Summary
Een protocol wordt gepresenteerd voor het detecteren van circulerende ovariële tumorcellen met behulp van een op maat gemaakte photoacoustic flow systeem en gerichte foliumzuur-afgetopte koper sulfide nanodeeltjes.
Abstract
Veel studies suggereren dat de opsomming van circulerende tumorcellen (Ctc's) belofte als een prognostisch instrument voor ovariële kanker kan tonen. De huidige strategieën voor de detectie van Ctc's omvatten Flowcytometrie, microfluïdische apparaten en real-time polymerase kettingreactie (RT-PCR). Ondanks recente vooruitgang, methoden voor de detectie van vroege ovariële kanker metastasen nog steeds ontbreekt de gevoeligheid en specificiteit die nodig zijn voor klinische vertaling. Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor de detectie van ovariële circulerende tumorcellen door photoacoustic flow cytometrie (PAFC) met behulp van een aangepast driedimensionaal (3D) gedrukt systeem, met inbegrip van een stroom kamer en spuitpomp. Deze methode gebruikt foliumzuur-afgetopte koper sulfide nanodeeltjes (FA-CuS NPs) om SKOV-3 ovariële kankercellen te targeten door PAFC. Dit werk toont de affiniteit van deze contrastmiddelen voor ovariële kankercellen. De resultaten tonen NP-karakterisering, PAFC-detectie en NP-opname door fluorescentiemicroscopie, waardoor het potentieel van dit nieuwe systeem om ovariële Ctc's op te sporen op fysiologisch relevante concentraties wordt aangetoond.
Introduction
Ovariële kanker is een van de dodelijkste gynaecologische maligniteiten en resulteerde in een geschatte 184.800 sterfgevallen wereldwijd in 20181. Meerdere studies hebben aangetoond dat de correlatie tussen ovariële kanker progressie (d.w.z. metastasen) en de aanwezigheid van ctc's2,3,4. De meest gebruikte methode voor detectie en isolatie van Ctc's maakt gebruik van het Cellsearch systeem, dat de EpCam receptor5richt. EpCam expressie, echter, is gedowngereguleerd in epitheliale naar mesenchymale overgang, die is betrokken bij kanker metastasen6. Ondanks vooruitgang, huidige klinische technologieën nog steeds lijden aan lage nauwkeurigheid, hoge kosten, en complexiteit. Vanwege deze nadelen, nieuwe technologieën voor de ontdekking en opsomming van ovariële Ctc's is uitgegroeid tot een belangrijk gebied voor onderzoek.
Onlangs ontstond pafc als een effectieve methode voor de niet-invasieve detectie van kankercellen, analyse van nanomaterialen en identificatie van bacteriën7,8,9. PAFC verschilt van traditionele fluorescentie flow cytometrie door het detecteren van analyten in stroming door gebruik te maken van photoacoustics. Het photoacoustic-effect wordt gegenereerd wanneer laserlicht wordt geabsorbeerd door een materiaal dat thermoelastische expansie veroorzaakt, wat een akoestische Golf produceert die kan worden gedetecteerd door een ultrasone transducer10,11. Voordelen van pafc over traditionele Flowcytometrie methoden zijn eenvoud, eenvoudig vertalen naar klinische instellingen, en de detectie van ctc's op ongekende diepten in patiënt monsters12,13. Recente studies hebben gebruikt pafc systemen voor de detectie van cellen met behulp van endogene en exogene contrast14,15. In de buurt van infrarood (NIR) lichtabsorberende contrastmiddelen zoals indocyanine Green Dye en Metal NPs (bijv. goud en cus) zijn gebruikt voor het selectief labelen van cellen en weefsels in combinatie met foto akoestische beeldvorming16,17,18. Als gevolg van de verbeterde penetratie diepte van NIR-licht binnen biologische weefsels, kan fotoakoestische detectie van absorbers worden uitgevoerd op grotere diepten voor klinische toepassingen. Vanwege het grote potentieel voor gebruik in de kliniek heeft de combinatie van gerichte NIR contrastmiddelen met PAFC aanzienlijke belangstelling voor de opsporing van Ctc's opgeleverd.
PAFC in combinatie met gerichte contrastmiddelen biedt een verbeterde aanpak voor analyses met een hoge doorvoer van patiënt monsters met verbeterde nauwkeurigheid en gerichte detectie van Ctc's. Een van de belangrijkste detectie strategieën voor Ctc's is de specifieke targeting van membraan eiwitten die aanwezig zijn op de cel van belang. Een opmerkelijk kenmerk van ovariële ctc's is de overexpressie van folaat receptoren gelegen op hun buitenste membraan19. Folate receptor targeting is een ideale strategie voor de identificatie van ovariële Ctc's in het bloed omdat endogene cellen, die een hogere expressie van foliumzuur receptoren hebben, over het algemeen luminal zijn en beperkte blootstelling aan de bloedbaan20. Koper sulfide NPs (cus NPS) zijn onlangs erkend voor hun vermogen om te richten folaat receptoren uitgedrukt op kankercellen21. Gecombineerd met hun biocompatibiliteit, het gemak van synthese en de absorptie diep in de NIR, maken deze NP-contrast agenten een ideale targetingstrategie voor de detectie van ovariële Ctc's die gebruikmaken van PAFC.
Dit werk beschrijft de voorbereiding van FA-CuS NPs en het gebruik ervan voor de detectie van ovariële kankercellen in een photoacoustic flow-systeem. CuS NPs worden gemodificeerd met foliumzuur specifiek doelwit ovariële Ctc's en uitzenden van een photoacoustic signaal wanneer gestimuleerd met een 1.053 nm laser. De resultaten duiden op de succesvolle detectie van ovariële kankercellen geïnhaleerd met deze fotoakoestische contrastmiddelen binnen het PAFC-systeem. Deze resultaten tonen de detectie van ovariële kankercellen tot concentraties van 1 cel/μL, en fluorescentiemicroscopie bevestigt succesvolle opname van deze deeltjes door SKOV-3 ovariële kankercellen22. Dit werk biedt een gedetailleerde beschrijving van de FA-CuS NPs synthese, voorbereiding van monsters voor fluorescentiemicroscopie, de bouw van het photoacoustic flow-systeem, en de photoacoustic detectie van ovariële kankercellen. De gepresenteerde methode toont een geslaagde identificatie van ovariële Ctc's in de stroom met behulp van FA-CuS NPs. toekomstig werk zal zich concentreren op de klinische toepassing van deze technologie op de vroegtijdige opsporing van ovariële kanker metastasen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. synthese en Functionalisatie van nanodeeltjes
Opmerking: synthese van de FA-CuS NPs wordt bereikt met behulp van een One-pot synthesemethode aangepast uit een eerder gepubliceerde protocol21.
Let op: alle synthese moet plaatsvinden in een geventileerde chemische rook afzuigkap.
- Vóór de synthese, filter ongeveer 300 mL gedeïoniseerd (DI) water al een 0,2 μm steriele filter.
- Reinig een ronde bodem kolf van 250 mL met een wasmiddel oplossing en spoel af met DI-water. Voeg 0,0134 g CuCl2 toe aan 100 ml di water om een 1 mm oplossing te creëren.
- Voeg 0,015 g foliumzuur (FA) toe aan de CuCl2 -oplossing en roer gedurende ~ 5 minuten door middel van een magnetische roerstaaf.
- Voeg na2s · 9h2O (0,024 g in 100 μL di water) over ongeveer 10 s toe aan het reactiemengsel met behulp van een pipet van 200 μL.
Opmerking: bij toevoeging van de na2S · 9h2O zal de oplossing van kleur veranderen van een licht geel naar een donker bruin. - Dop de reactie en plaats in een oliebad, ingesteld op 90 °C, en Blijf roeren met een magnetische roerstaaf. Na ongeveer 15 minuten, of wanneer het oliebad 85 − 90 °C heeft bereikt, laat u de reactie gedurende een extra uur doorgaan. Uw mengsel moet geleidelijk aan een donker groene kleur te veranderen.
Opmerking: Zorg ervoor dat u het systeem ontluchten tijdens het verwarmen van het reactiemengsel om druk ophoping te voorkomen. - Verwijder het reactievat uit het oliebad en laat ongeveer 10 tot 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat u overstapt op een ijsbad.
- Zodra het reactiemengsel onder de 20 °C is afgekoeld, past u de pH op 10 met 1M NaOH aan om het resterende foliumzuur op te lossen in oplossing.
- Reinig het FA-CuS-reactiemengsel met behulp van een 30 kDa-Centrifugeer kolom. Voeg oplossing toe in 15 mL batches aan de kolom en centrifugeer bij 3.082 x g gedurende 15 minuten.
- Zodra al het reactiemengsel is geconcentreerd, de geconcentreerde fracties opnieuw combineren en 4x wassen met 15 mL pH 10 NaOH in de 30 kDa-Centrifugeer kolom.
- Voor massametingen neemt u 1/3 van de oplossing (~ 66 μL) en splitst u in drie glazen flesjes. Droog in een vacuüm oven 's nachts bij 40 °C onder een vacuüm van ~ 27 mmHg.
- Los de andere 2/3 geconcentreerde oplossing op in 250 μL PBS en bewaar deze bij 4 °C tot verder gebruik.
- Voorafgaand aan het gebruik van de FA-cus NPs, sonificeren ze voor 30 min in een bad sonicator op een hoge instelling.
2. NP-karakterisering
- Voer Dynamische lichtverstrooiing (DLS) toe 10 μL geconcentreerde FA-CuS NPS in PBS-oplossing van stap 1.1.14 tot 2 mL DI water. Voorafgaand aan de karakterisatie door DLS, soniceren de deeltjes gedurende 30 minuten in een bad-sonicator op een hoge instelling en filtreer door een 0,2 μm steriele filter om reststof te verwijderen.
- Voer transmissie Elektron microscopie (TEM): Voeg 10 μL geconcentreerde FA-CuS NPS in PBS-oplossing toe aan een stuk waspapier. Omkeren van een formvar gecoate koperen raster op de bovenkant van de druppel en laat zitten voor 2 min. Raak de rand van het raster met formvar gecoat aan op een stukje filtreerpapier om overtollige vloeistof te verwijderen. Laat de lucht drogen. Afbeelding van het koperen rooster met behulp van een elektronen microscoop bij een versnelde spanning van 80 kV.
Opmerking: typische resultaten van de FA-CuS NPS-karakterisering worden weergegeven in Figuur 1.
3. celcultuur
- Dit protocol maakt gebruik van SKOV-3 cellen. Tenzij anders vermeld, cultuur SKOV-3 cellen in Mccoy's 5A medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicillaire, en 100 μg/mL streptomycine, en onderhouden bij 37 °C in een bevoficeerde 5% CO2 incubator.
4. fluorescerende tagging van FA-CuS NPS voor microscopie
- Voeg Texas-Red-X succinimidyl Ester (0,2 mg opgelost in DMSO bij een concentratie van 10 mg/mL) aan een oplossing met 2 mg FA-CuS NPs in 1 mL 0,1 M NaHCO3 (pH ~ 9) buffer.
- Roer het reactiemengsel met behulp van een magnetische roerstaaf voor 1 uur, weg van het licht bij kamertemperatuur.
- Concentreer het reactiemengsel in een 4 mL 30 kDa MWCO-Centrifugeer kolom door te spinnen op 4.000 x g gedurende 10 minuten.
- Was de geconcentreerde oplossing 3x met 4 mL 0,1 M NaHCO3 buffer (pH ~ 9) in een centrifugeren kolom. Was vervolgens de geconcentreerde oplossing met 4 mL DI water 3x of totdat slechts een spoor hoeveelheid fluorescentie zichtbaar blijft in de doorstroom door UV-VIS.
5. FA-CuS NPS opname door ovariële kankercellen
- Voorafgaand aan de incubatie met FA-CuS NPs, incuberen SKOV-3 cellen in een T75 kolf met 8 − 15 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 media met 10% FBS en 1% penicillaire/streptomycine gedurende ten minste 24 uur.
- Zaadcellen in 0,5 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 complete groeimedia met een dichtheid van 0,1 x 106 cellen/ml in een 24-put.
- De volgende dag incuberen cellen met 400 μg/mL FA-CuS NPS in 0,5 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 complete groeimedia voor 2 uur.
- Na deze incubatie, trypsinize de cellen met 0,5 mL 0,25% trypsine met EDTA. Voeg ten minste 1 mL foliumzuur vrije RPMI-1640 complete groeimedia toe om de trypsine te neutraliseren en centrifugeer de cellen bij 123 x g gedurende 6 minuten.
- Verwijder het supernatant, hervat de cellen in 2 mL PBS en centrifugeer bij 123 x g gedurende 6 min. Voer deze Wash stap 2x uit om ongebonden NPs te verwijderen.
- Respendeer de cellen in 1 − 2 mL PBS met 2% tween-oplossing.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauw. Verdere verdunde cellen als de celtellingen te hoog zijn. Verdun cellen in PBS met 2% tween naar de gekozen concentratie voor detectie.
- De cellen zijn nu klaar om te worden geanalyseerd door het PAFC-systeem.
6. fluorescentiemicroscopie van FA-CuS NPS opname
- Herhaal de stappen die worden vermeld in stap 5,1 en ga verder met het onderstaande protocol voor microscopie.
- Zaadcellen met een dichtheid van 0,1 x 106 cellen/mL in 0,5 ml foliumzuur vrije rpmi-1640 volledige groeimedia op glazen dekstroken in een 24-put.
- De volgende dag incureren de cellen met fluorescently gelabelde FA-CuS NPs in triplicaat, in concentraties van 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, en 400 μg/mL in 0,5 mL foliumzuur vrije r-1640 complete groeimedia.
- Incuberen de cellen met de NPs voor 2 uur in de 37 °C-incubator
- Na deze incubatieperiode was de cel 3x met PBS.
Opmerking: Voeg voor alle wasstappen voorzichtig de oplossing aan de zijkant van de goed plaat toe om de cellen niet te storen. Na toevoeging, voorzichtig kantelen van de plaat en trek de oplossing van de zijkant van de put. - Inbroed de cellen met 0,5 mL 3,7% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten en breng de glazen dekstroken over naar een nieuwe 24-put.
Let op: PFA is een bekend kankerverwekkend. Doe alle fixatie in een geventileerde chemische rook afzuigkap en draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen. - Inincuberen de cellen in een oplossing van 3,7% PFA met 0,1% Triton-X in PBS gedurende 5 min.
- Was de cellen met 0,5 mL PBS 3x gedurende 5 minuten en breng de afdek stroken over naar een nieuwe plaat.
- Inbroed de cellen met 0,5 mL van een PBS-oplossing die DAPI bevat (20 μL/mL van een 0,5 mg/mL stamoplossing wordt gebruikt voor kleuring) gedurende 5 minuten, weg van het licht.
- Was de cellen met PBS 3x.
- Monteer de dekstroken op dia's met het afdekmedium na de laatste PBS-wassing.
- De cellen zijn nu klaar om te worden gefotografeerd door fluorescentiemicroscopie. Figuur 2 toont een voorbeeld van typische celkarakterisatie door fluorescentiemicroscopie.
7. flow systeemarchitectuur
- Stroom kamer constructie
Opmerking: een SolidWorks bestand van een 3D printed flow tank kan worden gevonden in de aanvullende materialen.- Met behulp van het meegeleverde SolidWorks bestand, 3D print de flow tank met ABS thermoplastisch of PLA plastic. Afmetingen worden hieronder gegeven als SolidWorks niet beschikbaar is. Figuur 3a toont een representatie van dit model. De carrosserie van de flow tank is 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De uiterste uiteinden van de stroom tank omvatten gaten met een diameter van ongeveer 5 mm om de toevoer van slangen met het capillaire buisje mogelijk te maken.
Opmerking: de stroom tank heeft een gat van 1 cm, loodrecht op de oriëntatie van de capillaire buis, voor de plaatsing van de ultrasone transducer. Een cilindrische extrusie met dezelfde binnendiameter als het gat strekt zich uit tot 6 mm in de tank. Voor real-time beeldvorming heeft de flow tank een sleuf van 1 mm x 3 mm direct onder de capillaire buis. - Na het afdrukken van de 3D-stroom tank, reinig en monteer het systeem voor gebruik.
- Plaats glazen dekstroken over de 1 mm x 3 mm sleuf en het 1 cm gat in het stroomsysteem.
- Zorgvuldig afdichten met siliconen om lekkage te voorkomen.
- Monteer de capillaire buis in de siliconen uitgeharde buizen. Steek de buizen in de stroom kamer, maar de zijkant van de stroom tank zodanig dat het Glazen capillair zich direct boven en voor de 3 mm sleuf en het 1 cm gat bevindt.
- Sluit de slang met behulp van siliconen om lekkage te voorkomen.
- Met behulp van het meegeleverde SolidWorks bestand, 3D print de flow tank met ABS thermoplastisch of PLA plastic. Afmetingen worden hieronder gegeven als SolidWorks niet beschikbaar is. Figuur 3a toont een representatie van dit model. De carrosserie van de flow tank is 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De uiterste uiteinden van de stroom tank omvatten gaten met een diameter van ongeveer 5 mm om de toevoer van slangen met het capillaire buisje mogelijk te maken.
- Photoacoustic flow systeem instellen
Opmerking: afbeelding 3B en afbeelding 3C geven een voorbeeld van de architectuur van het flow-systeem.- Sluit de transducer aan op een ultrasone pulser/ontvanger. Vergroot het signaal met een 59 dB Gain.
- Sluit de uitgang van het filter aan op een multifunctionele, herconfigureerbaar oscilloscoop uitgerust met een ingebouwde veld programmeerbare Gate Array.
- Sluit een van de buizen van de stroom kamer aan op een T-splitsing, verbonden met twee spuit pompen in elke tak.
- Vul een van de spuit pompen met lucht en de andere pomp met het te analyseren monster. Stel de pomp met lucht in op een debiet van 40 μL/min en de pomp met het monster tot een debiet van 20 μL/min. De resulterende tweefasige stroming zal een monstervolume van 1 μL produceren. Bij deze stroomsnelheid zal het systeem ongeveer 6,4 samples per minuut testen.
Opmerking: om een consistente verdeling van cellen te handhaven, licht Vortex elk monster onmiddellijk voordat het wordt getest. Draai de spuit bovendien om de paar minuten om te voorkomen dat de cellen in de oplossing gaan. - Verbind de overblijvende buis die het stroomsysteem verlaat naar een container met 10% bleekwater, om cellen weg te gooien nadat ze het stroomsysteem hebben verlaten.
Opmerking: Controleer vóór gebruik van het stroomsysteem op lekken, omdat deze de stroom kunnen beïnvloeden. De cellen moeten zich in een gesloten systeem bevinden om de biologische veiligheid tijdens de procedure te handhaven. - Het ontwerp van de 3D-gedrukte tank zorgt voor consistente en reproduceerbare uitlijning tussen de transducer en het laserlicht met minimale kalibratie. Wanneer de kwarts capillaire buis op de juiste wijze in de aangepaste tank wordt geplaatst, zorgt hij ervoor dat de transducer en de laser direct worden uitgelijnd.
- Plaats de sectie van het kwarts capillair in de directe uitlijning met de transducer, in het gezichtsveld van de Microscoop, waardoor een zorgvuldige plaatsing van de optische vezel boven het monster, zodat het verlicht de gehele breedte van de buis.
- Bestraleren van het monster met behulp van een optische vezel channeling een diode-gepompt Solid State Laser die werkt op een golflengte van 1.053 nm. Het laserlicht incident op het monster en de transducer gebruikt voor het meten van het photoacoustic effect zijn beide ongericht.
- De energie van het Laser incident op het monster is ongeveer 8 mJ en de 10 Hz Laser snelheid is voldoende om elk monster meerdere keren te verlichten als het door het systeem gaat.
- Plaats het stroomsysteem bovenop een omgekeerde Microscoop en zorg ervoor dat zowel de laserpuls als het pad van het monster zichtbaar zijn terwijl het monster het stroomsysteem passeert. Record stroom met behulp van een op Microscoop gemonteerde camera.
- Neem de ultrasone overnames op met behulp van Data Acquisition software (Zie tabel met materialen). Trigger echografie en gepulseerde laser met behulp van de FPGA. Gebruik PBS met 2% tween en FA-CuS NPs bij een concentratie van 100 μg/mL in PBS 2% tween, als negatieve en positieve controles, respectievelijk.
- Met behulp van een Microscoop gemonteerde camera, opnemen zowel het afvuren van de laser en de passage van monsters al het stroomsysteem. Deze opnames worden gebruikt om het akoestische signaal dat door de transducer is opgenomen te correleren met het afvuren van de laser. Als de monsters voor het afvuren van de laser passeren, kan het signaal worden gecorreleerd aan het resulterende foto-akoestische signaal voor analyse. Bij een samplingfrequentie van 10 Hz zal de laser elke stekker meerdere malen verlichten.
8. nabewerking
- Bereken voor elke signaal overname, s (t), de Hilbert-transformatie, H [s (t)], om een analytisch signaal te creëren.
- Creëer een complexe envelop, se(t), door de grootte van het analytische signaal te berekenen, zodanig
dat en integreer de envelop om het totale signaal dat voortvloeit uit elke overname te meten. Vergelijk de signalen van elke testgroep (d.w.z. PBS, gelabelde cellen, FA-CuS NPs, cellen alleen) met behulp van een t-toets in R statistische software. RAW-photoacoustic-signalen en hun Hilbert-transformaties worden weergegeven in Figuur 4. - Voorbeeld reconstructie Normaliseer de complexe envelop op basis van de maximale piek over de hele run. Als u een reeks uitvoeringen vergelijkt, normaliseert u de complexe envelop met de maximale piek over de gehele reeks. Na normalisatie converteert u elke overname naar een reeks pixelwaarden. Representeren elke reeks pixelwaarden als een kolom in de reconstructie van de afbeelding. Representatieve reconstructies van PBS en de FA-CuS NPs-signalen worden weergegeven in Figuur 5, waar beide afbeeldingen zijn genormaliseerd met behulp van de maximale piek over beide uitvoeringen.
dat en integreer de envelop om het totale signaal dat voortvloeit uit elke overname te meten. Vergelijk de signalen van elke testgroep (d.w.z. PBS, gelabelde cellen, FA-CuS NPs, cellen alleen) met behulp van een t-toets in R statistische software. RAW-photoacoustic-signalen en hun Hilbert-transformaties worden weergegeven in Figuur 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1a toont een typische tem-afbeelding van de gesynthetiseerde nanodeeltjes. De gemiddelde grootte van het typische nanodeeltjes is ongeveer 8,6 nm ± 2,5 nm. Het meten van nanodeeltjes werd uitgevoerd in ImageJ. Er werden drempel-en waterloods functies toegepast om de deeltjes voor de meting te scheiden. De horizontale en verticale diameters van elk deeltje werden loodrecht op elkaar gemeten en verder gemiddeld. Voor DLS wordt een representatieve meting weergegeven in Figuur 1B. De gemiddelde hydrodynamische diameter voor deze deeltjes is 73,6 nm. Koper sulfide nanodeeltjes hebben een karakteristieke extinctie kromme die zich uitstrekt tot de NIR, zoals weergegeven in Figuur 1C. Er is een klein artefact rond 850 nm dat werd veroorzaakt door het schakelen van lasers door de spectrofotometer.
Fluorescentiemicroscopie beelden van cellen geïnineerd met fluorescently gelabelde nanodeeltjes kunnen worden gezien in Figuur 2. De opname van nanodeeltjes kan worden gevisualiseerd door de aanwezigheid van fluorescentie in de cel. Cellen die niet met nanodeeltjes zijn geïnineerd vertonen geen fluorescentie signaal. De aanwezigheid van dit fluorescentie signaal duidt op de succesvolle opname van de deeltjes en hun vermogen om in het stroomsysteem te worden gedetecteerd.
Figuur 3 toont de algemene instellingen van het photoacoustic flow-systeem. Figuur 3a toont een gedetailleerd model van de 3D-stroom kamer. Deze kamer kan worden afgedrukt met behulp van het. STL-bestand dat bij dit protocol wordt geleverd. Figuur 3B toont een overzicht van de instellingen van de stroom tank. Figuur 3C toont een algemene opzet van de stroom tank en het systeem voor gegevens acquisitie.
Typische gegevens verzamelings signalen worden weergegeven in Figuur 4. De onbewerkte gegevens geeft de verschillen in signaal tussen de nano-artikel gelabelde cellen, PBS en FA-CuS NPs. Een overname is het resulterende photoacoustic-signaal gegenereerd door een enkele laserpuls. Als gevolg van de snelle afvuren snelheid van de laser, elk monster geanalyseerd genereert meerdere overnames. Een envelop voor elke afzonderlijke overname is gegenereerd met behulp van de Hilbert-transformatie. Deze envelop is geïntegreerd om de totale hoeveelheid signaal gegenereerd door de laserpuls te meten. In een eerdere studie, deze gegevens werden geanalyseerd met behulp van R statistische software, waarbij het aantal acquisities geanalyseerd voor de t-test waren 203, 150, 160, en 131, voor cellen met NPs, cellen alleen, PBS, en NPs alleen, respectievelijk22. De gegevens werden genormaliseerd door log transformatie en vergeleken met behulp van een Welch t-test in R. De signalen die voortvloeien uit de FA-CuS NPs alleen bij een concentratie van 100 μg/mL toonde een veel hoger signaal dan de negatieve controle. Het verschil in de signalen tussen de negatieve controle en de gelabelde ovariële Ctc's waren subtieler dan de positieve controle, maar kon worden gedetecteerd door de analyse van hun middelen door een t-toets22.
Met behulp van aangepaste LabView en MATLAB-software werden beeld reconstructies gemaakt van de positieve en negatieve controles in real-time en post-acquisitie, respectievelijk. Om de fotoakoestische reconstructies te genereren, werd een envelop van elke overname berekend met behulp van de Hilbert-transformatie. Afzonderlijke enveloppen werden vervolgens omgezet in pixelwaarden en weergegeven als onafhankelijke kolommen. Er zijn duidelijke verschillen in het fotoakoestisch signaal tussen de FA-CuS NPs bij een concentratie van 100 μg/mL en het PBS-monster (Figuur 5). Besturingselementen voor het systeem zijn belangrijk om ervoor te zorgen dat het systeem een adequaat fotoakoestisch signaal produceert dat door de transducer kan worden gedetecteerd.
Figuur 1: representatieve NP-karakterisering. (A) tem-afbeelding van gesynthetiseerde FA-cus NPs. schaalbalk = 50 nm. B) representatieve verdeling van de DLS-intensiteit van gesynthetiseerde FA-cus NPS.C) representatieve FA-cus NPS-extinctie kromme. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve fluorescentiemicroscopie beelden van SKOV-3 cellen. De cellen werden geïnincubeerd met en zonder 400 μg/mL fluorescently-gelabelde NPs. schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve beelden van photoacoustic flow cytometrie systeem en stroom kamer. A) gedetailleerd overzicht van de 3D-gedrukte stroom kamer. B) schema van het pafc-systeem. C) stroomsysteem architectuur: SP = spuitpomp; DAQ/FPGA = data-acquisitie/veld programmeerbare Gate Array; OB = objectief objectief; VAN = glasvezel; FC = vezel koppeling; UT = ultrasone transducer; FT = stroom tank. Dit cijfer is aangepast van Lusk et al.22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatief ruw gegevens signaal en Hilbert-transformaties van monsters die in het stroomsysteem zijn getest. (A) representatief ruw gegevens signaal van PBS en cellen die zijn geïnineerd met NPs en de (D) Hilbert-transformatie van de gegevens. B) representatief ruw gegevens signaal van de cellen alleen en de cellen die zijn geïncubeerd met FA-cus NPs en (E) de Hilbert-transformatie van de gegevens. C) representatief ruw gegevens signaal van PBS en 100 μg/ml FA-cus NPs en (F) de Hilbert-transformatie van de gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve fotoakoestische beeld reconstructies van de photoacoustic data. A) beeld reconstructie van 100 μg/ml FA-cus NPs en (B) PBS getest in het stroomsysteem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1: stroom kamer STL. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is een eenvoudige methode voor de detectie van ovariële Ctc's met behulp van PAFC en een gerichte CuS contrastmiddel. Er zijn veel methoden onderzocht voor de detectie van ovariële ctc's, waaronder microfluïdische apparaten, RT-PCR en fluorescentie flow cytometrie23,24,25. Deze variëren in complexiteit, kosten en nauwkeurigheid, waardoor hun effectiviteit in klinische instellingen wordt beperkt. PAFC introduceert verschillende voordelen ten opzichte van deze traditionele methoden voor de detectie van Ctc's, waaronder de mogelijkheid om Ctc's binnen patiënt monsters te detecteren en het gemak van vertalen naar in vivo-toepassingen. Ook is gebleken dat pafc ctc's in vitro en in vivo nauwkeurig detecteert in combinatie met gerichte contrastmiddelen26,27.
In dit werk werden FA-CuS NP contrastmiddelen geëvalueerd op hun vermogen om de nauwkeurigheid van CTC-detectie op fysiologisch relevante concentraties te verbeteren. Er werden studies uitgevoerd met geïsoleerde SKOV-3 cellen die in PBS werden geresuspendeerd. Analyse van fluorescentiemicroscopie gaf de succesvolle opname van deze deeltjes aan. De resultaten detecteerd SKOV-3 cellen tot een concentratie van 1 cel/μL22. Cruciale stappen in dit protocol omvatten de nanodeeltjes synthese en de uitlijning van de photoacoustic flow Setup. Tijdens de nanodeeltjes synthese is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de oplossing een donker groene kleur heeft gedraaid voordat het mengsel uit het oliebad wordt verwijderd. Voor het stroomsysteem, het uitvoeren van een negatieve en positieve controle hoewel het systeem voorafgaand aan het testen van monsters nodig is om ervoor te zorgen dat het systeem een adequaat fotoakoestisch signaal voor de volgende detectie van gelabelde cellen produceert. Tijdens het uitvoeren van het stroomsysteem is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het invallende licht van de glasvezel de capillaire buis volledig verlicht en dat de transducer strak tegen de zijkant van de stroom kamer zit. Ten slotte is een rigoureuze beproeving van het systeem voor lekken noodzakelijk om de biologische veiligheid van het systeem te waarborgen en voor een consistente stroom door de kamer.
Voor het huidige PAFC-systeem bevestigde voorbereidende studies foto-akoestische detectie met behulp van het transducer-en versterkingssysteem. Het merendeel van deze signalen bestond uit lagere frequentie signalen (< 20 MHz). Verdere studies zijn nodig om te bevestigen of dit te wijten is aan de werkelijke frequentie van de gegenereerde photoacoustic signalen of de 35 MHz bandbreedte van de versterker. Toekomstige studies zullen de frequentiecomponenten van de gedetecteerde signalen onderzoeken om de centrale frequentie van de transducer en de bandbreedte van het versterkingssysteem te optimaliseren. Het huidige systeem is specifiek geschikt voor de ex vivo-detectie van Ctc's. Deze methode identificeert echter het potentieel voor toekomstige toepassing van FA-CuS NPs in vivo.
Toekomstige studies zijn gericht op het opsporen van ovariële kankercellen binnen gemengde culturen, menselijke klinische monsters, en in vivo modellen28,29,30. Verder zullen toekomstige studies de specificiteit van deze nanodeeltjes versus niet-gerichte controles onderzoeken. Toekomstige validatie van deze methode zal omvatten het testen van deze tool met menselijke klinische monsters, implementatie van hoge doorvoer testen en analyse, en vertaling in klinische instellingen. Deze fotoakoestische techniek toont mogelijkheden voor toekomstige vertalingen naar een breed scala aan klinische toepassingen en ziekten in verschillende contrastmiddelen en analyten. Fotoakoestische detectie van analyten met behulp van PAFC heeft het potentieel om de Point-of-Care detectie van Ctc's en andere pathogenen sneller en goedkoop te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Madeleine Howell graag erkennen voor haar hulp bij synthese, Matthew Chest voor zijn hulp bij het ontwerpen van het flow-systeem, en Ethan Marschall voor hulp bij SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
