Summary
يتم تقديم بروتوكول للكشف عن الخلايا السرطانية المبيضة المتداولة باستخدام نظام تدفق الصوتية التصويرية حسب العرف والمستهدفة النانويه كبريتيد النحاس المغطي بحمض الفوليك.
Abstract
تشير العديد من الدراسات إلى ان تعداد الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) قد يظهر الوعد كاداه نذيره لسرطان المبيض. وتشمل الاستراتيجيات الحالية للكشف عن ctcs التدفق الخلوي ، والاجهزه ميكروفلويديك ، وفي الوقت الحقيقي تفاعل البلمره سلسله (RT-PCR). علي الرغم من التطورات الاخيره ، وأساليب للكشف عن سرطان المبيض المبكر الانبثاث لا تزال تفتقر إلى الحساسية والخصوصية المطلوبة للترجمة السريرية. هنا ، يتم تقديم طريقه جديده للكشف عن الخلايا السرطانية المنتشرة في المبيض عن طريق التدفق الصوتي الضوئي للخلايا (الاتحاد الاسيوي لكره القدم) باستخدام نظام طباعه ثلاثي الابعاد (3D) مخصص ، بما في ذلك غرفه التدفق ومضخة المحاقن. تستخدم هذه الطريقة جزيئات كبريتيد النحاس المغطية بحمض الفوليك لاستهداف خلايا سرطان المبيض من قبل الاتحاد الاسيوي للسرطان. يوضح هذا العمل تقارب عوامل التباين هذه لخلايا سرطان المبيض. تظهر النتائج توصيف NP ، والكشف عن الاتحاد الاسيوي لكره اليد ، وامتصاص NP عن طريق المجهر الفلوري ، مما يدل علي امكانيه هذا النظام الجديد للكشف عن CTCs المبيض في تركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Introduction
سرطان المبيض هو واحد من الأورام الخبيثة الامراض النسائية الأكثر فتكا ، وأسفرت عن وفيات يقدر 184,800 في جميع انحاء العالم في 20181. وقد أظهرت دراسات متعددة العلاقة بين تطور سرطان المبيض (اي, الانبثاث) ووجود ctcs2,3,4. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن وعزل CTCs يستخدم نظام Cellsearch ، الذي يستهدف مستقبلات EpCam5. Epcam التعبير ، ومع ذلك ، هو دوونريجولاتيد في ظهاري للانتقال المستوي ، الذي كان متورطا في السرطان الانبثاث6. وعلي الرغم من التقدم المحرز ، لا تزال التكنولوجيات السريرية الحالية تعاني من انخفاض الدقة وارتفاع التكلفة والتعقيد. ونظرا لهذه العيوب ، أصبحت التكنولوجيات الجديدة لاكتشاف وتعداد CTCs المبيض مجالا هاما للبحوث.
في الاونه الاخيره ، برزت الاتحاد كطريقه فعاله للكشف عن الخلايا السرطانية غير الغازية ، وتحليل المواد النانويه ، وتحديد البكتيريا7،8،9. يختلف الاتحاد الاسيوي لكره اليد عن التدفق الخلوي التقليدي عن طريق الكشف عن التحاليل في التدفق باستخدام الصوتيات الضوئية. يتم إنشاء تاثير الصوتية الضوئية عندما يتم امتصاص ضوء الليزر من قبل المواد التي تسبب التمدد الحراري ، وإنتاج موجه الصوتية التي يمكن الكشف عنها بواسطة محول الموجات فوق الصوتية10،11. وتشمل مزايا الاتحاد علي أساليب التدفق الخلوي التقليدية البساطة ، وسهوله الترجمة إلى الإعدادات السريرية ، والكشف عن ctcs في أعماق لم يسبق لها مثيل في عينات المريض12،13. وقد استخدمت الدراسات الحديثة أنظمه الاتحاد للكشف عن الخلايا باستخدام التباين الداخلي والخارجي14،15. بالقرب من الاشعه تحت الحمراء (نير) وقد استخدمت عوامل التباين امتصاص الضوء مثل الصبغة الخضراء ، والمعادن NPs (مثل الذهب والجمارك) لوضع العلامات الانتقائية من الخلايا والانسجه في تركيبه مع التصوير الصوتي التصويري16،17،18. نظرا لتحسن عمق تغلغل ضوء نير داخل الانسجه البيولوجية ، يمكن اجراء الكشف الصوتي الضوئي لامتصاص في أعماق أكبر للتطبيقات السريرية. ونظرا لإمكاناتها الكبيرة للاستخدام في العيادة ، فان الجمع بين عوامل التباين المستهدفة مع الاتحاد الاسيوي لكره القد ولد اهتماما كبيرا بالكشف عن هذه التحويلات.
ويوفر الاتحاد بالاشتراك مع عوامل التباين المستهدفة نهجا محسنا للتحليل العالي الإنتاجي لعينات المريض بدقه معززه والكشف المستهدف لctcs. وتتمثل أحدي استراتيجيات الكشف الرئيسية لهذه التحويلات في الاستهداف المحدد للبروتينات الغشائية الموجودة في خليه الفائدة. واحده من السمات البارزة لctcs المبيض هو التعبير المفرط من مستقبلات حمض الفوليك الموجودة علي الغشاء الخارجي لها19. استهداف مستقبلات حمض الفوليك هو استراتيجية مثاليه لتحديد CTCs المبيض في الدم لان الخلايا الذاتية, التي لديها اعلي تعبير عن مستقبلات حمض الفوليك, عموما الاناره ولها التعرض محدوده لمجري الدم20. وقد تم مؤخرا التعرف علي كبريتيد النحاس NPs (CuS NPs) لقدرتها علي استهداف مستقبلات حمض الفوليك التي أعرب عنها في الخلايا السرطانية21. بالاضافه إلى توافقها الحيوي ، وسهوله التوليف ، والامتصاص العميق في تقرير الجرد العام ، فان عوامل التباين NP هذه تجعل استراتيجية الاستهداف المثالية للكشف عن CTCs المبيض باستخدام الاتحاد الاسيوي.
يصف هذا العمل اعداد الاتحاد العام لكره القد واستخدامها للكشف عن خلايا سرطان المبيض في نظام تدفق الصوتية الضوئية. يتم تعديل المصادر الخاصة بحمض الفوليك لاستهداف CTCs المبيض علي وجه التحديد وتنبعث منها اشاره صوتيه ضوئيه عند تحفيزها باستخدام ليزر 1,053 nm. تشير النتائج إلى الاكتشاف الناجح لخلايا سرطان المبيض التي تم احتضانها باستخدام عوامل التباين الصوتية الضوئية داخل نظام الاتحاد الاسيوي للسرطان. تظهر هذه النتائج الكشف عن خلايا سرطان المبيض وصولا إلى تركيزات 1 خليه/μL ، والمجهر الفلوري يؤكد الامتصاص الناجح لهذه الجزيئات من قبل الخلايا السرطانية المبيضية-3 المبيض22. يوفر هذا العمل وصفا مفصلا لتوليف الاتحاد النقدي الخاص-CuS إلى NPs ، واعداد عينات لفحص المجهر الفلوري ، وبناء نظام التدفق الصوتي الضوئي ، والكشف الصوتي الضوئي لخلايا سرطان المبيض. تظهر الطريقة المعروضة التعرف الناجح علي CTCs المبيض في التدفق باستخدام الاتحاد النقدي الخاص-CuS إلى NPs. وسوف تركز الاعمال المستقبلية علي التطبيق السريري لهذه التكنولوجيا نحو الكشف المبكر عن سرطان المبيض الانبثاث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جسيمات متناهي التوليف والوظيفية
ملاحظه: يتم تحقيق التوليف من الاتحاد الكره التي-CuS NPs باستخدام طريقه واحده التوليف وعاء مقتبس من بروتوكول21نشرت سابقا.
تحذير: يجب ان يحدث كل التوليف في غطاء الدخان الكيميائي التهوية.
- قبل التوليف ، وتصفيه ما يقرب من 300 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) علي الرغم من فلتر معقم 0.2 μm.
- تنظيف قارورة الزجاج المستديرة 250 mL مع محلول المنظفات وشطف مع المياه DI. أضافه 0.0134 غرام من CuCl2 إلى 100 مل من المياه دي لخلق حل 1 ملم.
- أضافه 0.015 غرام من حمض الفوليك (FA) إلى الحل CuCl2 ويحرك ل ~ 5 دقيقه باستخدام شريط تحريك المغناطيسي.
- أضف Na2s · 9h2O (0.024 g في 100 μl DI الماء) علي مدي حوالي 10 ثانيه إلى خليط التفاعل باستخدام ماصه 200 μl.
ملاحظه: بناء علي أضافه Na2S · 9h2س ، فان الحل تغيير اللون من الأصفر الفاتح إلى البني الداكن. - غطاء رد الفعل ومكان في حمام الزيت ، وتعيين إلى 90 درجه مئوية ، ومواصله التحريك مع شريط تحريك المغناطيسي. بعد حوالي 15 دقيقه ، أو عندما يكون حمام الزيت قد وصلت 85 − 90 درجه مئوية ، والسماح للرد علي المضي قدما لمده ساعة اضافيه. الخليط الخاص بك يجب ان تتحول تدريجيا إلى اللون الأخضر الداكن.
ملاحظه: تاكد من تنفيس النظام اثناء تسخين خليط التفاعل لتجنب تراكم الضغط. - أزاله وعاء التفاعل من حمام الزيت وتبرد لفتره وجيزة في درجه حرارة الغرفة لمده 10 إلى 15 دقيقه تقريبا قبل نقل إلى حمام الجليد.
- بمجرد ان يبرد خليط التفاعل اقل من 20 درجه مئوية ، اضبط الحموضة إلى 10 باستخدام 1M NaOH لأذابه حمض الفوليك المتبقي في محلول.
- تنقيه خليط التفاعل من اتحاد كره القد باستخدام عمود طرد 30 ده. أضافه حل في 15 مل دفعات إلى العمود والطرد المركزي في 3,082 x g لمده 15 دقيقه.
- مره واحده وقد تم تركيز كل من خليط التفاعل ، وأعاده الجمع بين الكسور المركزة وغسل 4x مع 15 مل من الأس الهيدروجيني 10 NaOH في طرد العمود 30 ده.
- للقياسات الجماعية ، خذ 1/3 من المحلول (~ 66 μL) وانقسم إلى ثلاث قوارير زجاجيه. تجف في فرن فراغ بين عشيه وضحيها في 40 درجه مئوية تحت فراغ من ~ 27 زئبق.
- ذوبت ال أخرى 2/3 من يركز حل داخل 250 μL من [ببس] وخزنت في 4 [ك] حتى استعمال بعيده.
- قبل الاستفادة من الاتحاد العام للسيارات-CuS إلى NPs ، والنسخ لهم لمده 30 دقيقه في sonicator حمام علي اعداد عاليه.
2. توصيف NP
- أداء تشتت الضوء الديناميكي (DLS) أضافه 10 μL من مركز الاتحاد الكونغولي لمصادر القوي الخاصة NPS في حل التلفزيونية من الخطوة 1.1.14 إلى 2 مل من المياه DI. قبل التوصيف من قبل DLS ، والجزيئات لمده 30 دقيقه في sonicator حمام علي اعداد عاليه وتصفيه من خلال فلتر معقم 0.2 μm لأزاله الغبار المتبقية.
- اجراء المجهر الكترون الإرسال (TEM): أضافه 10 μL من المركزة الاتحاد العام للبث المصادر الخاصة NPS في حل تلفزيوني إلى قطعه من ورق الشمع. عكس الشبكة النحاسية المغلفة formvar علي الجزء العلوي من الحبريه والسماح للجلوس لمده 2 دقيقه. المس حافه الشبكة المغلفة formvar إلى قطعه من ورق الترشيح لأزاله السوائل الزائدة. اترك الهواء يجف. صوره الشبكة النحاسية باستخدام مجهر الكترون في الجهد المتسارع من 80 kV.
ملاحظه: يتم عرض النتائج النموذجية لتوصيف الاتحاد المذكور في الشكل 1.
3. ثقافة الخلية
- يستخدم هذا البروتوكول الخلايا الثلاثة. ما لم يذكر خلاف ذلك ، الثقافة كوف-3 الخلايا في مكوي 5A المتوسطة التي تستكمل مع 10 ٪ ، 100 U/mL البنسلين ، و 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين ، والحفاظ علي 37 درجه مئوية في ترطيب 5 ٪ CO2 حاضنه.
4. العلامات الفلورية من الاتحاد الكره التي-CuS NPS لمجهر
- أضافه استر تكساس-الأحمر-X (0.2 ملغ الذائبة في DMSO في تركيز 10 مغ/مل) إلى حل يحتوي علي 2 ملغ من الاتحاد العام لكره الاذن والجمارك في 1 مل من 0.1 م ناهكو3 (pH ~ 9) العازلة.
- يحرك خليط التفاعل باستخدام شريط التحريك المغناطيسي لمده 1 ساعة ، بعيدا عن الضوء في درجه حرارة الغرفة.
- تركيز الخليط التفاعل في 4 مل 30 طرد العمود MWCO بالغزل في 4,000 x g لمده 10 دقيقه.
- اغسل المحلول المركز 3x مع 4 مل من 0.1 م ناهكو3 العازلة (pH ~ 9) في عمود طرد. في وقت لاحق ، وغسل المحلول المركز مع 4 مل من المياه DI 3x أو حتى لا يبقي سوي كميه ضئيله من الفلورية مرئية في flowthrough الاشعه فوق البنفسجية-VIS.
5. امتصاص NPS من قبل خلايا سرطان المبيض
- قبل الاحتضان مع الاتحاد العام لكره اليد-CuS NPs ، احتضان الخلايا كوف-3 في قارورة T75 مع 8 − 15 مل من حمض الفوليك-1640 وسائل الاعلام الحرة RPMI مع 10 ٪ والبنسلين 1 ٪/ستربتوميسين لمده 24 ساعة علي الأقل.
- خلايا البذور في 0.5 mL من حمض الفوليك-1640 النمو الكامل وسائل الاعلام في كثافة 0.1 x 106 خلايا/مل في لوحه 24 جيدا.
- في اليوم التالي ، احتضان الخلايا مع 400 ميكروغرام/مل من الاتحاد الكونغولي للاعلام NPS في 0.5 mL من حمض الفوليك-1640 النمو الكامل وسائل الاعلام للنمو 2 ح.
- بعد هذه الحضانة ، التريسينايز الخلايا مع 0.5 مل من 0.25 ٪ التريبسين مع أدتا. أضافه ما لا يقل عن 1 مل من حمض الفوليك-1640 النمو الكامل وسائل الاعلام لتحييد التريبسين, والطرد المركزي الخلايا في 123 x ز ل 6 دقيقه.
- أزاله supernatant ، أعاده التعليق الخلايا في 2 مل من تلفزيوني ، وأجهزه الطرد المركزي في 123 x g ل 6 دقيقه. تنفيذ هذه الخطوة يغسل 2x لأزاله اي NPs غير منضم.
- أعاده تعليق الخلايا في 1 − 2 مل من التلفزيونية مع 2 ٪ حل توين.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية والأزرق التريبين. المزيد من الخلايا المخففة إذا كان عدد الخلايا مرتفعا جدا. تمييع الخلايا في الاذاعه التلفزيونية مع 2 ٪ توين للتركيز المختار للكشف.
- الخلايا جاهزه الآن ليتم تحليلها من قبل نظام الاتحاد الاسيوي لكره اليد.
6. المجهر الفلوري من الاتحاد الكره التي-CuS NPS امتصاص
- كرر الخطوات المذكورة في الخطوة 5.1 والمضي قدما مع البروتوكول أدناه لمجهر.
- خلايا البذور في كثافة 0.1 × 106 خلايا/مل في 0.5 مل من حمض الفوليك-1640 النمو الكامل للوسائط الاعلاميه علي الزجاج coverslips في 24 لوحه جيدا.
- في اليوم التالي ، احتضان الخلايا مع فلوريسسينتلي الموسومة الاتحاد الكونغولي لكره اليد-CuS NPs في ثلاث نسخ ، في تركيزات من 100 ميكروغرام/مل ، 200 ميكروغرام/مل ، 300 ميكروغرام/مل ، و 400 ميكروغرام/مل في 0.5 mL من حمض الفوليك--1640 النمو الكامل وسائل الاعلام.
- احتضان الخلايا مع NPs ل 2 ح في 37 درجه مئوية حاضنه
- بعد فتره الحضانة هذه ، اغسل الخلايا 3x مع تلفزيوني.
ملاحظه: بالنسبة لجميع الخطوات يغسل ، بعناية أضافه الحل علي جانب لوحه جيدا لعدم إزعاج الخلايا. بعد الاضافه ، أماله بعناية لوحه وسحب الحل من جانب البئر. - احتضان الخلايا مع 0.5 مل من 3.7 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في التلفزيونية الخاصة لمده 15 دقيقه ونقل الزجاج coverslips إلى لوحه جديده 24 جيدا.
تحذير: PFA هو مسرطن معروف. القيام بكل تثبيت في غطاء الدخان الكيميائي التهوية وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. - احتضان الخلايا في حل 3.7 ٪ PFA مع 0.1 ٪ تريتون-X في الاذاعه التلفزيونية لمده 5 دقائق.
- غسل الخلايا مع 0.5 مل من تلفزيوني 3x لمده 5 دقائق لكل منهما ونقل الشفتين إلى لوحه جديده.
- احتضان الخلايا مع 0.5 mL من محلول تلفزيوني يحتوي علي DAPI (20 μL/مل من 0.5 mg/mL حل الأسهم يستخدم لتلطيخ) لمده 5 دقائق ، بعيدا عن الضوء.
- غسل الخلايا مع تلفزيوني 3x.
- بعد غسل تلفزيوني النهائي ، جبل الشفتين علي الشرائح مع تصاعد المتوسطة.
- الخلايا جاهزه الآن ليتم التصوير بواسطة المجهر الفلوري. ويبين الشكل 2 مثالا لتوصيف الخلية النموذجية بواسطة المجهر الفلوري.
7. نظام التدفق المعماري
- بناء غرفه التدفق
ملاحظه: يمكن العثور علي ملف سوليدووركس من خزان تدفق المطبوعة 3D في المواد التكميلية.- باستخدام الملف سوليدووركس المقدمة ، طباعه 3D خزان تدفق باستخدام ABS بالحرارة أو البلاستيك PLA. يتم توفير الابعاد أدناه إذا كان سوليدووركس غير متوفر. ويبين الشكل 3(ا ) تمثيلا لهذا النموذج. الجسم من خزان تدفق هو 2.5 سم × 1.5 سم × 7.5 سم. وتشمل نهايات بعيده من خزان تدفق ثقوب ما يقرب من 5 ملم في القطر للسماح لدخول الأنابيب التي تحتوي علي أنبوب الشعرية.
ملاحظه: خزان تدفق لديه ثقب 1 سم ، عمودي علي اتجاه أنبوب الشعرية ، لوضع محول الموجات فوق الصوتية. نتوء أسطواني مع نفس القطر الداخلي لثقب يمتد 6 ملم في الخزان. النسبة للتصوير في الوقت الحقيقي ، فان خزان التدفق يحتوي علي فتحه بحجم 1 مم × 3 مم تحت الأنبوب الشعري مباشره. - بعد طباعه خزان تدفق 3D ، وتنظيف وتجميع النظام للاستخدام.
- ضع الشفتين الزجاجيتين علي فتحه 1 مم × 3 مم وفتحه 1 سم في نظام التدفق.
- ختم بعناية مع السيليكون لمنع التسرب.
- تناسب أنبوب الشعرية في أنابيب الشفاء من السيليكون. ادخل الأنابيب في غرفه التدفق علي الرغم من ان الجانب من خزان تدفق بحيث أنبوب الشعرية الزجاج هو فوق مباشره وامام فتحه 3 ملم وثقب 1 سم.
- ختم الأنابيب باستخدام السيليكون لمنع التسرب.
- باستخدام الملف سوليدووركس المقدمة ، طباعه 3D خزان تدفق باستخدام ABS بالحرارة أو البلاستيك PLA. يتم توفير الابعاد أدناه إذا كان سوليدووركس غير متوفر. ويبين الشكل 3(ا ) تمثيلا لهذا النموذج. الجسم من خزان تدفق هو 2.5 سم × 1.5 سم × 7.5 سم. وتشمل نهايات بعيده من خزان تدفق ثقوب ما يقرب من 5 ملم في القطر للسماح لدخول الأنابيب التي تحتوي علي أنبوب الشعرية.
- اعداد نظام التدفق الصوتي الضوئي
ملاحظه: الشكل 3B والشكل 3C إظهار مثال عن بنيه نظام التدفق.- توصيل محول إلى الموجات فوق الصوتية pulser/المتلقي. تضخيم الاشاره مع مكسب dB 59.
- قم بتوصيل مخرجات الفلتر بمنظار الذبذبات القابل للتكوين متعدد الأغراض والمجهز بمصفوفة بوابه قابله للبرمجة في الحقل المدمج.
- ربط واحده من الأنابيب القادمة من غرفه تدفق إلى تقاطع T ، متصلا اثنين من مضخات حقنه في كل فرع.
- ملء واحده من مضخات حقنه مع الهواء ومضخة أخرى مع العينة ليتم تحليلها. تعيين مضخة تحتوي علي الهواء إلى معدل تدفق 40 μL/min والمضخة التي تحتوي علي عينه إلى معدل تدفق 20 μL/min. سينتج عن التدفق الناتج علي مرحلتين وحدات تخزين عينه من 1 μL. وفي معدل التدفق هذا ، سيختبر النظام حوالي 6.4 عينه في الدقيقة.
ملاحظه: للحفاظ علي توزيع متناسق من الخلايا ، الدوامة بخفه كل عينه مباشره قبل اختبارها. الاضافه إلى ذلك ، تدوير حقنه كل بضع دقائق من أجل منع الخلايا من تسويه في الحل. - توصيل الأنبوب المتبقي الخروج من نظام تدفق إلى حاويه مع 10 ٪ التبييض ، للتخلص من الخلايا بعد ان الخروج من نظام التدفق.
ملاحظه: قبل الاستفادة من نظام التدفق ، والتحقق من وجود تسرب ، لان هذه يمكن ان تؤثر علي تدفق. يجب ان تكون الخلايا الموجودة داخل نظام مغلق للحفاظ علي السلامة البيولوجية اثناء العملية. - تصميم خزان 3D المطبوعة يسمح لمحاذاة متسقة وقابله للتكرار بين محول وضوء الليزر مع الحد الأدنى من المعايرة. عندما وضعت بشكل صحيح داخل خزان مخصص ، وأنبوب الشعرية الكوارتز يضمن ان يتم محاذاة محول والليزر مباشره.
- وضع القسم من أنبوب الكوارتز الشعرية في محاذاة مباشره مع محول ، في مجال النظر من المجهر ، مما يسمح لوضع دقيق من ألياف البصرية فوق العينة بحيث يضيء العرض بأكمله من الأنبوب.
- يشع العينة باستخدام ألياف البصرية توجيه ليزر الحالة الصلبة ضخ الصمام الثنائي العاملة في الطول الموجي من 1,053 نانومتر. الحادث ضوء الليزر علي العينة ومحول المستخدمة لقياس تاثير الصوتية الضوئية علي حد سواء غير المركزة.
- الطاقة من حادث ليزر علي العينة حوالي 8 مللي جول ومعدل الليزر 10 هرتز كافيه للقاء النور علي كل عينه عده مرات كما انه يمر عبر النظام.
- وضع نظام تدفق علي راس المجهر المقلوب وضمان كل من نبض الليزر ومسار العينة مرئية كما يمر العينة علي الرغم من نظام التدفق. تدفق السجلات باستخدام كاميرا مثبته بالمجهر.
- تسجيل المقتنيات بالموجات فوق الصوتية باستخدام البرمجيات الحصول علي البيانات (انظر جدول المواد). الموجات فوق الصوتية الزناد والليزر النبضي باستخدام FPGA. الاستفادة من تلفزيوني مع 2 ٪ توين ، والاتحاد الكونغولي للرقابة المصادر الخارجية في تركيز 100 ميكروغرام/مل في تلفزيوني 2 ٪ توين ، والضوابط السلبية والايجابيه ، علي التوالي.
- الاستفادة من الكاميرا التي شنت المجهر ، وتسجيل كل من إطلاق الليزر ومرور العينات علي الرغم من نظام تدفق. ستستخدم هذه التسجيلات لربط الاشاره الصوتية المسجلة من قبل محول مع إطلاق الليزر. وبما ان العينات تمر امام إطلاق الليزر ، فان الاشاره يمكن ان تكون مرتبطة بالاشاره الصوتية الضوئية الناتجة للتحليل. في معدل أخذ العينات من 10 هرتز ، سيضيء الليزر كل قابس عده مرات.
8. تجهيز البريد
- لكل اكتساب اشاره ، s (t) ، حساب تحويل Hilbert ، H [s (t)] ، من أجل إنشاء اشاره تحليليه.
- إنشاء مغلف معقد ، se(t) ، عن طريق حساب حجم الاشاره التحليلية ، بحيث
يتم دمج المغلف لقياس الاشاره الاجماليه الناتجة عن كل عمليه استحواذ. قارن الإشارات من كل مجموعه اختبار (علي سبيل المثال ، برنامج تلفزيوني ، والموسومة الخلايا ، FA-CuS NPs ، والخلايا وحدها) باستخدام اختبار t في البرمجيات الاحصائيه R. وترد في الشكل 4الإشارات الصوتية الضوئية الخام وتحولاتها hilbert. - لأعاده بناء الصورة ، تطبيع المغلف المعقدة استنادا إلى اقصي ذروه عبر المدى كله. في حاله مقارنه سلسله من التشغيلات ، قم بتطبيع المغلف المعقد باستخدام اقصي ذروه عبر السلسلة بأكملها. بعد التطبيع ، تحويل كل اكتساب إلى سلسله من قيم البكسل. تمثيل كل سلسله من قيم البكسل كعمود في أعاده إنشاء الصورة. وترد في الشكل 5الاعاده التمثيلية للإشارات التلفزيونية الموحدة وإشارات الاتحاد العام لكره القد ، حيث تم تطبيع كلا الصورتين باستخدام اقصي ذروه عبر كلا المسارين.
يتم دمج المغلف لقياس الاشاره الاجماليه الناتجة عن كل عمليه استحواذ. قارن الإشارات من كل مجموعه اختبار (علي سبيل المثال ، برنامج تلفزيوني ، والموسومة الخلايا ، FA-CuS NPs ، والخلايا وحدها) باستخدام اختبار t في البرمجيات الاحصائيه R. وترد في الشكل 4الإشارات الصوتية الضوئية الخام وتحولاتها hilbert.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1a يظهر صوره نموذجيه من الجسيمات النانويه توليفها. متوسط حجم جسيمات متناهي نموذجيه تقريبا 8.6 نانومتر ± 2.5 nm. تم اجراء قياس جسيمات متناهي في ImageJ. وطبقت وظائف العتبة ومستجمعات المياه للفصل بين الجزيئات للقياس. وتم قياس الأقطار الافقيه والراسية لكل من الجسيمات عموديا علي بعضها البعض وزاد متوسطها. النسبة لل DLS ، يظهر قياس تمثيلي في الشكل 1باء. متوسط القطر الهيدروديناميكي لهذه الجزيئات هو 73.6 نانومتر. جزيئات كبريتيد النحاس لديها منحني الامتصاص المميزة التي تمتد إلى نير ، كما هو مبين في الشكل 1ج. هناك قطعه أثريه طفيفه حول 850 nm التي كان سببها التحول من أشعه الليزر من قبل مقياس الطيف الطيفي.
ويمكن رؤية الصور المجهرية الفلورية من الخلايا المحتضنة مع فلوريسسينتلي الموسومة النانويه في الشكل 2. يمكن تصور امتصاص جسيمات متناهي بوجود مضان عبر الخلية. لا تظهر الخلايا التي لم يتم احتضانها مع جسيمات نانويه اي اشاره فلوري. يشير وجود هذه الاشاره الفلورية إلى الامتصاص الناجح للجسيمات وقدرتها علي الكشف عنها في نظام التدفق.
ويبين الشكل 3 الاعداد العام لنظام التدفق الصوتي التصويري. يظهر الشكل 3a نموذج مفصل للغرفة تدفق 3d. يمكن طباعه هذه الغرفة باستخدام ملف. stl المتوفر مع هذا البروتوكول. يبين الشكل 3ب لمحه عامه عن اعداد خزان التدفق. ويبين الشكل 3ج الاعداد العام لخزان التدفق ونظام الحصول علي البيانات.
وتظهر إشارات الحصول علي البيانات النموذجية في الشكل 4. تشير البيانات الاوليه إلى الاختلافات في الاشاره بين الخلايا جسيمات متناهي الموسومة ، والتلفزيونية ، والاتحاد الكره الكتروني-CuS إلى NPs. الاستحواذ هو الاشاره الصوتية الناتجة عن نبض ليزر واحد. بسبب سرعه إطلاق النار من الليزر ، كل عينه تحليل يولد الاستحواذ متعددة. تم إنشاء ظرف لكل اكتساب فردي باستخدام تحويل Hilbert. تم دمج هذا الظرف لقياس المبلغ الإجمالي للاشاره المتولدة من نبض الليزر. وفي دراسة سابقه ، تم تحليل هذه البيانات باستخدام البرمجيات الاحصائيه R ، حيث كان عدد المقتنيات المحللة للاختبار t 203 ، 150 ، 160 ، 131 ، للخلايا التي بها مصادر NPs ، والخلايا وحدها ، وبرنامج البرامج التلفزيونية ، ومصادر المعلومات الرقمية وحدها ، علي التوالي22. تم تطبيع البيانات عن طريق تحويل السجلات ومقارنتها باستخدام اختبار ويلش في R. وأظهرت الإشارات الناتجة عن الاتحاد الكونغولي للرقابة الخارجية وحدها في تركيز 100 ميكروغرام/مل اشاره اعلي بكثير من السيطرة السلبية. وكان الفرق في الإشارات بين السيطرة السلبية و CTCs المبيض الموسومة أكثر دهاء من السيطرة الايجابيه ولكن يمكن الكشف عنها من خلال تحليل وسائلها عن طريق اختبار t22.
الاستفادة من LabView مخصصه والبرمجيات MATLAB ، تم اجراء عمليات أعاده بناء الصورة من الضوابط الايجابيه والسلبية في الوقت الحقيقي وما بعد الاستحواذ ، علي التوالي. ومن أجل توليد الاعاده التصويرية الصوتية ، تم حساب ظرف من كل عمليه استحواذ باستخدام تحويل هيلبرت. تم تحويل الأظرف الفردية فيما بعد إلى قيم البيكسل وعرضها كاعمده مستقله. وتحدث اختلافات واضحة في الاشاره الصوتية الضوئية بين الاتحاد الكونغولي لمصادر الأمن والجمارك بتركيز 100 ميكروغرام/مل وعينه تلفزيونيه (الشكل 5). ومن المهم ان يتم تشغيل الضوابط الخاصة بالنظام للتاكد من ان النظام ينتج بشكل كاف اشاره صوتيه ضوئيه يمكن الكشف عنها بواسطة المحول.
الشكل 1: توصيف NP التمثيلي. (ا) الصورة التجميعيةلمجموعهالاتحاد البحري التي تم توليفها. شريط مقياس = 50 نانومتر. (ب) التوزيع التمثيلي لكثافة الوحدة الخاصة لمصادر القوه التي تم توليفها. (ج) منحني الامتصاص التمثيلي لاتحاد الكره والجمارك يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور المجهرية التمثيلية لخلايا كوف-3. حضنت الخلايا كان مع ودون 400 ميكروغرام/مل [فلوريسسينتلي-موسوم] [NPs]. مقياس شريط = 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصور التمثيلية لنظام التدفق الصوتي الضوئي وغرفه التدفق. (ا) عرض مفصل لغرفه التدفق المطبوع ثلاثي الابعاد. (ب) الرسم التخطيطي لنظام الاتحاد. (ج) هيكل نظام التدفق: SP = مضخة الحقنه ؛ [دق]/[فبغ] = معطيات اكتساب/مجال قابل للبرمجة بوابه صفيف; Ob = عدسه الموضوعية ؛ من = ألياف البصرية; FC = مقرنة ألياف; UT = محول الموجات فوق الصوتية; FT = تدفق خزان. وهذا الرقم مقتبس من Lusk et al.22. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اشاره البيانات الاوليه التمثيلية وتحويلات هيلبرت من العينات المختبرة في نظام التدفق. (ا) اشاره البيانات الاوليه التمثيلية من الاذاعه التلفزيونية والخلايا المحتضنة بمصادر NPs وتحويل البيانات (د) hilbert. (ب) اشاره البيانات الاوليه التمثيلية من الخلايا وحدها والخلايا المحتضنة بالاتحاد العام لكره اليد ، و (ه) تحويل hilbert من البيانات. (ج) اشاره البيانات الاوليه التمثيلية من الاذاعه التلفزيونية و 100 ميكروغرام/مل من الاتحادالفرنسيللمواد الخام و (و) تحويل hilbert من البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أعاده تشكيل الصور الصوتية التصويرية التمثيلية للبيانات الصوتية التصويرية. (ا) أعاده بناء الصورة ب100 ميكروغرام/مل من الاتحاد النقدي الخاص (ب) واختبارها في نظام التدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: غرفه التدفق STL. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول هو وسيله واضحة للكشف عن CTCs المبيض باستخدام الاتحاد الاسيوي لكره القد وعامل التباين المستهدفة CuS. وقد تم استكشاف العديد من الطرق للكشف عن ctcs المبيض ، بما في ذلك الاجهزه ميكروفلويديك ، RT-PCR ، والفلوري تدفق الخلوي23،24،25. هذه المجموعة في التعقيد ، والتكلفة ، والدقة ، والحد من فعاليتها في الإعدادات السريرية. ويقدم الاتحاد العديد من المزايا علي هذه الطرق التقليدية للكشف عن CTCs ، بما في ذلك القدرة علي الكشف عن CTCs داخل عينات المريض ، وسهوله الترجمة إلى التطبيقات المجرية. وقد تبين أيضا ان الاتحاد الاسيوي لكره الصدر يكشف بدقه عن ctcs في المختبر وفي الجسم المجري عندما يقترن بعوامل التباين المستهدفة26،27.
وفي هذا العمل ، تم تقييم عوامل التباين الخاصة بالاتحاد العام لكره القد من أجل قدرتها علي تحسين دقه الكشف عن الملوثات الدقيقة في التركيزات الفسيولوجية ذات الصلة. وأجريت الدراسات باستخدام معزولة-3 الخلايا التي أعيد تعليقها في الاذاعه التلفزيونية. وأشار التحليل عن طريق المجهر الفلوري إلى الامتصاص الناجح لهذه الجزيئات. الكشف عن النتائج الخلايا كوف-3 وصولا إلى تركيز خليه 1/μL22. تتضمن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التوليف الجسيمات متناهي ومحاذاة اعداد التدفق الصوتي الضوئي. خلال التوليف جسيمات متناهي ، من المهم للتاكد من ان الحل قد تحولت اللون الأخضر الداكن قبل أزاله الخليط من حمام الزيت. بالنسبة لنظام التدفق ، فان تشغيل عنصر تحكم سالب وإيجابي علي الرغم من ان النظام قبل اختبار العينة ضروري للتاكد من ان النظام ينتج اشاره صوتيه ضوئيه كافيه للكشف اللاحق عن الخلايا المسمية. اثناء تشغيل نظام التدفق ، من المهم التاكد من ان ضوء الحادث من ألياف البصرية يضيء تماما أنبوب الشعرية ، وان محول هو دافئ ضد الجانب من غرفه التدفق. وأخيرا ، فان الاختبار الدقيق لنظام التسريبات ضروري لضمان السلامة البيولوجية للنظام وللتدفق المستمر من خلال الغرفة.
النسبة لنظام الاتحاد الحالي ، أكدت الدراسات الاوليه الكشف الصوتي الضوئي باستخدام نظام المحول والتضخيم. وكانت غالبيه هذه الإشارات تتالف من إشارات تردد اقل (< MHz 20). وهناك حاجه إلى المزيد من الدراسات للتاكد مما إذا كان هذا يرجع إلى التردد الفعلي للإشارات الصوتية المتولدة أو العرض الترددي 35 MHz لمضخم الصوت. ستقوم الدراسات المستقبلية بالتحقيق في مكونات التردد للإشارات المكتشفة من أجل تحسين التردد المركزي للمحول بالاضافه إلى عرض النطاق الترددي لنظام التضخيم. النظام الحالي هو المناسب خصيصا للكشف عن الجسم السابق لل CTCs. ومع ذلك ، فان هذا الأسلوب يحدد امكانيه التطبيق في المستقبل من الاتحاد العام لكره الطاقة-CuS NPs في الجسم المجري.
الدراسات المستقبلية تهدف إلى الكشف عن خلايا سرطان المبيض داخل الثقافات المختلطة, العينات السريرية البشرية, وفي نماذج فيفو28,29,30. وعلاوة علي ذلك ، ستدرس الدراسات المقبلة خصوصية هذه الجسيمات النانويه مقابل الضوابط غير المستهدفة. ستشمل المصادقة علي هذه الطريقة في المستقبل اختبار هذه الاداه مع العينات السريرية البشرية ، وتنفيذ اختبار الانتاجيه العالية والتحليل ، والترجمة إلى الإعدادات السريرية. هذه التقنية الصوتية الضوئية تظهر امكانيه الترجمة في المستقبل إلى مجموعه واسعه من التطبيقات السريرية والامراض عبر مجموعه من عوامل التباين والتحاليل. الكشف الصوتي الضوئي للتحليلات باستخدام الاتحاد الاسيوي لكره القد يمكن ان يجعل الكشف عن نقطه الرعاية من التحويلات الكيميائية وغيرها من مسببات الامراض أكثر سرعه وغير مكلفه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون ان يعترفوا بمادلين هاويل لمساعدتها في التوليف ، ماثيو الصدر لمساعدته في تصميم نظام تدفق ، وإيثان Marschall للحصول علي المساعدة مع سوليدووركس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
