Summary
Ein Protokoll wird vorgestellt, um zirkulierende Eierstocktumorzellen unter Verwendung eines maßgeschneiderten photoakustischen Strömungssystems und gezielter Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel zu detektieren.
Abstract
Viele Studien deuten darauf hin, dass die Aufzählung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) als prognostisches Werkzeug für Eierstockkrebs vielversprechend sein könnte. Aktuelle Strategien für den Nachweis von CTCs umfassen Durchflusszytometrie, mikrofluidische Geräte und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Trotz der jüngsten Fortschritte fehlt es den Methoden zur Erkennung von frühen Ovarialkarzinastasen noch immer an der Empfindlichkeit und Spezifität, die für die klinische Übersetzung erforderlich sind. Hier wird eine neuartige Methode zum Nachweis von zellaren zirkulierenden Tumorzellen durch photoakustische Durchflusszytometrie (PAFC) unter Verwendung eines benutzerdefinierten dreidimensionalen (3D) gedruckten Systems, einschließlich einer Durchflusskammer und Spritzenpumpe, vorgestellt. Diese Methode verwendet Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel (FA-CuS NPs), um SKOV-3 Eierstockkrebszellen durch PAFC zu zielen. Diese Arbeit zeigt die Affinität dieser Kontrastmittel für Eierstockkrebszellen. Die Ergebnisse zeigen NP-Charakterisierung, PAFC-Detektion und NP-Aufnahme durch Fluoreszenzmikroskopie und zeigen damit das Potenzial dieses neuartigen Systems, Eierstock-CTCs in physiologisch relevanten Konzentrationen zu detektieren.
Introduction
Eierstockkrebs ist eine der tödlichsten gynäkologischen Erkrankungen und führte 2018 weltweit zu schätzungsweise 184.800 Todesfällen1. Mehrere Studien haben die Korrelation zwischen der Progression von Eierstockkrebs (d. h. Metastasierung) und dem Vorhandensein von CTCs2,3,4gezeigt. Die gängigste Methode zur Detektion und Isolierung von CTCs nutzt das Cellsearch-System, das auf den EpCam-Rezeptor5abzielt. EpCam-Expression ist jedoch im epitheliale bis mesenchymalen Übergang, der in Krebsmetastasen verwickelt ist, downreguliert6. Trotz der Fortschritte leiden die aktuellen klinischen Technologien immer noch unter geringer Genauigkeit, hohen Kosten und Komplexität. Aufgrund dieser Nachteile sind neue Technologien für die Entdeckung und Aufzählung von Eierstock-CTCs zu einem wichtigen Forschungsgebiet geworden.
Kürzlich entwickelte sich PAFC als wirksame Methode zur nichtinvasiven Detektion von Krebszellen, zur Analyse von Nanomaterialien und zur Identifizierung von Bakterien7,8,9. PAFC unterscheidet sich von der herkömmlichen Fluoreszenzflusszytometrie durch die Detektion von Analyten im Fluss durch die Verwendung von Photoakustik. Der photoakustische Effekt wird erzeugt, wenn Laserlicht von einem Material absorbiert wird, das eine thermoelastische Ausdehnung verursacht und eine akustische Welle erzeugt, die von einem Ultraschallwandler10,11erkannt werden kann. Zu den Vorteilen von PAFC gegenüber herkömmlichen Durchflusszytometriemethoden gehören Einfachheit, einfache Übersetzung in klinische Umgebungen und der Nachweis von CTCs in beispiellosen Tiefen in Patientenproben12,13. Neuere Studien haben PAFC-Systeme für den Nachweis von Zellen mit endogenem und exogenem Kontrast14,15verwendet. Nahinfrarot (NIR) lichtabsorbierende Kontrastmittel wie indocyanine grüner Farbstoff und MetallNPs (z.B. Gold und CuS) wurden für die selektive Kennzeichnung von Zellen und Geweben in Kombination mit photoakustischer Bildgebung16,17,18verwendet. Durch die verbesserte Eindringtiefe von NIR-Licht in biologischen Geweben kann die photoakustische Detektion von Absorbern in größeren Tiefen für klinische Anwendungen durchgeführt werden. Aufgrund ihres großen Einsatzpotenzials in der Klinik hat die Kombination von gezielten NIR-Kontrastmitteln mit PAFC großes Interesse für den Nachweis von CTCs geweckt.
PAFC in Kombination mit gezielten Kontrastmitteln bietet einen verbesserten Ansatz für die Analyse von Patientenproben mit hohem Durchsatz mit verbesserter Genauigkeit und gezielter Detektion von CTCs. Eine der wichtigsten Nachweisstrategien für CTCs ist die spezifische Ausrichtung von Membranproteinen, die auf der Zelle von Interesse vorhanden sind. Ein bemerkenswertes Merkmal von Eierstock-CTCs ist die Überexpression von Folatrezeptoren auf ihrer äußeren Membran19. Folatrezeptor-Targeting ist eine ideale Strategie für die Identifizierung von Eierstock-CTCs im Blut, da endogene Zellen, die eine höhere Expression von Folsäurerezeptoren haben, in der Regel luminal sind und eine begrenzte Exposition gegenüber dem Blutkreislauf20haben. Kupfersulfid NPs (CuS NPs) wurden vor kurzem für ihre Fähigkeit, Folat-Rezeptoren auf Krebszellen exprimiert21anerkannt. Kombiniert mit ihrer Biokompatibilität, einfachen Synthese und Absorption tief im NIR, bilden diese NP-Kontrastmittel eine ideale Targeting-Strategie für den Nachweis von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC.
Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung von FA-CuS NPs und deren Verwendung für den Nachweis von Eierstockkrebszellen in einem photoakustischen Strömungssystem. CuS NPs werden mit Folsäure modifiziert, um gezielt Ovarial-CTCs anzusprechen und ein photoakustisches Signal auszusenden, wenn sie mit einem 1.053 nm Laser stimuliert werden. Die Ergebnisse deuten auf den erfolgreichen Nachweis von Eierstockkrebszellen hin, die mit diesen photoakustischen Kontrastmitteln innerhalb des PAFC-Systems inkubiert werden. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis von Eierstockkrebszellen bis hin zu Konzentrationen von 1 Zelle/L, und die Fluoreszenzmikroskopie bestätigt die erfolgreiche Aufnahme dieser Partikel durch SKOV-3 Eierstockkrebszellen22. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der FA-CuS NPs Synthese, die Vorbereitung von Proben für die Fluoreszenzmikroskopie, den Aufbau des photoakustischen Strömungssystems und die photoakustische Detektion von Eierstockkrebszellen. Die vorgestellte Methode zeigt eine erfolgreiche Identifizierung von Eierstock-CTCs im Fluss unter Verwendung von FA-CuS NPs. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die klinische Anwendung dieser Technologie zur Früherkennung von Eierstockkrebsmetastasen konzentrieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nanopartikelsynthese und Funktionalisierung
ANMERKUNG: Die Synthese der FA-CuS NPs wird mit einer Ein-Topf-Synthesemethode erreicht, die an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll21angepasst wurde.
VORSICHT: Die gesamte Synthese sollte in einer belüfteten chemischen Rauchhaube erfolgen.
- Vor der Synthese etwa 300 ml deionisiertes (DI) Wasser durch einen 0,2 m sterilen Filter filtern.
- Reinigen Sie einen 250 ml Glaskolben mit einer Waschmittellösung und spülen Sie ihn mit DI-Wasser ab. Fügen Sie 0,0134 g CuCl2 in 100 ml DI-Wasser hinzu, um eine 1 mM Lösung zu erstellen.
- 0,015 g Folsäure (FA) in die CuCl2-Lösung geben und mit einem magnetischen Rührstab 5 min rühren.
- Fügen Sie Na2S-9H2O (0,024 g in 100 l DI-Wasser) über ca. 10 s zum Reaktionsgemisch hinzu, wobei eine 200-L-Pipette verwendet wird.
HINWEIS: Nach Zugabe des Na2S-9H2O ändert sich die Farbe von hellgelb zu dunkelbraun. - Die Reaktion verriegeln und in ein Ölbad legen, auf 90 °C eingestellt, und weiter mit einem magnetischen Rührstab rühren. Nach ca. 15 min oder wenn das Ölbad 85 bis 90 °C erreicht hat, lassen Sie die Reaktion für eine weitere Stunde ablaufen. Ihre Mischung sollte sich nach und nach in eine dunkelgrüne Farbe verwandeln.
HINWEIS: Achten Sie darauf, das System zu entlüften, während Sie das Reaktionsgemisch erhitzen, um Druckaufbau zu vermeiden. - Entfernen Sie das Reaktionsgefäß aus dem Ölbad und kühlen Sie es bei Raumtemperatur ca. 10 bis 15 min kurz ab, bevor Sie in ein Eisbad überführen.
- Sobald das Reaktionsgemisch unter 20 °C abgekühlt ist, stellen Sie den pH-Wert auf 10 unter Verwendung von 1M NaOH ein, um die verbleibende Folsäure in Lösung aufzulösen.
- Reinigen Sie das FA-CuS-Reaktionsgemisch mit einer 30 kDa Zentrifugationskolore. Fügen Sie die Lösung in 15 ml Chargen in die Säule und Zentrifuge bei 3.082 x g für 15 min.
- Sobald das gesamte Reaktionsgemisch konzentriert ist, die konzentrierten Fraktionen neu kombinieren und 4x mit 15 ml pH 10 NaOH in der 30 kDa Zentrifugationskolorein waschen.
- Nehmen Sie für Massenmessungen 1/3 der Lösung (ca. 66 l) und teilen Sie sich in drei Glasfläschchen auf. Im Vakuumofen über Nacht bei 40 °C unter einem Vakuum von 27 mmHg trocknen.
- Lösen Sie die anderen 2/3 der konzentrierten Lösung in 250 l PBS auf und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.
- Vor der Verwendung der FA-CuS NPs, beschallen Sie sie für 30 min in einem Bad Beschallungsgerät auf einer hohen Einstellung.
2. NP-Charakterisierung
- Dynamische Lichtstreuung (DLS) Hinzufügen von 10 l konzentrierten FA-CuS NPS in PBS-Lösung von Schritt 1.1.14 bis 2 ml DI-Wasser. Beschallen Sie die Partikel vor der Charakterisierung durch DLS 30 min in einem Badbeschalltosonicator auf einer hohen Einstellung und filtern Sie durch einen 0,2 m sterilen Filter, um Reststaub zu entfernen.
- Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchführen: Fügen Sie 10 L konzentrierte FA-CuS NPS in PBS-Lösung zu einem Stück Wachspapier hinzu. Invertieren Sie ein Formvar beschichtetes Kupfergitter auf der Oberseite des Tröpfchens und lassen Sie 2 min sitzen. Berühren Sie den Rand des Formvar-beschichteten Gitters auf ein Stück Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Die Luft trocknen lassen. Bild des Kupfergitters mit einem Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV.
HINWEIS: Typische Ergebnisse der FA-CuS NPS-Charakterisierung sind in Abbildung 1dargestellt.
3. Zellkultur
- Dieses Protokoll verwendet SKOV-3-Zellen. Sofern nicht anders angegeben, Kultur SKOV-3-Zellen in McCoys 5A-Medium mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin ergänzt, und halten bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Inkubator.
4. Fluoreszierende Kennzeichnung von FA-CuS NPS für die Mikroskopie
- Fügen Sie Texas-Red-X Succinimidylester (0,2 mg in DMSO in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst) zu einer Lösung hinzu, die 2 mg FA-CuS NPs in 1 ml mit 0,1 M NaHCO3 (pH-9) Puffer enthält.
- Rühren Sie das Reaktionsgemisch mit einem magnetischen Rührstab für 1 h, weg vom Licht bei Raumtemperatur.
- Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch in einer 4 ml 30 kDa MWCO Zentrifugationskolorekationskolonne, indem Sie 10 min bei 4.000 x g drehen.
- Waschen Sie die konzentrierte Lösung 3x mit 4 ml 0,1 M NaHCO3 Puffer (pH 9) in einer Zentrifugationskolonne. Anschließend die konzentrierte Lösung mit 4 ml DI-Wasser 3x waschen oder nur eine Spurenmenge fluoreszenz im Durchfluss durch UV-VIS sichtbar bleibt.
5. FA-CuS NPS Aufnahme durch Eierstockkrebszellen
- Vor der Inkubation mit FA-CuS NPs sKOV-3-Zellen in einem T75-Kolben mit 8-15 ml folsäurefreiem RPMI-1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin für mindestens 24 h inkubieren.
- Samenzellen in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 vervollständigen Wachstumsmedien mit einer Dichte von 0,1 x 106 Zellen/ml in eine 24-Well-Platte.
- Am nächsten Tag inkubieren Sie Zellen mit 400 g/ml FA-CuS NPS in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 komplettem Wachstumsmedium für 2 h.
- Nach dieser Inkubation versuchen Sie die Zellen mit 0,5 ml 0,25% Trypsin mit EDTA. Fügen Sie mindestens 1 ml folsäurefreie RPMI-1640 komplette Wachstumsmedien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 123 x g für 6 min.
- Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 2 ml PBS wieder auf und zentrifugieren Sie bei 123 x g für 6 min. Führen Sie diesen Waschschritt 2x durch, um ungebundene NPs zu entfernen.
- Setzen Sie die Zellen in 1 x 2 ml PBS mit 2% Tween-Lösung aus.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Weitere verdünnte Zellen, wenn die Zellzahl zu hoch ist. Verdünnung der Zellen in PBS mit 2% Tween zur gewählten Konzentration zum Nachweis.
- Die Zellen können nun vom PAFC-System analysiert werden.
6. Fluoreszenzmikroskopie der FA-CuS NPS-Aufnahme
- Wiederholen Sie die in Schritt 5.1 aufgeführten Schritte, und fahren Sie mit dem protokoll unten für die Mikroskopie fort.
- Samenzellen mit einer Dichte von 0,1 x 106 Zellen/ml in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 komplettem Wachstumsmedium auf Glasabdeckungen in einer 24-Well-Platte.
- Am nächsten Tag inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszierend markierten FA-CuS NPs in Dreifache, in Konzentrationen von 100 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml und 400 g/ml in 0,5 ml folsäurefreier RPMI-1640-
- Inkubieren Sie die Zellen mit den NPs für 2 h im 37 °C-Inkubator
- Waschen Sie die Zellen nach dieser Inkubationszeit 3x mit PBS.
HINWEIS: Für alle Waschschritte, fügen Sie vorsichtig die Lösung auf der Seite der Brunnenplatte, um die Zellen nicht zu stören. Nach dem Hinzufügen, vorsichtig kippen Sie die Platte und ziehen Sie die Lösung von der Seite des Brunnens. - Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml 3,7% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min und übertragen Sie die Glasabdeckungen auf eine neue 24 Wellplatte.
VORSICHT: PFA ist ein bekanntes Karzinogen. Machen Sie alle Fixierung in einer belüfteten chemischen Rauchhaube und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung. - Inkubieren Sie die Zellen in einer Lösung von 3,7% PFA mit 0,1% Triton-X in PBS für 5 min.
- Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für jeweils 5 min und übertragen Sie die Abdeckungen auf eine neue Platte.
- Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml einer PBS-Lösung, die DAPI enthält (20 l/ml einer 0,5 mg/ml-Stammlösung wird für die Färbung verwendet) für 5 min, weg vom Licht.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS 3x.
- Nach der abschließenden PBS-Wäsche die Abdeckungen auf Dias mit Montagemedium montieren.
- Die Zellen sind nun bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet zu werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die typische Zellcharakterisierung durch Fluoreszenzmikroskopie.
7. Strömungssystemarchitektur
- Strömungskammerbau
HINWEIS:Eine SolidWorks-Datei eines 3D-gedruckten Durchflussbehälters finden Sie in den Ergänzungsmaterialien.- Drucken Sie den Durchflussbehälter mit der mitgelieferten SolidWorks-Datei mit ABS-Thermoplast oder PLA-Kunststoff. Dimensionen werden unten angegeben, wenn SolidWorks nicht verfügbar ist. Abbildung 3A zeigt eine Darstellung dieses Modells. Der Körper des Durchflussbehälters ist 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm groß. Die weiten Enden des Durchflussbehälters enthalten Löcher mit einem Durchmesser von ca. 5 mm, um den Eintritt von Schläuchen zu ermöglichen, die das Kapillarrohr enthalten.
HINWEIS: Der Durchflussbehälter hat ein 1 cm loch, senkrecht zur Ausrichtung des Kapillarrohres, für die Platzierung des Ultraschallwandlers. Eine zylindrische Extrusion mit dem gleichen Innendurchmesser wie das Loch erstreckt sich 6 mm in den Tank. Für die Echtzeit-Bildgebung verfügt der Durchflussbehälter über einen Schlitz von 1 mm x 3 mm direkt unter dem Kapillarrohr. - Nach dem Drucken des 3D-Durchflussbehälters das System reinigen und montieren.
- Legen Sie Glasabdeckungen über den Schlitz 1 mm x 3 mm und das 1 cm Loch in das Durchflusssystem.
- Sorgfältig mit Silikon versiegeln, um Leckagen zu vermeiden.
- Das Kapillarrohr in die silikongehärteten Rohre einbauen. Stecken Sie die Rohre in die Durchflusskammer durch die Seite des Durchflussbehälters, so dass sich das Glaskapillarrohr direkt über und vor dem 3 mm Schlitz und dem 1 cm Loch befindet.
- Versiegeln Sie die Schläuche mit Silikon, um Leckagen zu verhindern.
- Drucken Sie den Durchflussbehälter mit der mitgelieferten SolidWorks-Datei mit ABS-Thermoplast oder PLA-Kunststoff. Dimensionen werden unten angegeben, wenn SolidWorks nicht verfügbar ist. Abbildung 3A zeigt eine Darstellung dieses Modells. Der Körper des Durchflussbehälters ist 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm groß. Die weiten Enden des Durchflussbehälters enthalten Löcher mit einem Durchmesser von ca. 5 mm, um den Eintritt von Schläuchen zu ermöglichen, die das Kapillarrohr enthalten.
- Photoakustisches Durchflusssystem-Setup
ANMERKUNG: Abbildung 3B und Abbildung 3C zeigen ein Beispiel für die Strömungssystemarchitektur.- Schließen Sie den Messumformer an einen Ultraschallpulser/Empfänger an. Verstärken Sie das Signal mit einer 59 dB Verstärkung.
- Schließen Sie den Ausgang des Filters an ein vielseitiges, rekonfigurierbares Oszilloskop mit integriertem, programmierbaren Feld-Gate-Array an.
- Verbinden Sie eines der Rohre, die aus der Durchflusskammer kommen, an eine T-Kreuzung, die an jedem Zweig mit zwei Spritzenpumpen verbunden ist.
- Füllen Sie eine der Spritzenpumpen mit Luft und die andere Pumpe mit der zu analysierenden Probe. Stellen Sie die Mitluftpumpe auf einen Durchfluss von 40 l/min und die Pumpe, die die Probe enthält, auf einen Durchfluss von 20 l/min. Der resultierende zweiphasige Durchfluss erzeugt Probenvolumen von 1 L. Bei dieser Durchflussrate testet das System ca. 6,4 Proben pro Minute.
HINWEIS: Um eine konsistente Verteilung der Zellen aufrechtzuerhalten, wirbeln Sie jede Probe unmittelbar vor dem Test leicht aus. Drehen Sie die Spritze außerdem alle paar Minuten, um zu verhindern, dass sich die Zellen in der Lösung absetzen. - Schließen Sie das verbleibende Rohr, das das Durchflusssystem verlässt, an einen Behälter mit 10% Bleichmittel an, um Zellen nach dem Verlassen des Durchflusssystems zu entsorgen.
HINWEIS: Prüfen Sie vor der Nutzung des Durchflusssystems, ob Leckagen vorgewirkt werden, da diese den Durchfluss beeinflussen können. Zellen müssen in einem geschlossenen System enthalten sein, um die biologische Sicherheit während des Verfahrens aufrechtzuerhalten. - Das Design des 3D-gedruckten Tanks ermöglicht eine konsistente und wiederholbare Ausrichtung zwischen Messumformer und Laserlicht bei minimaler Kalibrierung. Wenn sie richtig in den kundenspezifischen Tank gelegt werden, sorgt das Quarzkapillarrohr dafür, dass Der Messumformer und der Laser direkt ausgerichtet sind.
- Stellen Sie den Abschnitt des Quarzkapillarrohres in direkter Ausrichtung mit dem Messumformer in das Sichtfeld des Mikroskops, so dass die optische Faser über der Probe sorgfältig platziert werden kann, so dass sie die gesamte Breite des Rohres beleuchtet.
- Bestrahlen Sie die Probe mit einer optischen Faser, die einen diodengepumpten Festkörperlaser kanalisiert, der mit einer Wellenlänge von 1.053 nm arbeitet. Das Laserlicht, das auf die Probe einwirkt, und der Messumformer, mit dem der photoakustische Effekt gemessen wird, sind beide unfokussiert.
- Die Energie des Lasereinfalls auf der Probe beträgt ca. 8 mJ und die 10 Hz-Laserrate reicht aus, um jede Probe beim Durchlaufen des Systems mehrmals zu beleuchten.
- Platzieren Sie das Durchflusssystem auf einem invertierten Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sowohl der Laserpuls als auch der Pfad der Probe sichtbar sind, während die Probe durch das Durchflusssystem verläuft. Zeichnen Sie den Durchfluss mit einer mit dem Mikroskop montierten Kamera auf.
- Zeichnen Sie die Ultraschallerfassungen mithilfe von Datenerfassungssoftware auf (siehe Tabelle der Materialien). Lösen Sie Ultraschall und gepulsten Laser mit dem FPGA. Verwenden Sie PBS mit 2% Tween und FA-CuS NPs mit einer Konzentration von 100 g/ml in PBS 2% Tween, als negative bzw. positive Kontrollen.
- Zeichnen Sie mithilfe einer mit dem Mikroskop montierten Kamera sowohl das Abfeuern des Lasers als auch den Durchgang von Proben durch das Durchflusssystem auf. Diese Aufnahmen werden verwendet, um das vom Messumformer aufgezeichnete akustische Signal mit dem Abfeuern des Lasers zu korrelieren. Wenn die Proben vor dem Abfeuern des Lasers verlaufen, kann das Signal dann zur Analyse mit dem resultierenden photoakustischen Signal korreliert werden. Bei einer Abtastrate von 10 Hz beleuchtet der Laser jeden Stecker mehrmals.
8. Nachbearbeitung
- Berechnen Sie für jede Signalaufnahme s(t) die Hilbert-Transformation H[s(t)], um ein analytisches Signal zu erzeugen.
- Erstellen Sie einen komplexen Umschlag, se(t), indem Sie
die Größe des Analysesignals berechnen, so dass und integrieren Sie den Umschlag, um das Gesamtsignal zu messen, das aus jeder Erfassung resultiert. Vergleichen Sie die Signale jeder Testgruppe (d. h. PBS, markierte Zellen, FA-CuS-NPs, Zellen allein) unter Verwendung eines t-Tests in der r.-Statistiksoftware. Rohe photoakustische Signale und ihre Hilbert-Transformationen sind in Abbildung 4dargestellt. - Normalisieren Sie für die Bildrekonstruktion den komplexen Umschlag basierend auf dem maximalen Peak während des gesamten Laufs. Wenn Sie eine Reihe von Durchläufen vergleichen, normalisieren Sie den komplexen Umschlag mithilfe der maximalen Spitze über die gesamte Serie hinweg. Konvertieren Sie nach der Normalisierung jede Erfassung in eine Reihe von Pixelwerten. Stellen Sie jede Reihe von Pixelwerten als Spalte in der Bildrekonstruktion dar. Repräsentative Rekonstruktionen von PBS- und FA-CuS-NPs-Signalen sind in Abbildung 5dargestellt, wo beide Bilder mit der maximalen Spitze über beide Durchläufe normalisiert wurden.
die Größe des Analysesignals berechnen, so dass und integrieren Sie den Umschlag, um das Gesamtsignal zu messen, das aus jeder Erfassung resultiert. Vergleichen Sie die Signale jeder Testgruppe (d. h. PBS, markierte Zellen, FA-CuS-NPs, Zellen allein) unter Verwendung eines t-Tests in der r.-Statistiksoftware. Rohe photoakustische Signale und ihre Hilbert-Transformationen sind in Abbildung 4dargestellt.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1A zeigt ein typisches TEM-Bild der synthetisierten Nanopartikel. Die durchschnittliche Größe des typischen Nanopartikels beträgt ca. 8,6 nm bei 2,5 nm. Die Nanopartikelmessung wurde in ImageJ durchgeführt. Schwellen- und Wassereinzugsgebietsfunktionen wurden angewendet, um die Partikel für die Messung zu trennen. Die horizontalen und vertikalen Durchmesser jedes Teilchens wurden senkrecht zueinander gemessen und weiter gemittelt. Für DLS ist eine repräsentative Messung in Abbildung 1Bdargestellt. Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser für diese Partikel beträgt 73,6 nm. Kupfersulfid-Nanopartikel haben eine charakteristische Absorptionskurve, die sich bis ins NIR erstreckt, wie in Abbildung 1Cdargestellt. Es gibt ein leichtes Artefakt um 850 nm, das durch das Schalten von Lasern durch das Spektralphotometer verursacht wurde.
Fluoreszenzmikroskopiebilder von Zellen, die mit fluoreszierend markierten Nanopartikeln inkubiert werden, sind in Abbildung 2zu sehen. Die Aufnahme von Nanopartikeln kann durch das Vorhandensein von Fluoreszenz in der Zelle visualisiert werden. Zellen, die nicht mit Nanopartikeln inkubiert werden, zeigen kein Fluoreszenzsignal. Das Vorhandensein dieses Fluoreszenzsignals zeigt die erfolgreiche Aufnahme der Partikel und ihre Fähigkeit, im Strömungssystem detektiert zu werden.
Abbildung 3 zeigt die allgemeine Einrichtung des photoakustischen Durchflusssystems. Abbildung 3A zeigt ein detailliertes Modell der 3D-Durchflusskammer. Diese Kammer kann mit der mit diesem Protokoll gelieferten .stl-Datei gedruckt werden. Abbildung 3B zeigt einen Überblick über die Einrichtung des Durchflussbehälters. Abbildung 3C zeigt eine allgemeine Einrichtung des Durchflussbehälters und des Datenerfassungssystems.
Typische Datenerfassungssignale sind in Abbildung 4dargestellt. Die Rohdaten zeigen die Unterschiede im Signal zwischen den nanopartikelmarkierten Zellen, PBS und FA-CuS NPs an. Eine Erfassung ist das resultierende photoakustische Signal, das aus einem einzelnen Laserpuls erzeugt wird. Aufgrund der schnellen Abschussrate des Lasers erzeugt jede analysierte Probe mehrere Erfassungen. Mit der Hilbert-Transformation wurde ein Umschlag für jede einzelne Akquisition generiert. Diese Hülle wurde integriert, um die Gesamtmenge des vom Laserpuls erzeugten Signals zu messen. In einer früheren Studie wurden diese Daten mit der r.statistischen Software analysiert, wobei die Anzahl der für den t-Test analysierten Erfassungen 203, 150, 160 und 131 für Zellen mit NPs, Zellen allein, PBS und NPs allein22betrug. Die Daten wurden durch Log-Transformation normalisiert und unter Verwendung eines Welch-T-Tests in R verglichen. Die Signale, die allein aus den FA-CuS NPs in einer Konzentration von 100 g/ml resultieren, zeigten ein viel höheres Signal als die Negativkontrolle. Der Unterschied in den Signalen zwischen der Negativkontrolle und den markierten Eierstock-CTCs war subtiler als die positive Kontrolle, konnte aber durch die Analyse ihrer Mittel durch einen t-Test22erkannt werden.
Unter Verwendung der benutzerdefinierten LabView- und MATLAB-Software wurden Bildrekonstruktionen der positiven und negativen Kontrollen in Echtzeit bzw. nach der Erfassung vorgenommen. Um die photoakustischen Rekonstruktionen zu generieren, wurde mit Hilfe der Hilbert-Transformation ein Umschlag jeder Anschaffung berechnet. Einzelne Umschläge wurden anschließend in Pixelwerte konvertiert und als unabhängige Spalten angezeigt. Deutliche Unterschiede im photoakustischen Signal treten zwischen den FA-CuS NPs bei einer Konzentration von 100 g/ml und der PBS-Probe auf (Abbildung 5). Steuerungen für das System sind wichtig, um sicherzustellen, dass das System ein photoakustisches Signal produziert, das vom Messumformer erkannt werden kann.
Abbildung 1: Repräsentative NP-Charakterisierung. (A) TEM-Bild von synthetisierten FA-CuS NPs. Scale bar = 50 nm. (B) Repräsentative DLS-Intensitätsverteilung der synthetisierten FA-CuS NPs. (C) Repräsentative FA-CuS NPs Absorptionskurve. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Fluoreszenzmikroskopiebilder von SKOV-3-Zellen. Die Zellen wurden mit und ohne 400 g/mL fluoreszierend mit NPs begortend inkubiert. Scale bar = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder des photoakustischen Durchflusszytometriesystems und der Durchflusskammer. (A) Detailansicht der 3D-gedruckten Durchflusskammer. (B) Diagramm des PAFC-Systems. (C) Strömungssystemarchitektur: SP = Spritzenpumpe; DAQ/FPGA = Datenerfassung/Feld programmierbares Gate-Array; Ob = Objektivlinse; VON = Glasfaser; FC = Faserkoppler; UT = Ultraschallwandler; FT = Durchflussbehälter. Diese Figur ist von Lusk et al.22adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentatives Rohdatensignal und Hilbert transformiert die im Durchflusssystem getesteten Proben. (A) Repräsentatives Rohdatensignal von PBS und Zellen, die mit NPs inkubiert werden, und der (D) Hilbert-Transformation der Daten. (B) Repräsentatives Rohdatensignal aus den Zellen allein und den Zellen, die mit FA-CuS NPs und (E) der Hilbert-Transformation der Daten inkubiert werden. (C) Repräsentatives Rohdatensignal von PBS und 100 g/ml FA-CuS NPs und (F) die Hilbert-Transformation der Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative fotoakustische Bildrekonstruktionen der photoakustischen Daten. (A) Bildrekonstruktion von 100 g/ml FA-CuS NPs und (B) PBS, die im Durchflusssystem getestet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Durchflusskammer STL. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll ist eine einfache Methode zur Erkennung von Eierstock-CTCs unter Verwendung von PAFC und einem gezielten CuS-Kontrastmittel. Viele Methoden wurden für den Nachweis von Eierstock-CTCs erforscht, einschließlich mikrofluidischer Geräte, RT-PCR und Fluoreszenz-Flow-Zytometrie23,24,25. Diese reichen von Komplexität, Kosten und Genauigkeit, wodurch ihre Wirksamkeit in klinischen Umgebungen eingeschränkt wird. PAFC bietet mehrere Vorteile gegenüber diesen herkömmlichen Methoden für die Detektion von CTCs, einschließlich der Fähigkeit, CTCs in Patientenproben zu erkennen, und seiner einfachen Übersetzung in In-vivo-Anwendungen. PAFC hat auch gezeigt, dass CTCs in vitro und in vivo in Kombination mit gezielten Kontrastmitteln26,27genau detektieren.
In dieser Arbeit wurden FA-CuS NP-Kontrastmittel auf ihre Fähigkeit untersucht, die Genauigkeit des CTC-Nachweises bei physiologisch relevanten Konzentrationen zu verbessern. Studien wurden mit isolierten SKOV-3-Zellen durchgeführt, die in PBS resuspendiert wurden. Die Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigte die erfolgreiche Aufnahme dieser Partikel. Die Ergebnisse detektiert SKOV-3-Zellen bis zu einer Konzentration von 1 Zelle/ L22. Entscheidende Schritte in diesem Protokoll sind die Nanopartikelsynthese und die Ausrichtung des photoakustischen Strömungsaufbaus. Während der Nanopartikelsynthese ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Lösung eine dunkelgrüne Farbe gedreht hat, bevor die Mischung aus dem Ölbad entfernt wird. Für das Durchflusssystem ist eine negative und positive Steuerung durch das System vor der Probeprüfung erforderlich, um sicherzustellen, dass das System ein ausreichendes photoakustisches Signal für die nachträgliche Detektion von markierten Zellen erzeugt. Beim Betrieb des Durchflusssystems ist es wichtig sicherzustellen, dass das einfallende Licht der Lichtoptik das Kapillarrohr vollständig beleuchtet und der Messumformer an der Seite der Durchflusskammer anschnallen muss. Schließlich ist eine strenge Prüfung des Systems auf Leckagen erforderlich, um die biologische Sicherheit des Systems zu gewährleisten und einen gleichmäßigen Durchfluss durch die Kammer zu gewährleisten.
Für das aktuelle PAFC-System bestätigten Vorstudien die photoakustische Detektion mit dem Messumformer und Amplifikationssystem. Die meisten dieser Signale bestanden aus Niederfrequenzsignalen (<20 MHz). Weitere Studien sind erforderlich, um zu bestätigen, ob dies auf die tatsächliche Frequenz der erzeugten photoakustischen Signale oder die 35 MHz Bandbreite des Verstärkers zurückzuführen ist. Zukünftige Studien werden die Frequenzkomponenten der erfassten Signale untersuchen, um die Zentrale Frequenz des Messumformers sowie die Bandbreite des Verstärkersystems zu optimieren. Das aktuelle System eignet sich speziell für die Ex-vivo-Detektion von CTCs. Diese Methode identifiziert jedoch das Potenzial für die zukünftige Anwendung von FA-CuS NPs in vivo.
Zukünftige Studien zielen darauf ab, Eierstockkrebszellen in gemischten Kulturen, menschlichen klinischen Proben und in vivo Modellen28,29,30zu erkennen. Darüber hinaus werden in zukünftigen Studien die Spezifität dieser Nanopartikel im Vergleich zu nicht zielgerichteten Kontrollen untersucht. Zukünftige Validierungen dieser Methode umfassen die Erprobung dieses Tools mit klinischen Proben am Menschen, die Implementierung von Tests und Analysen mit hohem Durchsatz sowie die Übersetzung in klinische Umgebungen. Diese photoakustische Technik zeigt Potenzial für zukünftige Übersetzungen in eine Vielzahl von klinischen Anwendungen und Krankheiten in einer Reihe von Kontrastmitteln und Analyten. Der photoakustische Nachweis von Analyten, die PAFC verwenden, hat das Potenzial, den Point-of-Care-Nachweis von CTCs und anderen Krankheitserregern schneller und kostengünstiger zu machen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen Madeleine Howell für ihre Hilfe bei der Synthese, Matthew Chest für seine Hilfe bei der Entwicklung des Strömungssystems und Ethan Marschall für die Unterstützung bei SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
