Summary
提出了利用定制的光声流系统和靶向叶酸封铜硫化纳米粒子检测循环卵巢肿瘤细胞的协议。
Abstract
许多研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）的枚举可能显示作为卵巢癌的预后工具的希望。目前检测CTC的策略包括流式细胞测量、微流体装置和实时聚合酶链反应（RT-PCR）。尽管最近取得了一些进展，早期卵巢癌转移的检测方法仍然缺乏临床翻译所需的敏感性和特异性。本文提出了一种利用定制三维（3D）打印系统（包括流动室和注射器泵）的光声流细胞测定卵巢循环肿瘤细胞的新方法。该方法利用叶酸封铜硫化纳米颗粒（FA-CuS NPs）通过PAFC靶向SKOV-3卵巢癌细胞。这项工作证明了这些造影剂对卵巢癌细胞的亲和力。结果表明，通过荧光显微镜进行NP表征、PAFC检测和NP吸量，从而证明这种新型系统在生理相关浓度下检测卵巢CC的潜力。
Introduction
卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤之一，2018年全球估计有184，800人死亡。多项研究表明卵巢癌进展（即转移）与CTCs2、3、4之间存在的相关性。CTC检测和分离的最常见方法是利用细胞搜索系统，该系统以EpCam受体5为目标。EpCam表达，然而，在上皮到间质过渡，这已经牵连在癌症转移6。尽管取得了进步，但目前的临床技术仍然受到低准确性、高成本和复杂性的影响。由于这些缺点，发现和枚举卵巢CTC的新技术已成为研究的一个重要领域。
最近，PAFC成为非侵入性检测癌细胞、分析纳米材料以及鉴定细菌7、8、9的有效方法。PAFC 不同于传统的荧光流细胞测量，它利用光声检测流中的分析物。当激光被引起热弹性膨胀的材料吸收时，会产生光声效应，产生声波，超声波可以由超声波传感器10、11探测到。PAFC 与传统流式细胞测定方法相比具有的优势包括简单、易于翻译到临床设置，以及检测在患者样本12、13中前所未有的深度的 CTC。最近的研究已经利用PAFC系统检测细胞使用内源和外源造影14，15。近红外（NIR）光吸收造影剂，如丁氰化绿色染料，和金属NPs（如黄金和CuS）已用于细胞和组织的选择标记，结合光声成像16，17，18。由于生物组织中近红外光的穿透深度提高，吸收剂的光声检测可以在更深的临床应用中进行。由于其在诊所使用的巨大潜力，靶向NIR造影剂与PAFC的结合引起了对检测高氯联产委的极大兴趣。
PAFC 与靶向造影剂相结合，为高通量分析患者样本提供了改进的方法，提高了 PC 的准确性和有针对性的检测。CTC的主要检测策略之一是特定靶向感兴趣的细胞上的膜蛋白。卵巢CTC的一个显著特征是位于其外膜19上的叶酸受体的过度表达。叶酸受体靶向是鉴定血液中卵巢CTC的理想策略，因为内源性细胞具有较高的叶酸受体表达，一般是发光的，对血液接触有限。硫化铜（CuSNPs）最近被公认为能够靶向癌细胞21上表达的叶酸受体。这些NP造影剂结合其生物相容性、易于合成和吸收在近红外的深层，为利用PAFC检测卵巢CTC的理想靶向策略。
这项工作描述了FA-CuS NPs的制备及其用于检测光声流系统中的卵巢癌细胞。CuS NPs 用叶酸进行修饰，以专门针对卵巢 CTC，并在使用 1，053 nm 激光刺激时发出光声信号。结果表明，在PAFC系统中用这些光声造影剂孵育的卵巢癌细胞被成功检测。这些结果表明，卵巢癌细胞的检测浓度下降到1细胞/μL，荧光显微镜证实SKOV-3卵巢癌细胞22成功吸出这些颗粒。这项工作详细介绍了FA-CuS NPs合成、荧光显微镜样品制备、光声流系统构建以及卵巢癌细胞的光声检测。该方法表明，利用FA-CuS NPs成功识别了流动中的卵巢CTC。今后的工作将侧重于该技术在卵巢癌转移的早期发现方面的临床应用。
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Protocol
1. 纳米粒子合成和功能化
注：FA-CuS NPs的合成是使用一个从先前发布的协议21改编的一罐合成方法实现的。
注意：所有合成应发生在通风的化学烟气罩中。
- 在合成之前，通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤大约 300 mL 的去离子 （DI） 水。
- 用洗涤剂溶液清洁 250 mL 玻璃圆底瓶，然后用 DI 水冲洗。将 0.0134 g 的 CuCl2添加到 100 mL 的 DI 水中，以创建 1 mM 溶液。
- 在 CuCl2溶液中加入 0.015 克叶酸 （FA），并使用磁性搅拌棒搅拌约 5 分钟。
- 使用 200 μL 移液器将 Na2S+9H2O（100 μL DI 水中的 0.024 克）添加到反应混合物中约 10 s。
注：添加 Na2S+9H2O 后，溶液的颜色将从浅黄色变为深棕色。 - 将反应盖住并放入油浴中，设置为 90°C，然后继续用磁搅拌棒搅拌。大约 15 分钟后，或当油浴温度达到 85–90 °C 时，允许反应再进行一小时。你的混合物应该逐渐变成深绿色。
注：在加热反应混合物时，确保向系统通风，以避免压力积聚。 - 将反应容器从油浴中取出，在室温下短暂冷却约 10 至 15 分钟，然后转移到冰浴中。
- 一旦反应混合物冷却到20°C以下，利用1M NaOH将pH值调整到10，将剩余的叶酸溶解成溶液。
- 使用 30 kDa 离心柱净化 FA-CuS 反应混合物。将15 mL批次的溶液加入柱中，并在3，082 x g下离心15分钟。
- 一旦所有反应混合物被浓缩，在30 kDa离心柱中重新组合浓缩馏分，用15mL的pH 10 NaOH洗涤4x。
- 对于质量测量，取1/3溶液（+66 μL），分成三个玻璃瓶。在真空烤箱中以±27 mmHg的真空温度在40°C下过夜。
- 将另外2/3的浓缩溶液溶解到250μL的PBS中，储存在4°C处，直到进一步使用。
- 在使用 FA-CuS NPs 之前，在高环境中的沐浴声波器中，在耳光中发出 30 分钟的声波。
2. NP 特征化
- 执行动态光散射 （DLS） 在 PBS 溶液中加入 10 μL 的浓缩 FA-CuS NPS，从 DI 水的步骤 1.1.14 到 2 mL。在使用 DLS 进行表征之前，在高设置的沐浴声波器中对颗粒进行 30 分钟的声波，并通过 0.2 μm 无菌过滤器进行过滤，以清除残留灰尘。
- 执行透射电子显微镜（TEM）：在PBS溶液中加入10μL的浓缩FA-CuS核动力源到一张蜡纸中。将液滴顶部的铜面涂层铜格反转，让坐2分钟。 将涂覆的铜面网格的边缘触摸到一块滤纸上，以去除多余的液体。让空气干燥。利用电子显微镜在80 kV的加速电压下对铜网格进行成像。
注：FA-CuS NPS特性的典型结果如图1所示。
3. 细胞培养
- 该协议利用SKOV-3细胞。除非另有说明，否则麦考伊 5A 培养基中的培养 SKOV-3 细胞辅以 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，并在加湿的 5% CO2培养箱中保持在 37°C。
4. 用于显微镜的 FA-CuS NPS 的荧光标记
- 在1mL的0.1M NaHCO3（pH +9）缓冲液中加入含有2毫克FA-CuS NPs的溶液中，加入德州-红-X琥珀酯（0.2毫克溶解在DMSO中，浓度为10mg/mL）。
- 在室温下，使用磁性搅拌棒搅拌反应混合物 1 小时，远离光线。
- 在 4，000 x g下旋 10 分钟，将反应混合物浓缩在 4 mL 30 kDa MWCO 离心柱中。
- 用4 mL的0.1 M NaHCO3缓冲液（pH +9）在离心柱中清洗浓缩溶液3倍。随后，用4 mL的DI水3x或直到UV-VIS在流中仅可见微量的荧光。
5. 卵巢癌细胞的FA-CuS NPS接收
- 在用FA-CuS NPs孵育之前，在T75烧瓶中孵育SKOV-3细胞，其无叶酸RPMI-1640介质为8~15 mL，带10%FBS和1%青霉素/链霉素，至少24小时。
- 种子细胞在0.5 mL的叶酸无RPMI-1640完成生长培养基，密度为0.1 x 106细胞/mL，进入24孔板。
- 第二天，用400μg/mL FA-CuS NPS在0.5 mL不含叶酸的RPMI-1640中孵育细胞，持续2小时。
- 在此孵育后，使用 EDTA 用 0.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶化细胞。加入至少1 mL的叶酸无RPMI-1640完整生长培养基，以中和胰蛋白酶，并在123 x g下离心6分钟。
- 取出上清液，将细胞重新悬浮在2 mL的PBS中，并在123 x g下离心6分钟。执行此洗涤步骤2x以去除任何未绑定的NPs。
- 用2%补间溶液在PBS的1⁄2 mL中重新悬浮细胞。
- 使用血细胞计和锥蓝色试青计算细胞。如果细胞计数过高，进一步稀释细胞。将PBS中的细胞稀释，将2%补间至所选浓度进行检测。
- 这些细胞现在已准备好由PAFC系统进行分析。
6. FA-CuS NPS 吸波的荧光显微镜
- 重复步骤 5.1 中列出的步骤，然后继续执行下面的显微镜协议。
- 种子细胞在0.5 mL中密度为0.1 x 106细胞/mL，在24孔板的玻璃盖板上完全生长培养基，不含叶酸的RPMI-1640。
- 第二天，在无叶酸RPMI-1640完全生长培养基0.5 mL中，以100微克/mL、200微克/mL、300微克/mL和400μg/mL的浓度，用荧光标记的FA-CuS NPs在三联体中孵育细胞。
- 在37°C培养箱中用NP孵育细胞2小时
- 在此潜伏期之后，用PBS清洗细胞3倍。
注：对于所有洗涤步骤，请小心地将溶液添加到孔板的侧面，以免干扰细胞。加后，小心倾斜板，并从井侧取出溶液。 - 在PBS中孵育0.5 mL 3.7%甲醛（PFA）的细胞15分钟，并将玻璃盖片转移到新的24孔板。
注意：PFA是一种已知的致癌物质。在通风的化学烟气罩内进行所有固定，并穿戴适当的个人防护设备。 - 在PBS中用0.1%Triton-X在3.7%PFA溶液中孵育细胞5分钟。
- 用 0.5 mL 的 PBS 3x 清洗细胞，每次 5 分钟，并将盖玻片转移到新板。
- 用含有DAPI的0.5 mL的PBS溶液（0.5mg/mL库存溶液的20μL/mL用于染色）孵育细胞，5分钟，远离光线。
- 用PBS 3x清洗细胞。
- 进行最终的 PBS 清洗后，将盖玻片安装在带有安装介质的幻灯片上。
- 细胞现在已经准备好通过荧光显微镜成像。图2显示了荧光显微镜的典型细胞表征示例。
7. 流系统架构
- 流量室结构
注：3D打印流罐的SolidWorks文件可在补充材料中找到。- 使用提供的 SolidWorks 文件，使用 ABS 热塑性塑料或 PLA 塑料 3D 打印流量罐。如果 SolidWorks 不可用，则提供下面的尺寸。图 3A显示了此模型的表示形式。流量罐的机身为 2.5 厘米 x 1.5 厘米 x 7.5 厘米。流量罐的远端包括直径约 5 mm 的孔，以允许包含毛细管的管道进入。
注：流量罐有一个1厘米的孔，垂直于毛细管的方向，用于放置超声波传感器。与孔的内径相同的圆柱形挤出到油箱中延伸 6 mm。对于实时成像，流量罐在毛细管正下方有一个 1 mm x 3 mm 槽。 - 打印 3D 流量罐后，清洁并组装系统以使用。
- 将玻璃盖片放在流量系统中的 1 mm x 3 mm 插槽和 1 厘米孔上。
- 用硅胶小心密封，防止泄漏。
- 将毛细管放入硅胶固化管中。将管插入流室，通过流量罐的一侧，使玻璃毛细管位于 3 mm 槽和 1 厘米孔的正上方和前面。
- 使用硅胶密封油管，以防止泄漏。
- 使用提供的 SolidWorks 文件，使用 ABS 热塑性塑料或 PLA 塑料 3D 打印流量罐。如果 SolidWorks 不可用，则提供下面的尺寸。图 3A显示了此模型的表示形式。流量罐的机身为 2.5 厘米 x 1.5 厘米 x 7.5 厘米。流量罐的远端包括直径约 5 mm 的孔，以允许包含毛细管的管道进入。
- 光声流系统设置
注：图3B和图3C显示了流系统体系结构的示例。- 将传感器连接到超声波脉冲器/接收器。以 59 dB 增益放大信号。
- 将滤波器的输出连接到配备内置现场可编程门阵列的多用途可重新配置示波器。
- 将来自流室的一根管子连接到 T 结，连接到每个分支的两个注射器泵。
- 向其中一个注射器泵和另一个泵中注入要分析的样品。将包含空气的泵设置为 40 μL/min 的流量，将包含样品的泵设置为 20 μL/min 的流量。产生的两相流将产生1 μL的样品体积。在此流速下，系统将每分钟测试大约 6.4 个样本。
注：为了保持细胞的一致分布，在测试前立即轻轻涡旋每个样本。此外，每隔几分钟旋转一次注射器，以防止细胞在溶液中沉淀。 - 将流出流量系统的剩余管连接到装有 10% 漂白剂的容器，以在细胞退出流量系统后处理它们。
注：在使用流系统之前，请检查泄漏，因为这些泄漏会影响流量。细胞必须包含在封闭的系统中，以保持手术过程中的生物安全。 - 3D 打印罐的设计允许在传感器和激光之间实现一致且可重复的对齐，只需极少的校准。当正确放置在定制罐内时，石英毛细管可确保传感器和激光直接对齐。
- 将石英毛细管部分与传感器直接对齐，置于显微镜的视野中，以便小心地将光纤放置在样品上方，从而照亮管的整个宽度。
- 使用光纤通道照射样品，以波长为 1，053 nm 的二极管泵送固态激光器。样品上的激光事件和用于测量光声效果的传感器均无聚焦。
- 样品上的激光射焦能量约为 8 mJ，10 Hz 激光速率足以在通过系统时多次照亮每个样品。
- 将流系统放在倒置显微镜的顶部，确保样品通过流系统时，激光脉冲和样品路径都可见。使用安装在显微镜上的摄像机记录流量。
- 使用数据采集软件记录超声采集（参见材料表）。使用 FPGA 触发超声波和脉冲激光。分别使用2%补间和FA-CuSNP在PBS2%补间中浓度为100μg/mL的PBS，作为负对照和正对照。
- 利用安装在显微镜上的摄像机，记录激光的发射和样品通过流系统的通道。这些录音将用于将传感器记录的声学信号与激光的发射相关联。当样品在激光发射前经过时，信号可以与产生的光声信号关联，以便进行分析。在 10 Hz 的采样速率下，激光将照亮每个插头几次。
8. 后期处理
- 对于每个信号采集，s（t），计算希尔伯特变换，H_s（t）*，以创建分析信号。
- 通过计算分析信号的大小，创建一个复杂的包络，se（t），
从而集成包络以测量每次采集产生的总信号。利用R统计软件中的t-test，比较每个测试组的信号（即PBS、标记单元、FA-CuS NPs、单组）。原始光声信号及其希尔伯特变换如图4所示。 - 对于图像重建，根据整个运行的最大峰值对复杂包络进行规范化。如果比较一系列运行，则使用整个系列中的最大峰值对复杂包络进行规范化。规范化后，将每个采集转换为一系列像素值。在图像重建中将每个像素值序列表示为列。PBS 和 FA-CuS NPs 信号的代表性重建如图5所示，其中两个图像都使用两个运行的最大峰值进行规范化。
从而集成包络以测量每次采集产生的总信号。利用R统计软件中的t-test，比较每个测试组的信号（即PBS、标记单元、FA-CuS NPs、单组）。原始光声信号及其希尔伯特变换如图4所示。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1A显示了合成纳米粒子的典型TEM图像。典型纳米粒子的平均尺寸约为 8.6 nm ± 2.5 nm。纳米粒子测量在ImageJ中进行。阈值和分水岭函数用于分离粒子进行测量。每个粒子的水平和垂直直径是垂直测量并进一步平均。对于 DLS，图 1B显示了具有代表性的测量值。这些颗粒的平均流体动力学直径为73.6纳米。硫化铜纳米粒子具有一个特征吸收曲线，延伸到近红外线，如图1C所示。光谱光度计切换激光引起约850nm的轻微伪影。
图2中可以看到用荧光标记的纳米粒子孵育细胞的荧光显微镜图像。纳米粒子的接受可以通过细胞中荧光的存在来可视化。未用纳米粒子孵育的细胞没有荧光信号。此荧光信号的存在表明粒子的成功接收及其在流系统中被检测的能力。
图 3显示了光声流系统的一般设置。图 3A显示了 3D 流室的详细模型。此腔室可以使用此协议提供的 .stl 文件进行打印。图 3B显示了流量罐设置的概述。图3C显示了流量罐和数据采集系统的一般设置。
典型的数据采集信号如图4所示。原始数据表明纳米粒子标记细胞、PBS 和 FA-CuS NPs 之间的信号差异。采集是从单个激光脉冲生成的光声信号。由于激光的快速发射速度，每个分析的样品会产生多个采集。使用希尔伯特变换为每个单个采集生成一个信封。此包络集成了用于测量激光脉冲产生的信号总量。在以前的研究中，这些数据使用R统计软件进行分析，其中为t-test分析的采集数量分别为203、150、160和131，仅具有NPs、单细胞、PBS和NP的细胞数量分别为22个。数据通过日志转换进行规范化，并利用韦尔奇在R中的t-test测试进行比较。仅FA-CuS NPs在浓度为100μg/mL时产生的信号比负对照信号高得多。阴性对照和标记的卵巢CTC之间的信号差异比阳性对照更微妙，但可以通过t-test2分析其手段来检测。
利用自定义LabView和MATLAB软件，分别对实时和采集后正负控制进行了图像重建。为了生成光声重建，使用希尔伯特变换计算了每个采集的包络。单个信封随后被转换为像素值，并显示为独立的列。浓度为 100 μg/mL 的 FA-CuS NP 与 PBS 样品之间存在明显的光声信号差异（图 5）。系统的控制对于运行非常重要，以确保系统能够充分生成传感器可以检测到的光声信号。
图1：代表性NP特征。（A） 合成 FA-CuS NPs 的 TEM 图像. 缩放条 = 50 nm.（B） 代表 DLS 强度分布合成 FA-CuS NPs . （C） 代表 FA-CuS NPs 吸收曲线.请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SKOV-3细胞的代表性荧光显微镜图像。细胞孵育时有400μg/mL荧光标记的NPs。比例条 = 50μm。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图3：光声流流仪系统和流室的代表性图像。（A） 3D 打印流室的详细视图.（B） PAFC 系统的示意图.（C） 流量系统架构：SP + 注射器泵;DAQ/FPGA = 数据采集/现场可编程门阵列;Ob = 物镜;OF = 光纤;FC = 光纤耦合器;UT = 超声波传感器;FT = 流量罐。这个数字是改编自卢斯克等人22。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在流系统中测试的样本的代表性原始数据信号和Hilbert变换。（A） 来自 PBS 和细胞的代表性原始数据信号用 NP 和 （D） 希尔伯特转换的数据孵育.（B） 代表原始数据信号来自细胞本身和细胞孵育与FA-CuSNPs和（E）希尔伯特转换的数据。（C） 代表来自 PBS 的原始数据信号和 100 μg/mL FA-CuS NPs 和 （F） 数据希尔伯特变换。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：具有代表性的光声图像重建光声数据。（A） 在流系统中测试的 100 μg/mL FA-CuS NPs 和 （B） PBS 的图像重建。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件1：流动室STL。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
该协议是利用PAFC和目标CuS造影剂检测卵巢CTC的一种简单方法。已经探索出许多检测卵巢CTC的方法，包括微流体装置、RT-PCR和荧光流细胞测定仪23、24、25。这些范围的复杂性、成本和准确性，限制了它们在临床环境中的有效性。PAFC 引入了与这些传统检测 CTC 方法相比的若干优点，包括检测患者样本中的 CTC 的能力，以及将其易于转换到体内应用。PAFC还被证明与靶向造影剂26、27结合时，在体外和体内能准确检测CTC。
在这项工作中，对FA-CuS NP对比剂在生理相关浓度下提高CTC检测精度的能力进行了评估。研究使用分离的SKOV-3细胞在PBS中重新悬浮。荧光显微镜分析表明，这些颗粒被成功吸走。结果检测出SKOV-3细胞浓度为1细胞/μL2。该协议的关键步骤涉及纳米粒子合成和光声流设置的对齐。在纳米粒子合成过程中，在从油浴中取出混合物之前，务必确保溶液变成深绿色。对于流量系统，在样品测试之前通过系统运行负数和正控制是必要的，以确保系统产生足够的光声信号，以便随后检测标记的细胞。在运行流量系统时，必须确保光纤的射焦光完全照亮毛细管，并且传感器与流室侧面结对。最后，必须对系统进行严格的泄漏测试，以确保系统的生物安全和通过腔室的一致性。
对于当前的PAFC系统，初步研究证实了使用传感器和放大系统的光声检测。这些信号大多由低频信号（<20 MHz）组成。需要进一步的研究，以确认这是由于生成的光声信号的实际频率或放大器的35 MHz带宽。未来的研究将研究检测到的信号的频率分量，以优化传感器的中心频率以及放大系统的带宽。目前的系统特别适用于CTC的活体检测。然而，这种方法确定了FA-CuS NPs在体内未来应用的潜力。
未来的研究旨在检测混合培养物中的卵巢癌细胞、人体临床样本和体内模型28、29、30。此外，未来的研究将检查这些纳米粒子与非靶向对照的特异性。该方法的未来验证将包括使用人体临床样本测试此工具，实现高通量测试和分析，以及转换为临床设置。这种光声技术显示了未来在各种造影剂和分析物中应用于各种临床应用和疾病的潜力。利用PAFC对分析物进行光声检测，有可能使CTC和其他病原体的护理点检测更加快速和廉价。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢玛德琳·豪厄尔在合成方面给予的帮助，马修·切斯特帮助设计流系统，伊森·马沙尔帮助SolidWorks。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
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