Summary
En protokol præsenteres for at detektere cirkulerende ovarie tumorceller udnytter en skræddersyet foto akustisk flow system og målrettede folinsyre-udjævnede kobber sulfid nanopartikler.
Abstract
Mange undersøgelser tyder på, at opregning af cirkulerende tumorceller (CTCs) kan vise løfte som en prognose værktøj for kræft i æggestokkene. De nuværende strategier til påvisning af ctc'er omfatter flowcytometri, mikrofluidisk-enheder og realtids polymerasekædereaktion (RT-PCR). På trods af de seneste fremskridt, metoder til påvisning af tidlig ovariecancer metastase stadig mangler følsomhed og specificitet kræves for klinisk oversættelse. Her præsenteres en ny metode til påvisning af ovarie cirkulerende tumorceller ved hjælp af photoacoustic flow flowcytometri (pafc), der udnytter en brugerdefineret tredimensionel (3D) trykt system, herunder et flow kammer og sprøjtepumpe. Denne metode udnytter folinsyre-udjævnede kobber sulfid nanopartikler (FA-CuS NPs) til at målrette SKOV-3 ovariecancerceller af PAFC. Dette arbejde viser affiniteten af disse kontrastmidler til kræftceller i æggestokkene. Resultaterne viser NP-karakterisering, PAFC-detektion og NP-optagelse ved Fluorescens mikroskopi, hvilket demonstrerer potentialet i dette nye system til påvisning af ovarie Ctc'er ved fysiologisk relevante koncentrationer.
Introduction
Kræft i æggestokkene er en af de dødeligste gynækologiske maligniteter og resulterede i en anslået 184.800 dødsfald på verdensplan i 20181. Flere undersøgelser har vist sammenhængen mellem ovariecancer progression (dvs. metastase) og tilstedeværelsen af ctcs2,3,4. Den mest almindeligt forekommende metode til påvisning og isolering af Ctc'er udnytter Cellsearch-systemet, som er rettet mod EpCam-receptoren5. EpCam udtryk, dog, er nedreguleret i epitelial til mesenchymal overgang, som har været impliceret i kræft metastaser6. Trods forskud, nuværende kliniske teknologier stadig lider af lav nøjagtighed, høje omkostninger, og kompleksitet. På grund af disse ulemper, nye teknologier til opdagelse og optælling af æggestokkene CTCs er blevet et vigtigt område for forskning.
For nylig opstod pafc som en effektiv metode til ikke-invasiv påvisning af kræftceller, analyse af nanomaterialer og identifikation af bakterier7,8,9. PAFC adskiller sig fra traditionel fluorescens flow cytometri ved at detektere analytter i flow ved at udnytte foto akustik. Den foto akustiske effekt genereres, når laserlys absorberes af et materiale, der forårsager termo elastisk ekspansion, producerer en akustisk bølge, der kan påvises ved en ultralyd transducer10,11. Fordele ved pafc over traditionelle flow cytometri metoder omfatter enkelhed, nem oversættelse til kliniske indstillinger, og påvisning af ctcs på hidtil uset dybder i patientprøver12,13. Nylige undersøgelser har udnyttet pafc systemer til påvisning af celler ved hjælp af endogene og eksogene kontrast14,15. I nærheden af infrarød (NIR) lysabsorberende kontrastmidler såsom indocyaningrøn farvestof og metal NPS (f. eks. guld og CuS) er blevet anvendt til selektiv mærkning af celler og væv i kombination med foto akustisk billeddannelse16,17,18. På grund af den forbedrede indtrængningsdybde af NIR-lys i biologisk væv kan foto akustisk detektion af absorbenter udføres ved større dybder til kliniske anvendelser. På grund af det store potentiale for brug i klinikken har kombinationen af målrettede NIR-kontrastmidler med PAFC skabt betydelig interesse for påvisning af Ctc'er.
PAFC i kombination med målrettede kontraststoffer giver en forbedret tilgang til analyse af patientprøver med høj gennemløb med forbedret nøjagtighed og målrettet påvisning af Ctc'er. En af de vigtigste detekterings strategier for Ctc'er er den specifikke målretning af membran proteiner, der findes på cellen af interesse. En bemærkelsesværdig egenskab ved æggestokkene CTCs er over ekspression af folatreceptorer placeret på deres ydre membran19. Folatreceptor målretning er en ideel strategi for identifikation af æggestokkene Ctc'er i blodet, fordi endogene celler, som har højere ekspression af folinsyre receptorer, generelt er luminale og har begrænset eksponering for blodbanen20. Kobber sulfid NPs (CuS NPs) er for nylig blevet anerkendt for deres evne til at målrette folatreceptorer udtrykt på kræftceller21. Kombineret med deres biokompatibilitet, lethed af syntese, og absorption dybt i NIR, disse NP kontrastmidler gøre en ideel målretning strategi for påvisning af æggestokkene CTCs udnytte PAFC.
Dette arbejde beskriver forberedelsen af FA-CuS NPs og deres anvendelse til påvisning af kræftceller i æggestokkene i et foto akustisk flow system. CuS NPs modificeres med folinsyre til specifikt at målrette ovarie Ctc'er og udsender et foto akustisk signal, når det stimuleres med en 1.053 nm-laser. Resultaterne viser den vellykkede påvisning af kræftceller i æggestokkene inkuberet med disse foto akustiske kontrastmidler i PAFC systemet. Disse resultater viser påvisning af kræftceller i æggestokkene ned til koncentrationer på 1 celle/μL, og Fluorescens mikroskopi bekræfter en vellykket optagelse af disse partikler af SKOV-3 ovariecancerceller22. Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af FA-CuS NPs syntese, forberedelse af prøver til fluorescens mikroskopi, opførelse af det foto akustiske flow system, og den foto akustiske påvisning af æggestokkene cancerceller. Den præsenterede metode viser vellykket identifikation af æggestokkene CTCs i flow udnytte FA-CuS NPs. det fremtidige arbejde vil fokusere på den kliniske anvendelse af denne teknologi i retning af tidlig påvisning af ovariecancer metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nanopartikel syntese og funktionalisering
Bemærk: syntesen af FA-CuS-NPs opnås ved hjælp af en enkelt pulje syntesemetode, der er tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol21.
Forsigtig: al syntese bør forekomme i en ventileret kemisk røg hætte.
- Før syntese filtreres ca. 300 mL deioniseret (DI) vand, dog med et 0,2 μm sterilt filter.
- Rengør en 250 mL glas rund bund kolbe med en vaskemiddel opløsning, og skyl med DI-vand. Der tilsættes 0,0134 g CuCl2 til 100 ml di vand for at skabe en 1 mm opløsning.
- Der tilsættes 0,015 g folinsyre (FA) til CuCl2 -opløsningen, og der omrøres i ~ 5 min. ved hjælp af en magnetisk Stir-stang.
- Tilsæt na2s · 9h2O (0,024 g i 100 μl di vand) over ca. 10 s til reaktionsblandingen ved hjælp af en pipette på 200 μl.
Bemærk: ved tilsætning af na2S · 9h2O, vil opløsningen skifte farve fra en lysegul til en mørk brun. - Sæt hætten på reaktionen og Placer den i et oliebad, der er indstillet til 90 °C, og Fortsæt omrøring med en magnetisk rørestang. Efter ca. 15 min., eller når olie badet har nået 85 − 90 °C, skal reaktionen fortsættes i en ekstra time. Din blanding bør gradvist vende sig til en mørk grøn farve.
Bemærk: Sørg for at udlufte systemet, mens du opvarmer reaktionsblandingen for at undgå tryk ophobning. - Fjern reaktionsbeholderen fra olie badet, og Afkøl kortvarigt ved stuetemperatur i ca. 10 til 15 minutter, før den overføres til et isbad.
- Når reaktionsblandingen er afkølet til under 20 °C, justeres pH til 10 ved hjælp af 1M NaOH for at opløse den resterende folinsyre i opløsningen.
- Renser FA-CuS-reaktionsblandingen ved hjælp af en 30 kDa-Centrifugerings kolonne. Tilsæt opløsningen i 15 mL batcher til kolonnen og centrifugeres ved 3.082 x g i 15 minutter.
- Når alle reaktionsblandingen er koncentreret, skal de koncentrerede fraktioner omkombineres og vaskes 4X med 15 mL pH 10 NaOH i 30 kDa-Centrifugerings søjlen.
- For masse målinger tages 1/3 af opløsningen (~ 66 μL) og opdeles i tre hætteglas. Tør i en vakuum ovn natten over ved 40 °C under et vakuum på ~ 27 mmHg.
- Den anden 2/3 af den koncentrerede opløsning opløses i 250 μL PBS og opbevares ved 4 °C indtil videre anvendelse.
- Før du bruger FA-CuS NPs, sonikatere dem i 30 minutter i et bad sonicator på en høj indstilling.
2. NP-karakterisering
- Udfør dynamisk lysspredning (DLS) Tilsæt 10 μL koncentreret FA-CuS-NPS i PBS-opløsning fra trin 1.1.14 til 2 mL DI-vand. Før karakterisering af DLS, sonikatere partiklerne i 30 minutter i et bad sonicator på en høj indstilling og filtrere gennem et 0,2 μm sterilt filter for at fjerne resterende støv.
- Udfør transmission elektronmikroskopi (TEM): Tilsæt 10 μL koncentreret FA-CuS NPS i PBS-opløsning til et stykke voks papir. Inverter en formvar belagt kobber gitter på toppen af dråben og lad sidde i 2 min. Berør kanten af formvar-coated gitteret til et stykke filtrerpapir for at fjerne overskydende væske. Lad lufttørre. Billede kobber gitteret udnytte en elektronmikroskop ved en accelererende spænding på 80 kV.
Bemærk: typiske resultater fra FA-CuS NPS-karakterisering vises i figur 1.
3. cellekultur
- Denne protokol udnytter SKOV-3 celler. Medmindre andet er angivet, er kultur SKOV-3 celler i Mccoy's 5A-medium suppleret med 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin og opretholder ved 37 °C i en befuret 5% CO2 -inkubator.
4. fluorescerende mærkning af FA-CuS NPS til mikroskopi
- Tilføj Texas-Red-X succinimidyl ester (0,2 mg opløst i DMSO i en koncentration på 10 mg/mL) til en opløsning, der indeholder 2 mg FA-CuS NPs i 1 mL 0,1 M NaHCO3 (pH ~ 9) buffer.
- Reaktionsblandingen omrøres ved hjælp af en magnetisk Stir stang i 1 time, væk fra lys ved stuetemperatur.
- Reaktionsblandingen koncentreres i en 4 mL 30 kDa MWCO Centrifugerings kolonne ved centrifugering ved 4.000 x g i 10 min.
- Den koncentrerede opløsning 3x vaskes med 4 mL 0,1 M NaHCO3 buffer (pH ~ 9) i en Centrifugerings søjle. Derefter vaskes den koncentrerede opløsning med 4 ml di vand 3x, eller indtil der kun er en spor mængde fluorescens synlig i strømning af UV-Vis.
5. FA-CuS NPS optagelse af kræftceller i æggestokkene
- Før inkubation med FA-CuS NPs, Inkuber SKOV-3 celler i en T75 kolbe med 8 − 15 mL folic-syrefri RPMI-1640-medier med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin i mindst 24 timer.
- Frøceller i 0,5 mL folinsyre-fri RPMI-1640 komplette vækstmedier med en densitet på 0,1 x 106 celler/ml til en 24 brønd plade.
- Den følgende dag Inkuber cellerne med 400 μg/mL FA-CuS NPS i 0,5 mL folinsyre-fri RPMI-1640 komplette vækstmedier i 2 timer.
- Efter denne inkubation, trypsinize cellerne med 0,5 mL af 0,25% trypsin med EDTA. Tilsæt mindst 1 mL folic-syrefri RPMI-1640 komplet vækstmedie for at neutralisere trypsin, og centrifuger cellerne ved 123 x g i 6 min.
- Supernatanten fjernes, resuspenderes cellerne i 2 mL PBS, og centrifugeres ved 123 x g i 6 min. Udfør dette vaske trin 2x for at fjerne ubundne NPS.
- Cellerne opslæmmes i 1 − 2 mL PBS med 2% Tween opløsning.
- Tæl cellerne ved hjælp af en hemocytometer og trypan og et blå. Yderligere fortyndede celler, hvis celletal er for højt. Fortyndet celler i PBS med 2% Tween til den valgte koncentration til påvisning.
- Cellerne er nu klar til at blive analyseret af PAFC systemet.
6. Fluorescens mikroskopi af optagelse af FA-CuS NPS
- Gentag trinene i trin 5,1, og Fortsæt med protokollen nedenfor for at få vist mikroskopi.
- Frøceller med en densitet på 0,1 x 106 celler/mL i 0,5 ml folinsyre-fri rpmi-1640 komplette vækstmedier på glas dæksedler i en 24 brønd plade.
- Den følgende dag Inkuber cellerne med fluorescently mærkede FA-CuS NPs i tre eksemplarer, i koncentrationer på 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL og 400 μg/mL i 0,5 mL folic-syrefri RPMI-1640 komplette vækstmedier.
- Cellerne inkubates med NPs i 2 timer i 37 °C-inkubatoren
- Efter denne inkubationsperiode vaskes cellerne 3x med PBS.
Bemærk: for alle vaske trin skal du forsigtigt tilføje opløsningen på siden af brønd pladen for ikke at forstyrre cellerne. Efter tilsætning, forsigtigt vippe pladen og trække opløsningen fra siden af brønden. - Cellerne inkubates med 0,5 mL 3,7% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 15 minutter og overføres glas dæksedlerne til en ny 24-brønd plade.
Forsigtig: PFA er et kendt carcinogen. Gør alle fiksering i en ventileret kemisk røg hætte og bære passende personlige værnemidler. - Cellerne inkubates i en opløsning på 3,7% PFA med 0,1% Triton-X i PBS i 5 min.
- Cellerne vaskes med 0,5 mL PBS 3x i 5 minutter hver, og dæksedlerne overføres til en ny plade.
- Cellerne inkubates med 0,5 mL af en PBS-opløsning indeholdende DAPI (20 μL/mL af en 0,5 mg/mL stamopløsning anvendes til farvning) i 5 min., væk fra lys.
- Vask cellerne med PBS 3x.
- Efter den endelige PBS-vask monteres dæksedlerne på slides med monterings medium.
- Cellerne er nu klar til at blive afbildet af Fluorescens mikroskopi. Figur 2 viser et eksempel på typisk celle karakterisering ved Fluorescens mikroskopi.
7. arkitektur af flow system
- Flow kammer konstruktion
Bemærk: en SolidWorks-fil af en 3D-udskrevet flow tank kan findes i de supplerende materialer.- Ved hjælp af den medfølgende SolidWorks-fil udskriver 3D flow beholderen med ABS termoplastisk eller PLA plastic. Dimensioner er angivet nedenfor, hvis SolidWorks ikke er tilgængelig. Figur 3a viser en gengivelse af denne model. Kroppen af flow tanken er 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De fjerneste ender af strømnings tanken omfatter huller på ca. 5 mm i diameter for at give mulighed for optagelse af slanger, der indeholder Kapillarrøret.
Bemærk: flow tanken har et 1 cm hul, vinkelret på retningen af Kapillarrøret, for placering af ultralyds transduceren. En cylindrisk ekstrudering med samme indvendige diameter som hullet strækker sig 6 mm ind i tanken. Til realtidsscanning har flow beholderen et 1 mm x 3 mm slot direkte under Kapillarrøret. - Når du har udskrevet 3D-gennemstrømnings beholderen, skal du rengøre og samle systemet til brug.
- Placer glas dæksler over 1 mm x 3 mm-åbningen og 1 cm hullet i flow systemet.
- Forsegl forsigtigt med silikone for at forhindre lækage.
- Monter Kapillarrøret i silikone hærdede rør. Indsæt rørene i strømnings kammeret, selv om siden af strømnings beholderen, således at glasset Kapillarrøret er direkte over og foran 3 mm slot og 1 cm hul.
- Forsegl slangen ved hjælp af silikone for at forhindre lækage.
- Ved hjælp af den medfølgende SolidWorks-fil udskriver 3D flow beholderen med ABS termoplastisk eller PLA plastic. Dimensioner er angivet nedenfor, hvis SolidWorks ikke er tilgængelig. Figur 3a viser en gengivelse af denne model. Kroppen af flow tanken er 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De fjerneste ender af strømnings tanken omfatter huller på ca. 5 mm i diameter for at give mulighed for optagelse af slanger, der indeholder Kapillarrøret.
- Opsætning af photoacoustic flow system
Bemærk: figur 3B og figur 3C viser et eksempel på flow systemets arkitektur.- Tilslut transduceren til en ultralyds pulser/-modtager. Amplificere signalet med en 59 dB gevinst.
- Forbind outputtet af filteret til en multipurpose rekonfigurerbar oscilloskop udstyret med en indbygget felt programmerbar Gate array.
- Tilslut et af rørene fra strømnings kammeret til et T-kryds, der er forbundet med to sprøjtepumper i hver gren.
- Fyld en af sprøjte pumperne med luft og den anden pumpe med prøven, der skal analyseres. Pumpen med luft til en strømningshastighed på 40 μL/min og den pumpe, der indeholder prøven, indstilles til en strømningshastighed på 20 μL/min. Det resulterende tofasede flow vil producere prøvevolumener på 1 μL. Ved denne strømningshastighed vil systemet teste ca. 6,4 prøver pr. minut.
Bemærk: for at opretholde en ensartet fordeling af celler, skal du let vortex hver prøve umiddelbart før den testes. Derudover skal du rotere sprøjten hvert par minutter for at forhindre cellerne i at bosætte sig i opløsningen. - det resterende rør, der forlader flow systemet, til en beholder med 10% blegemiddel for at bortskaffe celler, efter at de har afsluttet flow systemet.
Bemærk: før du udnytter flow systemet, kontrollere for lækager, da disse kan påvirke strømmen. Cellerne skal være indeholdt i et lukket system for at opretholde biologisk sikkerhed under proceduren. - Designet af den 3D trykte tank giver mulighed for konsekvent og gentagelig justering mellem transduceren og laserlys med minimal kalibrering. Når den placeres korrekt i den brugerdefinerede tank, sikrer kvarts Kapillarrøret, at transduceren og laseren er direkte justeret.
- Placer den del af kvarts Kapillarrøret i direkte tilpasning med transduceren, i synsfeltet af mikroskopet, der giver mulighed for omhyggelig placering af den optiske fiber over prøven, således at det lyser hele bredden af røret.
- Irradiate prøven ved hjælp af en optisk fiber kanalisering en diode-pumpet solid state laser opererer ved en bølgelængde på 1.053 nm. Den laserlys hændelse på prøven og transduceren, der bruges til at måle den foto akustiske effekt, er begge ufokuserede.
- Energien af laser hændelsen på prøven er ca. 8 mJ og 10 Hz laser hastighed er tilstrækkelig til at belyse hver prøve flere gange, da den passerer gennem systemet.
- Placer flow systemet oven på et inverteret mikroskop, og sørg for, at både laser pulsen og prøvens sti er synlige, når prøven passerer gennemstrømnings systemet. Optag flow ved hjælp af et mikroskop monteret kamera.
- Optag ultralyds anskaffelserne ved hjælp af dataindsamling software (Se tabel over materialer). Udløse ultralyd og pulserende laser ved hjælp af FPGA. Anvender PBS med 2% Tween og FA-CuS NPs i en koncentration på 100 μg/mL i PBS 2% Tween, som henholdsvis negativ og positiv kontrol.
- Udnytte et mikroskop-monteret kamera, registrere både fyring af laseren og passage af prøver selv om flow system. Disse optagelser vil blive udnyttet til at korrelere det akustiske signal registreret af transduceren med fyring af laseren. Da prøverne passerer foran fyringen af laseren, kan signalet derefter korreleres med det resulterende foto akustiske signal til analyse. Ved en samplingfrekvens på 10 Hz lyser laseren hvert stik flere gange.
8. efter behandling
- For hver signal erhvervelse, s (t), beregne Hilbert transformation, H [s (t)], for at skabe et analytisk signal.
- Opret en kompleks konvolut, se(t), ved at beregne størrelsen af det analytiske signal, sådan at og
integrere konvolutten til at måle det samlede signal, der følger af hver erhvervelse. Sammenlign signalerne fra hver testgruppe (dvs. PBS, mærkede celler, FA-CuS NPs, celler alene) ved hjælp af en t-test i R statistisk software. RAW-foto akustiske signaler og deres Hilbert-transformationer vises i figur 4. - For billed rekonstruktion skal du normalisere den komplekse konvolut baseret på den maksimale højde over hele kørslen. Hvis du sammenligner en serie kørsler, normalisere den komplekse konvolut ved hjælp af den maksimale Peak på tværs af hele serien. Efter normalisering, konvertere hver erhvervelse til en serie af pixelværdier. Repræsentere hver serie af pixelværdier som en kolonne i billed genopbygningen. Repræsentative rekonstruktioner af PBS og FA-CuS NPs-signalerne vises i figur 5, hvor begge billeder blev normaliseret ved hjælp af den maksimale top på tværs af begge kørsler.
integrere konvolutten til at måle det samlede signal, der følger af hver erhvervelse. Sammenlign signalerne fra hver testgruppe (dvs. PBS, mærkede celler, FA-CuS NPs, celler alene) ved hjælp af en t-test i R statistisk software. RAW-foto akustiske signaler og deres Hilbert-transformationer vises i figur 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a viser et typisk tem billede af de syntetiserede nanopartikler. Den gennemsnitlige størrelse af den typiske nanopartikel er ca. 8,6 nm ± 2,5 nm. Nanopartikel måling blev udført i ImageJ. Der blev anvendt tærskel-og vandskule funktioner til at adskille partiklerne til måling. De horisontale og lodrette diametre af hver partikel blev målt vinkelret på hinanden og yderligere gennemsnit. For DLS er en repræsentativ måling vist i figur 1B. Den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter for disse partikler er 73,6 nm. Kobber sulfid nanopartikler har en karakteristisk absorbans kurve, som strækker sig ind i NIR, som vist i figur 1C. Der er en lille artefakt omkring 850 nm, der var forårsaget af skiftet af lasere ved Spektrofotometer.
Fluorescens mikroskopi billeder af celler inkuberet med fluorescently mærkede nanopartikler kan ses i figur 2. Nanopartikel optagelse kan visualiseres ved tilstedeværelsen af fluorescens på tværs af cellen. Celler, der ikke inkuberet med nanopartikler, viser intet fluorescens signal. Tilstedeværelsen af dette fluorescens signal indikerer den vellykkede optagelse af partiklerne og deres evne til at blive detekteret i flow systemet.
Figur 3 viser den generelle opsætning af det fotoakustiske flow system. Figur 3a viser en detaljeret model af 3D flow kammeret. Dette kammer kan udskrives ved hjælp af den. STL-fil, der leveres med denne protokol. Figur 3B viser en oversigt over opsætningen af flow tanken. Figur 3C viser en generel opsætning af flow tanken og dataindsamlingssystemet.
Typiske dataindsamlings signaler vises i figur 4. De rå data angiver forskellene i signalet mellem nanopartikel-mærkede celler, PBS og FA-CuS-NPs. En erhvervelse er det resulterende foto akustiske signal genereret fra en enkelt laser puls. På grund af den hurtige affyringshastighed af laseren, hver prøve analyseret genererer flere opkøb. En konvolut for hver enkelt erhvervelse blev genereret ved hjælp af Hilbert transformation. Denne konvolut blev integreret for at måle den totale mængde signal genereret fra laser pulsen. I en tidligere undersøgelse, disse data blev analyseret ved hjælp af R statistisk software, hvor antallet af opkøb analyseret for t-test var 203, 150, 160, og 131, for celler med NPs, celler alene, PBS, og NPs alene, henholdsvis22. Dataene blev normaliseret ved log transformation og sammenlignede udnytte en welchs t-test i R. Signalerne som følge af FA-CuS NPs alene i en koncentration på 100 μg/mL viste et meget højere signal end den negative kontrol. Forskellen i signalerne mellem den negative kontrol og de mærkede æggestokkene Ctc'er var mere subtile end den positive kontrol, men kunne påvises gennem analyse af deres midler ved en t-test22.
Ved hjælp af Custom LabView og MATLAB software, billede rekonstruktioner blev lavet af de positive og negative kontroller i realtid og efter erhvervelse, hhv. For at generere de foto akustiske rekonstruktioner blev en konvolut af hver erhvervelse beregnet ved hjælp af Hilbert transformation. Individuelle konvolutter blev efterfølgende konverteret til pixelværdier og vist som uafhængige kolonner. Der opstår tydelige forskelle i foto akustisk signal mellem FA-CuS-NPs i en koncentration på 100 μg/mL og PBS-prøven (figur 5). Kontrol af systemet er vigtigt at køre for at sikre, at systemet er tilstrækkeligt producerer foto akustisk signal, der kan detekteres af transduceren.
Figur 1: repræsentativ NP-karakterisering. (A) tem billede af SYNTETISEREDE FA-CuS NPS. Scale bar = 50 nm. B) repræsentativ DLS-intensitets fordeling af SYNTETISEREDE FA-CUS-NP'er.C) repræsentative FA-CUS NPS-absorbans-kurve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ Fluorescens-mikroskopi billeder af skov-3-celler. Cellerne blev inkuberet med og uden 400 μg/mL fluorescently-mærkede NPs. Scale bar = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative billeder af foto akustisk flow flowcytometri system og flow kammer. (A) detaljeret visning af 3D trykte flow kammer. B) diagram over pafc-systemet. (C) flow systemarkitektur: SP = sprøjtepumpe; DAQ/FPGA = data erhvervelse/felt programmerbar Gate array; OB = objektiv linse; AF = optisk fiber; FC = fiber kobling; UT = ultralyd transducer; FT = flow tank. Dette tal er tilpasset fra Lusk et al.22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentativt rådata signal og Hilbert-transformationer af prøver, som er testet i flow systemet. A) repræsentativt rådata signal fra PBS og celler, der er inkuberet med NPS, og (D) Hilbert-transformation af dataene. B) repræsentativt rådata signal fra cellerne alene og de celler, som inkuberes med FA-CuS NPS ogE) Hilbert-transformeringen af dataene. C) repræsentativt rådata signal fra PBS og 100 μg/ml FA-CuS NPS ogf) Hilbert-transformationen af dataene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative foto akustiske billed rekonstruktioner af de foto akustiske data. A) billed rekonstruktion af 100 μg/ml FA-CuS NPS og (B) PBS testet i strømnings systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: flow kammer STL. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er en enkel metode til påvisning af ovarie Ctc'er, der udnytter PAFC og et målrettet CuS-kontrastmiddel. Mange metoder er blevet udforsket til påvisning af æggestokkene ctcs, herunder mikrofluidisk enheder, RT-PCR, og fluorescens flow flowcytometri23,24,25. Disse spænder i kompleksitet, omkostninger og nøjagtighed, begrænser deres effektivitet i kliniske indstillinger. PAFC introducerer flere fordele i forhold til disse traditionelle metoder til påvisning af Ctc'er, herunder evnen til at detektere Ctc'er inden for patientprøver og dens lette oversættelse til in vivo-applikationer. Det er også påvist, at pafc nøjagtigt detekterer ctcs in vitro og in vivo, når det kombineres med målrettede kontrastmidler26,27.
I dette arbejde blev FA-CuS NP-kontraststoffer evalueret for deres evne til at forbedre nøjagtigheden af CTC-detektion ved fysiologisk relevante koncentrationer. Der blev udført undersøgelser med isolerede SKOV-3 celler resuspenderet i PBS. Analyse ved Fluorescens mikroskopi indikerede den vellykkede optagelse af disse partikler. Resultaterne detekterede SKOV-3 celler ned til en koncentration på 1 celle/μL22. Afgørende skridt i denne protokol involverer nanopartikel syntese og tilpasningen af den foto akustiske flow setup. Under nanopartikel syntese, er det vigtigt at sikre, at opløsningen har vendt en mørk grøn farve, før du fjerner blandingen fra olie badet. For flow systemet, der kører en negativ og positiv kontrol, selv om systemet forud for prøvetestning er nødvendig for at sikre, at systemet producerer passende foto akustisk signal til efterfølgende påvisning af mærkede celler. Mens du kører flow systemet, er det vigtigt at sikre, at hændelsen lys fra fiberoptisk er helt lysende Kapillarrøret, og at transduceren er tætsiddende mod siden af strømnings kammeret. Endelig er det nødvendigt med en grundig afprøvning af systemet for lækager for at sikre systemets biologiske sikkerhed og for en ensartet gennemstrømning i kammeret.
For det nuværende PAFC-system bekræftede indledende undersøgelser foto akustisk detektion ved hjælp af transducer-og forstærknings systemet. De fleste af disse signaler bestod af lavere frekvens signaler (< 20 MHz). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bekræfte, om dette skyldes den faktiske hyppighed af de genererede foto akustiske signaler eller 35 MHz båndbredde af forstærkeren. Fremtidige undersøgelser vil undersøge de frekvens komponenter af de detekterede signaler for at optimere den centrale frekvens af transduceren samt båndbredden af forstærknings systemet. Det nuværende system er specielt egnet til ex vivo-påvisning af Ctc'er. Denne metode identificerer imidlertid potentialet for fremtidig anvendelse af FA-CuS-NPs in vivo.
Fremtidige undersøgelser har til formål at detektere kræftceller i æggestokkene inden for blandede kulturer, humane kliniske prøver og in vivo-modeller28,29,30. Desuden vil fremtidige undersøgelser undersøge specificiteten af disse nanopartikler versus ikke-målrettede kontroller. Fremtidig validering af denne metode vil omfatte afprøvning af dette værktøj med humane kliniske prøver, gennemførelse af høj gennemløb test og analyse, og oversættelse til kliniske indstillinger. Denne foto akustiske teknik viser muligheden for fremtidig oversættelse til en lang række kliniske anvendelser og sygdomme på tværs af en række kontraststoffer og analytter. Foto akustisk detektion af analytter, som udnytter PAFC, har potentialet til at gøre det hurtigere og billigt at påvise Ctc'er og andre patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Madeleine Howell for hendes hjælp med syntese, Matthew Chest for hans hjælp til at designe flow systemet, og Ethan Marschall for at få hjælp til SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
