском лазера. Как образцы проходят перед стрельбой лазера, сигнал может быть коррелирован с результирующей фотоакустический сигнал для анализа. При частоте отбора проб 10 Гц, лазер будет освещать каждый штепсельную вилку несколько раз.
8. Постобработка
- Для каждого приобретения сигнала, s(t), вычислите преобразование Hilbert, H's(t) , для того чтобы создать аналитический сигнал.
- Создайте сложный конверт, se(t), вычисляя величину аналитического сигнала, таким образом, чтобы
интегрировать конверт для измерения общего сигнала, полученного в результате каждого приобретения. Сравните сигналы от каждой тестовой группы (т.е. PBS, помеченные ячейки, FA-CuS NPs, только клетки), используя t-тест в программном обеспечении R статистического. Сырые фотоакустические сигналы и их преобразования Гильберта представлены на рисунке 4. - Для восстановления изображения нормализовать сложный конверт на основе максимального пика по всему бегу. При сравнении серии запусков нормализуйте сложный конверт, используя максимальный пик всей серии. После нормализации конвертировать каждое приобретение в ряд значений пикселей. Представляем каждую серию значений пикселей в качестве столбца в реконструкции изображения. Репрезентативные реактивы PBS и сигналов FA-CuS NPs показаны на рисунке 5,где оба изображения были нормализованы с использованием максимального пика на обоих трассах.
интегрировать конверт для измерения общего сигнала, полученного в результате каждого приобретения. Сравните сигналы от каждой тестовой группы (т.е. PBS, помеченные ячейки, FA-CuS NPs, только клетки), используя t-тест в программном обеспечении R статистического. Сырые фотоакустические сигналы и их преобразования Гильберта представлены на рисунке 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1А показано типичное изображение TEM синтезированных наночастиц. Средний размер типичной наночастицы составляет примерно 8,6 нм и 2,5 нм. Измерение наночастиц проводилось в ImageJ. Для разделения частиц для измерения применялись пороговые и водораздельные функции. Горизонтальные и вертикальные диаметры каждой частицы измерялись перпендикулярно друг другу и далее усреднели. Для DLS репрезентативное измерение показано на рисунке 1B. Средний гидродинамический диаметр этих частиц составляет 73,6 нм. Наночастицы сульфида меди имеют характерную кривую абсорбции, которая простирается в NIR, как показано на рисунке 1C. Существует небольшой артефакт около 850 нм, который был вызван переключением лазеров спектрофотометром.
Флуоресцентные микроскопии изображения клеток, инкубированных флуоресцентно помеченными наночастицами, можно увидеть на рисунке 2. Поглощение наночастиц может быть визуализировано наличием флуоресценции по всей клетке. Клетки, не инкубированные наночастицами, не показывают сигнала флуоресценции. Наличие этого сигнала флуоресценции указывает на успешное поглощение частиц и их способность обнаруживаться в системе потока.
На рисунке 3 показана общая настройка фотоакустической системы потока. На рисунке 3А показана подробная модель 3D-камеры потока. Эта камера может быть напечатана с использованием файла .stl, предоставленного этим протоколом. На рисунке 3B показан обзор установки цистерны потока. На рисунке 3C показана общая настройка резервуара потока и системы сбора данных.
Типичные сигналы получения данных отображаются на рисунке 4. Необработанные данные указывают на различия в сигнале между наночастицами помеченных клеток, PBS, и FA-CuS NPs. Приобретение – это полученный фотоакустический сигнал, генерируемый одним лазерным импульсом. Из-за быстрой скорости стрельбы лазера, каждый анализируемый образец генерирует несколько приобретений. Конверт для каждого отдельного приобретения был создан с помощью преобразования Hilbert. Эта оболочка была интегрирована для измерения общего количества сигнала, генерируемого лазерным импульсом. В предыдущем исследовании, эти данные были проанализированы с помощью R статистического программного обеспечения, где число приобретений проанализированы для t-тест были 203, 150, 160, и 131, для ячеек с НП, клетки только, PBS, и НП в одиночку, соответственно22. Данные были нормализованы путем преобразования журнала и сравнили с использованием T-теста Уэлча в R. Сигналы, полученные только от НП FA-CuS в концентрации 100 мкг/мл, показали гораздо более высокий сигнал, чем отрицательный контроль. Разница в сигналах между отрицательным контролем и помеченными КТК яичников были более тонкими, чем положительный контроль, но может быть обнаружена путем анализа их средств t-тест22.
Используя пользовательское программное обеспечение LabView и MATLAB, были сделаны реконструкции изображений из положительного и отрицательного контроля в режиме реального времени и после приобретения, соответственно. Для создания фотоакустических реконструкций, конверт каждого приобретения был рассчитан с помощью преобразования Гильберта. Отдельные конверты впоследствии были преобразованы в значения пикселей и отображаться как независимые столбцы. Явные различия в фотоакустическом сигнале возникают между НП FA-CuS в концентрации 100 мкг/мл и образцом PBS(рисунок 5). Элементы управления для системы важны для запуска, чтобы гарантировать, что система адекватно производит фотоакустический сигнал, который может быть обнаружен преобразователем.
Рисунок 1: Характеристика представителя NP. (A) TEM изображение синтезированных FA-CuS NPs. Шкала бар 50 нм. (B) Представитель DLS интенсивность распределения синтезированных FA-CuS NPs. (C) Представитель FA-CuS NPs абсорбции кривой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель флуоресценции микроскопических изображений клеток SKOV-3. Клетки были инкубированы с и без 400 мкг /мЛ флуоресцентно помечены NPs. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения системы цитометрии фотоакустического потока и камеры потока. (A) Детальный вид 3D печатной камеры потока. (B) Диаграмма системы PAFC. (C) Архитектура системы потока: SP - шприц насос; ДАЗ/ФPGA - набор программируемых ворот данных/полевая программа; Обь - объективная линза; OF - оптическое волокно; ФК и клетчатка парной; UT - ультразвуковой трансдукатор; FT и цистерна потока. Эта цифра адаптирована из Lusk et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель необработанного сигнала данных и Гильберт преобразует образцы, протестированные в системе потока. (A) Представитель необработанных данных сигнала от PBS и клеток инкубируется с NPs и (D) Гильберт преобразования данных. (B) Представитель необработанных данных сигнала из клеток в одиночку и клетки инкубируются с FA-CuS NPs и (E) Гильберт преобразования данных. (C) Представитель необработанных данных сигнала от PBS и 100 мкг /мЛ FA-CuS NPs и (F) Гильберт преобразования данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Репрезентативные фотоакустические изображения фотоакустических данных. (A)Реконструкция изображения 100 мкг/мЛ FA-CuS NPs и (B) PBS, протестированная в рамках системы потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Поток камеры STL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол является простым методом обнаружения КТК яичников с использованием PAFC и целевого контрастного агента CuS. Многие методы были изучены для обнаружения КТК яичников, в том числе микрофлюидных устройств, RT-PCR, и флуоресценции потока цитометрии23,24,25. Они варьируются по сложности, стоимости и точности, ограничивая их эффективность в клинических условиях. PAFC вводит ряд преимуществ по сравнению с этими традиционными методами обнаружения КТК, включая возможность обнаружения КТК в образцах пациентов, и его простоту перевода в приложения in vivo. PAFC также было показано, точно обнаружить CTCs в пробирке и in vivo в сочетании с целевыми контрастными агентами26,27.
В этой работе контрастные агенты FA-CuS NP были оценены на предмет их способности повысить точность обнаружения КТС в физиологически значимых концентрациях. Исследования проводились с использованием изолированных клеток SKOV-3, повторно подвешенных в PBS. Анализ флуоресценции микроскопии показал успешное поглощение этих частиц. Результаты обнаружили SKOV-3 клеток до концентрации 1 клетки / ЛЛ 22. Решающие шаги в этом протоколе включают синтез наночастиц и выравнивание установки фотоакустического потока. Во время синтеза наночастиц, важно, чтобы убедиться, что решение получило темно-зеленый цвет, прежде чем удалить смесь из масляной ванны. Для системы потока, работает отрицательный и положительный контроль, хотя система до тестирования образца необходимо обеспечить, чтобы система производит адекватный фотоакустический сигнал для последующего обнаружения помеченных клеток. Во время запуска системы потока, важно, чтобы убедиться, что свет инцидента от волоконно-оптических полностью освещает капиллярную трубку, и что преобразователь уютно против стороны потока камеры. Наконец, тщательное тестирование системы на наличие утечек необходимо для обеспечения биологической безопасности системы и последовательного потока через камеру.
Что касается существующей системы PAFC, то предварительные исследования подтвердили фотоакустическое обнаружение с помощью системы преобразователя и усиления. Большинство из этих сигналов состояли из сигналов более низкой частоты (0/20 МГц). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить, является ли это связано с фактической частотой генерируемых фотоакустических сигналов или пропускной способностью 35 МГц усилителя. Будущие исследования будут исследовать частотные компоненты обнаруженных сигналов в целях оптимизации центральной частоты преобразователя, а также пропускной способности системы усиления. Нынешняя система специально подходит для обнаружения экс-vivo КТК. Тем не менее, этот метод определяет потенциал для будущего применения FA-CuS NPs in vivo.
Будущие исследования направлены на выявление раковых клеток яичников в смешанных культурах, клинических образцов человека, и in vivo модели28,29,30. Кроме того, в будущих исследованиях будет изучена специфика этих наночастиц по сравнению с нецелевым контролем. Будущая проверка этого метода будет включать тестирование этого инструмента с клиническими образцами человека, внедрение высокопроизводительных испытаний и анализа, а также перевод в клинические условия. Этот фотоакустический метод показывает потенциал для будущего перевода на широкий спектр клинических применений и заболеваний по целому ряду контрастных агентов и анализов. Фотоакустическое обнаружение анализов, используя PAFC, может сделать обнаружение точек оказания медицинской помощи КТК и других патогенных микроорганизмов более быстрым и недорогим.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Мадлен Хауэлл за ее помощь в синтезе, Мэтью Сундук за его помощь в проектировании системы потока, и Итан Маршал за помощь с SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
