Summary
Un protocole est présenté pour détecter les cellules tumorales ovariennes circulantes à l'aide d'un système de flux photoacoustique sur mesure et de nanoparticules de sulfure de cuivre plaquées à l'acide folique ciblée.
Abstract
Beaucoup d'études suggèrent que l'énumération des cellules de tumeur circulantes (CTC) puisse montrer la promesse comme outil pronostique pour le cancer ovarien. Les stratégies actuelles de détection des CCT comprennent la cytométrie du débit, les dispositifs microfluidiques et la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (RT-PCR). Malgré les progrès récents, les méthodes de détection des métastes précoces du cancer de l'ovaire n'ont toujours pas la sensibilité et la spécificité requises pour la traduction clinique. Ici, une nouvelle méthode est présentée pour la détection des cellules tumorales circulantes ovariennes par cytométrie de flux photoacoustique (PAFC) utilisant un système imprimé tridimensionnel (3D) personnalisé, y compris une chambre d'écoulement et une pompe à seringues. Cette méthode utilise des nanoparticules de sulfure de cuivre à teneur en acide folique (FA-CuS NPs) pour cibler les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3 par PAFC. Ce travail démontre l'affinité de ces agents de contraste pour les cellules cancéreuses de l'ovaire. Les résultats montrent la caractérisation de NP, la détection de PAFC, et l'utilisation de NP par microscopie de fluorescence, démontrant de ce fait le potentiel de ce nouveau système pour détecter les CTC ovariens aux concentrations physiologiquement pertinentes.
Introduction
Le cancer de l'ovaire est l'une des tumeurs malignes gynécologiques les plus meurtrières et a entraîné environ 184 800 décès dans le monde en 20181. De multiples études ont montré la corrélation entre la progression du cancer de l'ovaire (c.-à-d. métastes) et la présence des CCT2,3,4. La méthode la plus courante pour la détection et l'isolement des CTC utilise le système Cellsearch, qui cible le récepteur EpCam5. L'expression d'EpCam, cependant, est downregulated dans la transition épithéliale à la transition mésenchymale, qui a été impliquée dans la métastasie de cancer6. Malgré les progrès réalisés, les technologies cliniques actuelles souffrent encore d'une faible précision, d'un coût élevé et d'une complexité. En raison de ces inconvénients, les nouvelles technologies pour la découverte et le recensement des CTC ovariens sont devenues un domaine important pour la recherche.
Récemment, PAFC a émergé comme une méthode efficace pour la détection non invasive des cellules cancéreuses, l'analyse des nanomatériaux, et l'identification des bactéries7,8,9. PAFC diffère de la cytométrie traditionnelle de flux de fluorescence en détectant les analytes en flux en utilisant la photoacoustique. L'effet photoacoustique est généré lorsque la lumière laser est absorbée par un matériau qui provoque une expansion thermoélastique, produisant une onde acoustique qui peut être détectée par un transducteur d'ultrasons10,11. Les avantages de PAFC par rapport aux méthodes traditionnelles de cytométrie de flux incluent la simplicité, la facilité de traduction aux arrangements cliniques, et la détection des CTC à des profondeurs sans précédent dans les échantillons de patients12,13. Des études récentes ont utilisé des systèmes PAFC pour la détection des cellules en utilisant le contraste endogène et exogène14,15. Des agents de contraste absorbant la lumière dans l'infrarouge proche (NIR) tels que le colorant vert endocyanine et les NP métalliques (p. ex., or et CuS) ont été utilisés pour l'étiquetage sélectif des cellules et des tissus en combinaison avec l'imagerie photoacoustique16,17,18. En raison de l'amélioration de la profondeur de pénétration de la lumière NIR dans les tissus biologiques, la détection photoacoustique des absorbeurs peut être effectuée à de plus grandes profondeurs pour des applications cliniques. En raison de son grand potentiel d'utilisation dans la clinique, la combinaison d'agents de contraste NIR ciblés avec PAFC a suscité un intérêt considérable pour la détection des CCT.
PAFC en combinaison avec des agents de contraste ciblés fournit une approche améliorée pour l'analyse à haut débit des échantillons de patients avec une précision accrue et une détection ciblée des CTC. L'une des principales stratégies de détection des CTC est le ciblage spécifique des protéines membranaires présentes sur la cellule d'intérêt. Une caractéristique notable des CTC ovariens est la surexpression des récepteurs foliques situés sur leur membrane externe19. Le ciblage des récepteurs foliques est une stratégie idéale pour l'identification des CCT ovariens dans le sang parce que les cellules endogènes, qui ont une expression plus élevée des récepteurs d'acide folique, sont généralement lumineuses et ont une exposition limitée à la circulation sanguine20. Les nP de sulfure de cuivre (NPs de CuS) ont été récemment reconnus pour leur capacité à cibler des récepteurs foliaires exprimés sur des cellules cancéreuses21. Combinés à leur biocompatibilité, à leur facilité de synthèse et à leur absorption dans le NIR, ces agents de contraste NP constituent une stratégie de ciblage idéale pour la détection des CTC ovariens utilisant paFC.
Ce travail décrit la préparation des NP FA-CuS et leur utilisation pour la détection des cellules cancéreuses ovariennes dans un système de flux photoacoustique. Les IP CuS sont modifiés avec de l'acide folique pour cibler spécifiquement les CTC ovariens et émettent un signal photoacoustique lorsqu'ils sont stimulés avec un laser de 1 053 nm. Les résultats indiquent la détection réussie des cellules cancéreuses ovariennes incubées avec ces agents de contraste photoacoustique s'insinpeuser dans le système PAFC. Ces résultats montrent la détection des cellules cancéreuses ovariennes jusqu'à des concentrations de 1 cellule/L, et la microscopie de fluorescence confirme l'étude réussie de ces particules par les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-322. Ce travail fournit une description détaillée de la synthèse FA-CuS NPs, la préparation d'échantillons pour la microscopie de fluorescence, la construction du système de flux photoacoustique, et la détection photoacoustique des cellules cancéreuses ovariennes. La méthode présentée montre l'identification réussie des CTC ovariens dans le flux utilisant des NPs de FA-CuS. Les travaux futurs se concentreront sur l'application clinique de cette technologie vers la détection tôt des métastes de cancer de l'ovaire.
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Protocol
1. Synthèse et fonctionnalisation des nanoparticules
REMARQUE : La synthèse des NP FA-CuS est réalisée à l'aide d'une méthode de synthèse d'un pot adaptée d'un protocole publié précédemment21.
CAUTION: Toute synthèse doit se produire dans un capot de fumée chimique ventilée.
- Avant la synthèse, filtrer environ 300 ml d'eau déionisée (DI) à l'eau par un filtre stérile de 0,2 m.
- Nettoyer un flacon de fond rond en verre de 250 ml avec une solution de détergent et rincer à l'eau DI. Ajouter 0,0134 g de CuCl2 en 100 ml d'eau DI pour créer une solution de 1 mm.
- Ajouter 0,015 g d'acide folique (FA) à la solution CuCl2 et remuer pendant 5 min à l'aide d'une barre magnétique.
- Ajouter Na2S-9H2O (0,024 g dans 100 l d'eau DI) sur environ 10 s au mélange de réaction en utilisant une pipette de 200 l.
REMARQUE : Lors de l'ajout de la Na2S-9H2O, la solution changera de couleur d'un jaune clair à un brun foncé. - Capuchon de la réaction et placez-le dans un bain d'huile, réglé à 90 oC, et continuez à remuer avec une barre magnétique. Après environ 15 min, ou lorsque le bain d'huile a atteint 85-90 oC, laissez la réaction se poursuivre pendant une heure supplémentaire. Votre mélange devrait progressivement se transformer en une couleur vert foncé.
REMARQUE : Assurez-vous d'évacuer le système tout en chauffant le mélange de réaction pour éviter l'accumulation de pression. - Retirer le récipient de réaction du bain d'huile et refroidir brièvement à température ambiante pendant environ 10 à 15 minutes avant de le transférer dans un bain de glace.
- Une fois que le mélange de réaction a refroidi en dessous de 20 oC, ajustez le pH à 10 en utilisant 1M NaOH pour dissoudre le reste de l'acide folique en solution.
- Purifie le mélange de réaction FA-CuS à l'aide d'une colonne de centrifugation de 30 kDa. Ajouter la solution en lots de 15 ml à la colonne et la centrifugeuse à 3 082 x g pendant 15 min.
- Une fois que tout le mélange de réaction a été concentré, recombiner les fractions concentrées et laver 4x avec 15 ml de pH 10 NaOH dans la colonne de centrifugation de 30 kDa.
- Pour les mesures de masse, prendre 1/3 de la solution (66 l) et diviser en trois flacons de verre. Sécher dans un four à vide pendant la nuit à 40 oC sous un vide de 27 mmHg.
- Dissoudre les 2/3 autres de la solution concentrée dans 250 L de PBS et stocker à 4 oC jusqu'à une utilisation plus poussée.
- Avant d'utiliser les nPs FA-CuS, les sonicate pendant 30 minutes dans un sonicator de bain sur un réglage élevé.
2. Caractérisation NP
- Effectuer la diffusion dynamique de la lumière (DLS) Ajouter 10 L de CONCENTRÉ FA-CuS NPS dans la solution PBS de l'étape 1.1.14 à 2 ml d'eau DI. Avant la caractérisation par DLS, sonicate les particules pendant 30 min dans un sonicateur de bain sur un réglage élevé et filtrez à travers un filtre stérile de 0,2 m pour enlever la poussière résiduelle.
- Effectuer la microscopie électronique de transmission (TEM) : Ajouter 10 l de NPS FA-CuS concentré dans la solution PBS à un morceau de papier ciré. Inverser une grille de cuivre enduite de formvar sur le dessus de la gouttelette et laisser s'asseoir pendant 2 min. Touchez le bord de la grille enduite de formvar à un morceau de papier filtre pour enlever l'excès de liquide. Laisser sécher l'air. Image de la grille de cuivre à l'aide d'un microscope électronique à une tension d'accélération de 80 kV.
REMARQUE : Les résultats typiques de la caractérisation du SNM FA-CuS sont présentés à la figure 1.
3. Culture cellulaire
- Ce protocole utilise des cellules SKOV-3. Sauf indication contraire, la culture SKOV-3 cellules dans le milieu 5A de McCoy complété avec 10% FBS, 100 U/ mL pénicilline, et 100 g/mL streptomycine, et de maintenir à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5% CO2.
4. Marquage fluorescent de FA-CuS NPS pour la microscopie
- Ajouter l'ester succinimidyl Texas-Red-X (0,2 mg dissous dans le DMSO à une concentration de 10 mg/mL) à une solution contenant 2 mg de NP FA-CuS dans 1 mL de 0,1 M NaHCO3 (pH 9) tampon.
- Remuer le mélange de réaction à l'aide d'une barre magnétique pendant 1 h, loin de la lumière à température ambiante.
- Concentrez le mélange de réaction dans une colonne de centrifugation MWCO de 4 ml 30 kDa en tournant à 4 000 x g pendant 10 min.
- Laver la solution concentrée 3x avec 4 ml de 0,1 M NaHCO3 tampon (pH 9) dans une colonne de centrifugation. Par la suite, laver la solution concentrée avec 4 ml d'eau DI 3x ou jusqu'à ce que seule une quantité infime de fluorescence reste visible dans le débit par UV-VIS.
5. FA-CuS NPS Uptake by Ovarian Cancer Cells 5. FA-CuS NPS Uptake by Ovarian Cancer Cells 5. FA-CuS NPS Uptake by Ovarian Cancer Cells 5.
- Avant l'incubation avec les nP FA-CuS, incubez les cellules SKOV-3 dans un flacon T75 avec 8 à 15 ml de milieux RPMI-1640 sans acide folique avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine pendant au moins 24 h.
- Les cellules de graine dans 0.5 ml de le milieu de croissance complet de RPMI-1640 folique-acide-libre à une densité de 0.1 x 106 cellules/mL dans une plaque de 24 puits.
- Le lendemain, incubez des cellules avec 400 nPS FA-CuS FA-CuS de 400 g/mL dans 0,5 ml de RPMI-1640 sans acide folique, un support de croissance complet pendant 2 h.
- Après cette incubation, trypsiniser les cellules avec 0,5 ml de 0,25% trypsine avec EDTA. Ajouter au moins 1 ml de milieu de croissance complète RPMI-1640 sans acide folique pour neutraliser la trypsine, et centrifuger les cellules à 123 x g pendant 6 min.
- Retirez le supernatant, suspendez les cellules en 2 ml de PBS et centrifugez-vous à 123 x g pendant 6 min. Effectuez cette étape de lavage 2x pour enlever les NP non liés.
- Resuspendre les cellules dans 1/2 ml de PBS avec une solution Tween de 2%.
- Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et d'un bleu trypan. D'autres cellules diluent si le nombre de cellules est trop élevé. Cellules diluées dans PBS avec 2% De tween à la concentration choisie pour la détection.
- Les cellules sont maintenant prêtes à être analysées par le système PAFC.
6. Microscopie fluorescence de FA-CuS NPS Uptake
- Répétez les étapes énumérées à l'étape 5.1 et procédez au protocole ci-dessous pour la microscopie.
- Cellules de graines à une densité de 0,1 x 106 cellules/mL dans 0,5 ml de rpMI-1640 sans acide folique support de croissance complète sur les couvertures de verre dans une plaque de 24 puits.
- Le lendemain, incuber les cellules avec des nP FA-CuS étiquetés fluorescents en triplette, à des concentrations de 100 g/mL, 200 g/mL, 300 g/mL, et 400 g/mL dans 0,5 mL de rpMI-1640 sans acide folique.
- Incuber les cellules avec les NP pendant 2 h dans l'incubateur de 37 oC
- Après cette période d'incubation, lavez les cellules 3x avec du PBS.
REMARQUE : Pour toutes les étapes de lavage, ajouter soigneusement la solution sur le côté de la plaque de puits pour ne pas déranger les cellules. Après l'ajout, inclinez soigneusement la plaque et retirez la solution du côté du puits. - Incuber les cellules avec 0,5 ml de 3,7 % de paraformaldéhyde (PFA) en PBS pendant 15 min et transférer les couvercles en verre dans une nouvelle plaque de 24 puits.
CAUTION: PFA est un cancérogène connu. Faites toute la fixation dans une hotte de fumée chimique ventilée et portez l'équipement de protection individuelle approprié. - Incuber les cellules dans une solution de 3,7% PFA avec 0,1% Triton-X en PBS pendant 5 min.
- Laver les cellules avec 0,5 ml de PBS 3x pendant 5 min chacune et transférer les plaques de couverture dans une nouvelle plaque.
- Incuber les cellules avec 0,5 ml d'une solution PBS contenant du DAPI (20 l/mL d'une solution de stock de 0,5 mg/mL est utilisée pour la coloration) pendant 5 min, loin de la lumière.
- Laver les cellules avec PBS 3x.
- Après le lavage PBS final, monter les couvertures sur les diapositives avec le milieu de montage.
- Les cellules sont maintenant prêtes à être représentées par microscopie à fluorescence. La figure 2 montre un exemple de caractérisation cellulaire typique par microscopie fluorescence.
7. Architecture du système de flux
- Construction de chambre de flux
REMARQUE : Un fichier SolidWorks d'un réservoir d'écoulement imprimé en 3D se trouve dans les Matériaux Supplémentaires.- À l'aide du fichier SolidWorks fourni, imprimer en 3D le réservoir d'écoulement à l'aide de plastique thermoplastique ABS ou PLA. Les dimensions sont fournies ci-dessous si SolidWorks n'est pas disponible. La figure 3A montre une représentation de ce modèle. Le corps du réservoir d'écoulement est de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Les extrémités du réservoir d'écoulement comprennent des trous d'environ 5 mm de diamètre pour permettre l'entrée de tubes contenant le tube capillaire.
REMARQUE : Le réservoir d'écoulement a un trou de 1 cm, perpendiculaire à l'orientation du tube capillaire, pour le placement du transducteur d'ultrason. Une extrusion cylindrique avec le même diamètre intérieur que le trou s'étend de 6 mm dans le réservoir. Pour l'imagerie en temps réel, le réservoir d'écoulement a une fente de 1 mm x 3 mm directement sous le tube capillaire. - Après l'impression du réservoir d'écoulement 3D, nettoyez et assemblez le système pour l'utiliser.
- Placez les couvercles en verre sur la fente de 1 mm x 3 mm et le trou de 1 cm dans le système d'écoulement.
- Scellez soigneusement avec du silicone pour éviter les fuites.
- Adhérence du tube capillaire dans les tubes durcis en silicone. Insérez les tubes dans la chambre d'écoulement bien que le côté du réservoir d'écoulement de sorte que le tube capillaire en verre est directement au-dessus et devant la fente de 3 mm et le trou de 1 cm.
- Scellez le tube à l'aide de silicone pour prévenir les fuites.
- À l'aide du fichier SolidWorks fourni, imprimer en 3D le réservoir d'écoulement à l'aide de plastique thermoplastique ABS ou PLA. Les dimensions sont fournies ci-dessous si SolidWorks n'est pas disponible. La figure 3A montre une représentation de ce modèle. Le corps du réservoir d'écoulement est de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Les extrémités du réservoir d'écoulement comprennent des trous d'environ 5 mm de diamètre pour permettre l'entrée de tubes contenant le tube capillaire.
- Configuration du système de flux photoacoustique
REMARQUE : La figure 3B et la figure 3C montrent un exemple de l'architecture du système d'écoulement.- Connectez le transducteur à un pulseur/récepteur à ultrasons. Amplifiez le signal avec un gain de 59 dB.
- Connectez la sortie du filtre à un oscilloscope reconfigurable polyvalent équipé d'un tableau de porte programmable intégré sur le terrain.
- Connectez l'un des tubes provenant de la chambre d'écoulement à une jonction en T, reliée à deux pompes à seringues à chaque branche.
- Remplissez l'une des pompes à seringues d'air et l'autre pompe avec l'échantillon à analyser. Fixer la pompe contenant de l'air à un débit de 40 l/min et la pompe contenant l'échantillon à un débit de 20 l/min. Le débit en deux phases qui en résultera produira des volumes d'échantillons de 1 l. À ce débit, le système testera environ 6,4 échantillons par minute.
REMARQUE : Pour maintenir une distribution cohérente des cellules, vortexz légèrement chaque échantillon immédiatement avant d'être examiné. En outre, faire pivoter la seringue toutes les quelques minutes afin d'empêcher les cellules de s'installer dans la solution. - Connectez le tube restant sortant du système d'écoulement à un récipient avec 10% d'eau de Javel, pour éliminer les cellules après qu'ils sortent du système d'écoulement.
REMARQUE : Avant d'utiliser le système d'écoulement, vérifiez s'il y a des fuites, car celles-ci peuvent affecter le débit. Les cellules doivent être contenues dans un système fermé pour maintenir la sécurité biologique pendant la procédure. - La conception du réservoir imprimé en 3D permet un alignement cohérent et répétable entre le transducteur et la lumière laser avec un minimum d'étalonnage. Lorsqu'il est placé correctement dans le réservoir personnalisé, le tube capillaire de quartz assure que le transducteur et le laser sont directement alignés.
- Placez la section du tube capillaire de quartz en alignement direct avec le transducteur, dans le champ de vision du microscope, permettant le placement soigneux de la fibre optique au-dessus de l'échantillon de telle sorte qu'il illumine toute la largeur du tube.
- Irradiez l'échantillon à l'aide d'une fibre optique canalisant un laser à l'état solide pompé par diodes fonctionnant à une longueur d'onde de 1 053 nm. L'incident de lumière laser sur l'échantillon et le transducteur utilisé pour mesurer l'effet photoacoustique sont tous deux non ciblés.
- L'énergie de l'incident laser sur l'échantillon est d'environ 8 mJ et le taux laser de 10 Hz est suffisant pour éclairer chaque échantillon plusieurs fois pendant qu'il traverse le système.
- Placez le système d'écoulement au-dessus d'un microscope inversé et assurez-vous que l'impulsion laser et la trajectoire de l'échantillon sont visibles lorsque l'échantillon passe à bien que le système d'écoulement. Enregistrez le débit à l'aide d'une caméra montée au microscope.
- Enregistrez les acquisitions d'échographies à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données (voir Tableau des matériaux). Déclencher l'échographie et le laser pulsé à l'aide de la FPGA. Utilisez PBS avec 2% Tween, et FA-CuS NPs à une concentration de 100 g/mL dans PBS 2% Tween, comme contrôles négatifs et positifs, respectivement.
- En utilisant une caméra montée au microscope, enregistrez à la fois la mise à feu du laser et le passage d'échantillons par le système d'écoulement. Ces enregistrements seront utilisés pour corréler le signal acoustique enregistré par le transducteur avec le tir du laser. Lorsque les échantillons passent devant le tir du laser, le signal peut alors être corrélé au signal photoacoustique qui en résulte pour analyse. À un taux d'échantillonnage de 10 Hz, le laser illuminera chaque prise plusieurs fois.
8. Après le traitement
- Pour chaque acquisition de signal, s(t), calculer la transformation Hilbert, H[s(t)], afin de créer un signal analytique.
- Créer une enveloppe complexe, se(t), en calculant l'ampleur du signal analytique, de telle sorte que
et intégrer l'enveloppe pour mesurer le signal total résultant de chaque acquisition. Comparez les signaux de chaque groupe de test (c.-à-d. PBS, cellules étiquetées, FA-CuS NPs, cellules seules) en utilisant un t-test dans le logiciel statistique R. Les signaux photoacoustiques bruts et leurs transformations Hilbert sont présentés dans la figure 4. - Pour la reconstruction d'image, normalisez l'enveloppe complexe en fonction du maximum sur l'ensemble de la course. Si vous comparez une série de pistes, normalisez l'enveloppe complexe en utilisant le maximum de pointe sur l'ensemble de la série. Après normalisation, convertissez chaque acquisition en une série de valeurs pixel. Représentez chaque série de valeurs de pixels comme une colonne dans la reconstruction de l'image. Les reconstructions représentatives de PBS et des signaux NP FA-CuS sont indiquées à la figure 5, où les deux images ont été normalisées à l'aide du maximum sur les deux pistes.
et intégrer l'enveloppe pour mesurer le signal total résultant de chaque acquisition. Comparez les signaux de chaque groupe de test (c.-à-d. PBS, cellules étiquetées, FA-CuS NPs, cellules seules) en utilisant un t-test dans le logiciel statistique R. Les signaux photoacoustiques bruts et leurs transformations Hilbert sont présentés dans la figure 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1A montre une image TEM typique des nanoparticules synthétisées. La taille moyenne de la nanoparticule typique est d'environ 8,6 nm et 2,5 nm. La mesure de nanoparticule a été exécutée dans ImageJ. Des fonctions de seuil et de bassin versant ont été appliquées pour séparer les particules aux fins de mesure. Les diamètres horizontaux et verticaux de chaque particule ont été mesurés perpendiculairement les uns aux autres et ont fait la moyenne. Pour le DLS, une mesure représentative est indiquée à la figure 1B. Le diamètre hydrodynamique moyen de ces particules est de 73,6 nm. Les nanoparticules de sulfure de cuivre ont une courbe d'absorption caractéristique qui s'étend jusqu'au NIR, comme le montre la figure 1C. Il y a un léger artefact autour de 850 nm qui a été causé par le changement de lasers par le spectrophotomètre.
Les images de microscopie de fluorescence des cellules incubées avec des nanoparticules étiquetées fluorescentes peuvent être vues dans la figure 2. L'apport en nanoparticules peut être visualisé par la présence de fluorescence à travers la cellule. Les cellules non incubées avec des nanoparticules ne montrent aucun signal de fluorescence. La présence de ce signal de fluorescence indique l'utilisation réussie des particules et leur capacité à être détectées dans le système d'écoulement.
La figure 3 montre la configuration générale du système de flux photoacoustique. La figure 3A montre un modèle détaillé de la chambre d'écoulement 3D. Cette chambre peut être imprimée en utilisant le fichier .stl fourni avec ce protocole. La figure 3B montre un aperçu de la configuration du réservoir d'écoulement. La figure 3C montre une configuration générale du réservoir d'écoulement et du système d'acquisition de données.
Les signaux typiques d'acquisition de données sont indiqués à la figure 4. Les données brutes indiquent les différences de signal entre les cellules étiquetées nanoparticules, PBS, et FA-CuS NPs. Une acquisition est le signal photoacoustique résultant généré à partir d'une seule impulsion laser. En raison du taux de tir rapide du laser, chaque échantillon analysé génère de multiples acquisitions. Une enveloppe pour chaque acquisition individuelle a été générée à l'aide de la transformation Hilbert. Cette enveloppe a été intégrée pour mesurer la quantité totale de signal générée par l'impulsion laser. Dans une étude précédente, ces données ont été analysées à l'aide de logiciels statistiques R, où le nombre d'acquisitions analysées pour le test t étaient 203, 150, 160 et 131, pour les cellules avec des NP, des cellules seules, PBS, et NPs seulement, respectivement22. Les données ont été normalisées par la transformation du journal et comparées à l'aide d'un test t de Welch en R. Les signaux résultant des NP FA-CuS seuls à une concentration de 100 g/mL ont montré un signal beaucoup plus élevé que le contrôle négatif. La différence dans les signaux entre le contrôle négatif et les CTC ovariens marqués était plus subtile que le contrôle positif, mais pouvait être détectée par l'analyse de leurs moyens par un t-test22.
Utilisant des logiciels LabView et MATLAB personnalisés, les reconstructions d'images ont été effectuées à bien les contrôles positifs et négatifs en temps réel et après l'acquisition, respectivement. Afin de générer les reconstitutions photoacoustiques, une enveloppe de chaque acquisition a été calculée à l'aide de la transformation Hilbert. Les enveloppes individuelles ont ensuite été converties en valeurs de pixels et affichées sous forme de colonnes indépendantes. Des différences claires dans le signal photoacoustique se produisent entre les NP FA-CuS à une concentration de 100 g/mL et l'échantillon de PBS (figure 5). Les contrôles du système sont importants à exécuter pour s'assurer que le système produit adéquatement le signal photoacoustique qui peut être détecté par le transducteur.
Figure 1 : Caractérisation des NP représentatives. (A) Image TEM synthétisée FA-CuS NPs. Barre d'échelle de 50 nm. (B) Répartition d'intensité représentative de la DLS des nPs FA-CuS synthétisés. (C) Representative FA-CuS NPs absorbance curve. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images de microscopie de fluorescence représentatives des cellules SKOV-3. Les cellules ont été incubées avec et sans 400 NP fluorescents de 400 g/mL. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images représentatives du système de cytométrie du flux photoacoustique et de la chambre de débit. (A) Vue détaillée de la chambre de débit imprimée en 3D. (B) Diagramme du système PAFC. (C) Architecture du système de débit : SP et pompe à seringues; DAQ/FPGA - réseau de portes programmables pour l'acquisition de données/champ programmable; Ob - objectif; OF - fibre optique; Le coupleur de fibre de FC ; UT - transducteur d'ultrasons; Réservoir d'écoulement FT. Ce chiffre est adapté de Lusk et coll.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Signal de données brutes représentatif et transformations Hilbert d'échantillons testés dans le système d'écoulement. (A) Signal de données brutes représentatifs de PBS et de cellules incubées avec des NPs et la transformation(D) Hilbert des données. (B) Signal de données brutes représentatives des cellules seules et des cellules incubées avec des NP DE FA-CuS et (E) la transformation de Hilbert des données. (C) Signal de données brutes représentatifs de PBS et de 100 NP FA-CuS de 100 g/mL et (F) la transformation hilbert des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Reconstitutions d'images photoacoustiques représentatives des données photoacoustiques. (A) Reconstruction d'image de 100 NP FA-CuS de 100 g/mL et (B) PBS testés dans le système d'écoulement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dossier supplémentaire 1: Flow Chamber STL. S'il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
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Discussion
Ce protocole est une méthode simple pour la détection des CTC ovariens utilisant PAFC et un agent de contraste ciblé de CuS. De nombreuses méthodes ont été explorées pour la détection des CCT ovariens, y compris les dispositifs microfluidiques, RT-PCR, et la cytométrie de flux de fluorescence23,24,25. Ces gammes dans la complexité, le coût, et l'exactitude, limitant leur efficacité dans les arrangements cliniques. PAFC présente plusieurs avantages par rapport à ces méthodes traditionnelles pour la détection des CTC, y compris la capacité de détecter les CTC dans les échantillons de patients, et sa facilité de traduction vers des applications in vivo. Il a également été démontré que le PAFC détecte avec précision les CCT in vitro et in vivo lorsqu'ils sont combinés avec des agents de contraste ciblés26,27.
Dans le cadre de ces travaux, des agents de contraste FA-CuS NP ont été évalués pour leur capacité à améliorer l'exactitude de la détection de la CCT à des concentrations physiologiquement pertinentes. Des études ont été exécutées utilisant les cellules isolées de SKOV-3 resuspendues dans PBS. L'analyse par microscopie de fluorescence a indiqué l'étude réussie de ces particules. Les résultats ont détecté des cellules SKOV-3 jusqu'à une concentration de 1 cellule/L22. Les étapes cruciales de ce protocole impliquent la synthèse des nanoparticules et l'alignement de la configuration du débit photoacoustique. Lors de la synthèse des nanoparticules, il est important de s'assurer que la solution a pris une couleur vert foncé avant de retirer le mélange du bain d'huile. Pour le système d'écoulement, l'exécution d'un contrôle négatif et positif si le système avant l'essai de l'échantillon est nécessaire pour s'assurer que le système produit un signal photoacoustique adéquat pour la détection ultérieure des cellules étiquetées. Pendant l'exécution du système d'écoulement, il est important de s'assurer que la lumière incidente de la fibre optique éclaire complètement le tube capillaire, et que le transducteur est serré contre le côté de la chambre d'écoulement. Enfin, des tests rigoureux du système pour les fuites sont nécessaires pour assurer la sécurité biologique du système et pour un débit constant dans la chambre.
Pour le système PAFC actuel, des études préliminaires ont confirmé la détection photoacoustique à l'aide du transducteur et du système d'amplification. La majorité de ces signaux étaient constitués de signaux à basse fréquence (lt;20 MHz). D'autres études sont nécessaires pour confirmer si cela est dû à la fréquence réelle des signaux photoacoustiques générés ou à la bande passante de 35 MHz de l'amplificateur. De futures études étudieront les composants de fréquence des signaux détectés afin d'optimiser la fréquence centrale du transducteur ainsi que la bande passante du système d'amplification. Le système actuel est spécifiquement adapté à la détection ex vivo des CCT. Cependant, cette méthode identifie le potentiel d'application future des NP FA-CuS in vivo.
Les études futures visent à détecter les cellules cancéreuses ovariennes dans les cultures mixtes, les échantillons cliniques humains, et les modèles in vivo28,29,30. En outre, de futures études examineront la spécificité de ces nanoparticules par rapport aux contrôles non ciblés. La validation future de cette méthode comprendra l'essai de cet outil avec des échantillons cliniques humains, la mise en œuvre de tests et d'analyses à haut débit et la traduction dans des milieux cliniques. Cette technique photoacoustique montre le potentiel de traduction future à une grande variété d'applications cliniques et de maladies à travers une gamme d'agents de contraste et d'analytes. La détection photoacoustique des analytes utilisant PAFC a le potentiel de rendre la détection au point de soins des CCT et d'autres agents pathogènes plus rapide et peu coûteuse.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Madeleine Howell pour son aide dans la synthèse, Matthew Chest pour son aide à la conception du système d'écoulement et Ethan Marschall pour l'aide de SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
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