Summary
פרוטוקול מוצג כדי לזהות במחזור תאים סרטניים בשחלות ניצול מערכת מותאמת אישית של הזרמת פוטואקוסטית וממוקד חומצה פולית-הכתיר נחושת גופרתי.
Abstract
מחקרים רבים מראים כי הספירה של תאים סרטניים במחזור (CTCs) עשוי להראות הבטחה ככלי התחזיות לסרטן השחלות. אסטרטגיות נוכחיות לאיתור CTCs כוללות זרימה cy, התקנים מיקרו-פלואידים, ותגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR). למרות ההתקדמות האחרונה, שיטות לאיתור גרורות סרטן השחלות המוקדמות עדיין חסר רגישות וספציפיות הנדרשות עבור תרגום קליני. כאן, שיטה הרומן מוצג לאיתור של תאים סרטניים במחזור השחלות על ידי הזרמת פוטואקוסטית cy, שימוש במערכת הדפסה תלת ממדית מותאמת אישית (3D), כולל תא זרימה ומשאבת מזרק. שיטה זו משתמשת חומצה פולית-הכתיר נחושת ננו חלקיקים (פא-CuS NPs) כדי למקד את סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות על ידי פכ. עבודה זו ממחישה את האהדה של סוכני הניגוד האלה לתאים סרטניים בשחלות. התוצאות מציגות אפיון NP, זיהוי פג, ו קליטת NP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית, ובכך להפגין את הפוטנציאל של המערכת הזאת הרומן לזהות CTCs השחלות בריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
Introduction
סרטן השחלות הוא אחד ממאירות גינקולוגית הקטלנית והביא המשוער 184,800 מקרי מוות ברחבי העולם ב 20181. מחקרים מרובים הראו את הקורלציה בין התקדמות סרטן השחלות (כלומר, גרורות) ונוכחות של ctcs2,3,4. השיטה הנפוצה ביותר לאיתור ובידוד של CTCs מנצל את מערכת Cellsearch, אשר מטרות קולטן EpCam5. ביטוי EpCam, עם זאת, הוא מוסדר באפיתל למעבר mesenchymal, אשר היה מעורב גרורות סרטן6. למרות ההתקדמות, הטכנולוגיות הקליניות הנוכחיות עדיין סובלות מדיוק נמוך, מעלות גבוהה וממורכבות. בשל החסרונות האלה, טכנולוגיות חדשות לגילוי וספירה של CTCs השחלות הפך לאזור חשוב למחקר.
לאחרונה, פלק התפתחה כשיטה יעילה לזיהוי לא פולשני של תאים סרטניים, ניתוח של ננו, זיהוי של חיידקים7,8,9. פגבי שונה מן זרם הזריחה המסורתית cy, לנסות על ידי זיהוי האנליטים בזרימה על ידי ניצול פוטואקוסטיקה. אפקט פוטואקוסטי מופק כאשר אור לייזר נספג על ידי חומר שגורם הרחבה תרמואלסטית, הפקת גל אקוסטי שניתן לזהות על ידי מתמר אולטרסאונד10,11. היתרונות של פטוג מעל הזרימה המסורתית של השיטות הללו כוללות פשטות, תרגום קלות להגדרות קליניות, ואיתור ctcs בעומקים חסרי תקדים בדגימות החולה12,13. מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו מערכות פלק לאיתור תאים באמצעות אנדודוגני ו בניגוד אקסוגני14,15. ליד אינפרא אדום (ניר) האור סופג סוכני ניגודיות כגון לצבוע ירוק indocyanine, ו מתכת NPs (למשל, זהב ו-CuS) שימשו תיוג סלקטיבי של תאים ורקמות בשילוב עם הדמיה פוטואקוסטית16,17,18. בשל עומק החדירה המשופר של אור ניר בתוך רקמות ביולוגיות, זיהוי פוטואקוסטי של בולמי ניתן לבצע בעומקים גדולים יותר עבור יישומים קליניים. בשל הפוטנציאל הגדול שלה לשימוש במרפאה, השילוב של סוכני ניגוד ממוקד של ניר עם פלק יצר עניין רב באיתור CTCs.
בשילוב עם סוכני ניגודיות ממוקדים מספק גישה משופרת לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות מטופלים עם דיוק משופר וזיהוי ממוקד של CTCs. אחת מאסטרטגיות הזיהוי העיקריות של CTCs היא המיקוד הספציפי של חלבונים ממברנה נוכח בתא העניין. אחד המאפיינים הבולטים של CTCs השחלות הוא ביטוי יתר של קולטני חומצה פולית הממוקם על הממברנה החיצונית שלהם19. קולטן חומצה פולית מיקוד היא אסטרטגיה אידיאלית לזיהוי של CTCs השחלות בדם בגלל תאים אנדוגניים, אשר יש ביטוי גבוה יותר של קולטני חומצה פולית, הם בדרך כלל לומיאל ויש להם חשיפה מוגבלת למחזור הדם20. נחושת גופרתי NPs (קוס NPs) הכירו לאחרונה על יכולתם למקד קולטני חומצה פולית הביע על תאים סרטניים21. בשילוב עם תאימות ביולוגית שלהם, קלות הסינתזה והקליטה עמוק בניר, סוכני הניגודיות של NP אלה משלבים אסטרטגיית פילוח אידיאלית לאיתור השחלות CTCs באמצעות פכ.
עבודה זו מתארת את הכנת הפא-קוס NPs והשימוש בהם לאיתור תאים סרטניים בשחלות במערכת הזרמת פוטואקוסטית. CuS NPs משתנים עם חומצה פולית כדי במיוחד למקד CTCs השחלות לפלוט אות פוטואקוסטי כאשר מגורה עם 1,053 ננומטר לייזר. התוצאות מצביעות על גילוי מוצלח של תאים סרטניים בשחלות מודבטים עם אלה הסוכנים הניגוד פוטואקוסטי בתוך מערכת פכ. תוצאות אלה מציגות זיהוי של תאים סרטניים בשחלות למטה לריכוזים של תא 1/μL, ומיקרוסקופ פלואורסצנטית מאשרת ספיגה מוצלחת של חלקיקים אלה על ידי סקוב-3 סרטן השחלות תאים22. עבודה זו מספקת תיאור מפורט של סינתזה פא-קוס NPs, הכנת דגימות עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטית, בנייה של מערכת הזרימה פוטואקוסטית, וזיהוי פוטואקוסטי של תאים סרטניים בשחלות. השיטה המוצגת מציגה זיהוי מוצלח של CTCs השחלות בזרימה ניצול פא-CuS NPs. העבודה העתידית תתמקד ביישום הקליני של טכנולוגיה זו לקראת גילוי מוקדם של גרורות סרטן השחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה הננו-חלקיק והפונקציונליזציה
הערה: סינתזה של ה-FA-CuS NPs מושגת באמצעות שיטת סינתזה של סיר אחד המותאמת לפרוטוקול21שפורסם בעבר.
התראה: כל הסינתזה אמורה להופיע במיזוג כימי מאוורר.
- לפני סינתזה, לסנן כ 300 mL של מים מוכי (DI) למרות 0.2 יקרומטר מסנן סטרילי.
- נקה בקבוקון זכוכית 250 mL עם פתרון לניקוי ולשטוף עם מים DI. הוסף 0.0134 g של CuCl2 לתוך 100 mL של מים די כדי ליצור פתרון 1 מ"מ.
- הוסף 0.015 גרם של חומצה פולית (FA) לפתרון CuCl2 ומערבבים עבור ~ 5 דקות באמצעות בר מגנטי מעורר.
- הוסף Na2S · 9h2O (0.024 g ב 100 μl די מים) מעל כ 10 S לתערובת התגובה ניצול של 200 μl.
הערה: בעת הוספת Na2S · 9h2O, הפתרון ישתנה צבע מצהוב בהיר לחום כהה. - מניחים את התגובה ואת המקום באמבט שמן, שנקבע עד 90 ° c, וממשיכים לערבב עם בר מגנטי מעורר. לאחר כ -15 דקות, או כאשר אמבטיית השמן הגיעה ל-85-90 ° c, אפשר להמשיך בתגובה לשעה נוספת. התערובת שלך צריכה להפוך בהדרגה לצבע ירוק כהה.
הערה: הקפד לפרוק את המערכת תוך חימום תערובת התגובה כדי למנוע הצטברות לחץ. - הסירו את כלי התגובה ממרחץ השמן והצוננים לזמן קצר בטמפרטורת החדר במשך כ -10 עד 15 דקות לפני המעבר לאמבט קרח.
- לאחר תערובת התגובה התקרר מתחת 20 ° צ', להתאים את ה-pH כדי 10 ניצול של 1M NaOH לפזר את שארית חומצה פולית לתוך הפתרון.
- לטהר את תערובת התגובה פא-קוס באמצעות 30 kDa צנטריפוגה טור. הוסף פתרון ב -15 אצוות mL לעמודה ולצנטריפוגה ב 3,082 x g עבור 15 דקות.
- לאחר כל תערובת התגובה היה מרוכז, לשלב מחדש את השברים מרוכז לשטוף 4x עם 15 מ ל של pH 10 NaOH ב 30 kDa צנטריפוגה טור.
- עבור מדידות המסה, לקחת 1/3 של הפתרון (~ 66 μL) ולפצל לתוך שלושה מבחנות זכוכית. יבש בתנור ואקום לילה בשעה 40 מעלות צלזיוס תחת ואקום של ~ 27 Mhg.
- מפזר את 2/3 האחרים של הפתרון המרוכז לתוך 250 μL של PBS ולאחסן ב 4 ° צ' עד שימוש נוסף.
- לפני ניצול הפא-קוס, sonicate אותם 30 דקות באמבטיה sonicator בסביבה גבוהה.
2. אפיון NP
- לבצע פיזור אור דינמי (DLS) להוסיף 10 μL של מרוכז פא-קוס NPS בתמיסה PBS משלב 1.1.14 עד 2 מ ל של מים DI. לפני אפיון על ידי DLS, sonicate את החלקיקים עבור 30 דקות באמבטיה sonicator על הגדרה גבוהה ולסנן דרך מסנן 0.2 יקרומטר סטרילי להסיר אבק שיורית.
- ביצוע שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM): להוסיף 10 μL של מרוכז פא-קוס NPS בפתרון PBS לפיסת נייר שעווה. היפוך רשת הנחושת מצופה formvar בחלק העליון של ה-droplet ולתת לשבת 2 דקות. גע בקצה של רשת מצופה formvar כדי פיסת נייר סינון כדי להסיר את עודפי הנוזלים. . תן לאוויר להתייבש תמונה של רשת הנחושת ניצול מיקרוסקופ אלקטרונים במתח מואץ של 80 kV.
הערה: תוצאות טיפוסיות מאפיון הפא-קוס מוצגות באיור 1.
3. תרבית תאים
- פרוטוקול זה מנצל את התאים סקוב-3. אלא אם צוין אחרת, התרבות סקוב-3 תאים במדיום 5A של מקוי בתוספת עם 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, ו 100 μg/mL סטרפטומיצין, ולתחזק ב 37 ° c בתוך מחולל לחות 5% CO2 חממה.
4. תיוג פלורסנט של פא-קוס NPS למיקרוסקופיה
- הוסף טקסס-אדום-X סוכות, אסתר (0.2 mg מומס ב DMSO בריכוז של 10 מ"ג/mL) לפתרון המכיל 2 מ"ג של פא-CuS בתוך 1 מ ל של 0.1 M נחקו3 (pH ~ 9) מאגר.
- מערבבים את תערובת התגובה באמצעות פס מגנטי במשך 1 h, הרחק מן האור בטמפרטורת החדר.
- לרכז את תערובת התגובה בעמודה 4 mL 30 kDa MWCO צנטריפוגה על ידי ספינינג ב 4,000 x g עבור 10 דקות.
- לשטוף את הפתרון מרוכז 3x עם 4 מ ל של 0.1 M נחקו3 מאגר (pH ~ 9) בעמודה צנטריפוגה. לאחר מכן, לשטוף את הפתרון מרוכז עם 4 מ ל של מים DI 3x או עד רק כמות מעקב של זריחה נשאר גלוי הפרח דרך על ידי UV-VIS.
5. פא-CuS לספיגת השחלות על ידי סרטן שחלות תאים
- לפני הדגירה עם פא-קוס NPs, דגירה סקוב-3 תאים בבקבוקון T75 עם 8-15 מ ל של מדיה פולית-חומצה-1640 חינם RPMI עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין עבור לפחות 24 h.
- תאי הזרע ב 0.5 מ ל של חומצה פולית חינם RPMI-1640 מדיה צמיחה מלאה בצפיפות של 0.1 x 106 תאים/mL לתוך הצלחת 24 הבאר.
- ביום שלמחרת, התאים מודניים עם 400 μg/mL פא-CuS ב-0.5 mL של חומצה פולית-RPMI חינם-1640 להשלים את מדיית הצמיחה עבור 2 h.
- בעקבות דגירה זו, טריזיסיזציה של התאים עם 0.5 mL של 0.25% טריפסין עם EDTA. הוסף לפחות 1 מ ל של RPMI-חומצה פולית-1640 להשלים מדיית הצמיחה כדי לנטרל את טריפסין, ו צנטריפוגה את התאים ב 123 x g עבור 6 דקות.
- הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש את התאים ב-2 מ ל של PBS, וצנטריפוגה ב 123 x g עבור 6 דקות. בצע שטיפת זה שלב 2x כדי להסיר את כל NPs לא מאוגד.
- השהה את התאים ב-1-2 מ ל של PBS עם 2% רצף הפתרון.
- לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר וטריקון כחול. עוד לדלל תאים אם ספירת תאים גבוהים מדי. לדלל תאים ב-PBS עם 2% רצף הריכוז הנבחר לאיתור.
- התאים עכשיו מוכנים להיות מנותח על ידי מערכת ה-פכ.
6. מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של ספיגת פא-קוס של NPS
- חזור על הצעדים המפורטים בשלב 5.1 והמשך בפרוטוקול שלהלן לצורך מיקרוסקופ.
- תאי הזרע בצפיפות של 0.1 x 106 תאים/ml ב 0.5 mL של פולית-חומצה חינם RPMI-1640 להשלים את מדיית הצמיחה על שמיכות זכוכית בצלחת 24 הבאר.
- ביום למחרת, מודתיאת התאים עם פלואור מתויג פא-CuS NPs בטרילקאט, בריכוזים של 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, ו400 μg/mL בשנת 0.5 mL של חומצה פולית ללא RPMI-1640 להשלים מדיה צמיחה.
- מודב את התאים עם NPs עבור 2 h בחממה 37 ° c
- בעקבות תקופת הדגירה הזו, לשטוף את התאים 3x עם PBS.
הערה: עבור כל שלבי הכביסה, הוסף בזהירות את הפתרון בצד צלחת הבאר כדי לא להפריע לתאים. לאחר בנוסף, להטות בזהירות את הצלחת ולסגת את הפתרון מהצד של הבאר. - דגירה את התאים עם 0.5 mL של 3.7% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS עבור 15 דקות ולהעביר את שמיכות זכוכית לצלחת חדשה 24 היטב.
התראה: המטה הוא מסרטן ידוע. עשו כל קיבעון בתוך מכסה כימי מאוורר וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. - מודטה את התאים בתמיסה של 3.7% בתחתית עם 0.1% טריטון-X ב PBS עבור 5 דקות.
- לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד ולהעביר את שמיכות לצלחת חדשה.
- דגירה את התאים עם 0.5 mL של פתרון PBS המכיל DAPI (20 μL/mL של 0.5 mg/mL מלאי פתרון משמש עבור כתמים) עבור 5 דקות, הרחק מן האור.
- לשטוף את התאים עם PBS 3x.
- בעקבות השטיפה הסופית של ה-PBS, יש לטעון את הכיסויים בשקופיות עם הרכבה בינונית.
- התאים מוכנים כעת להיות. בתמונה על-ידי מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית איור 2 מציג דוגמה לאפיון תאים טיפוסי של מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
7. ארכיטקטורת מערכת זרימה
- בניית תאי זרימה
הערה: קובץ SolidWorks של מיכל זרימה תלת-ממדי מודפס ניתן למצוא בחומרים המשלימים.- באמצעות הקובץ המסופק SolidWorks, 3D להדפיס את המיכל הזרימה באמצעות שימוש בחומרים תרמופלסטיים או בפלסטיק PLA. ממדים מסופקים להלן אם SolidWorks אינה זמינה. איור 3מראה ייצוג של מודל זה. הגוף של טנק הזרימה הוא 2.5 ס"מ x 1.5 ס"מ x 7.5 ס"מ. הקצוות הרחוקים של מיכל הזרימה כוללים חורים כ 5 מ"מ קוטר כדי לאפשר כניסת אבובים המכיל את צינור נימי.
הערה: למיכל הזרימה יש חור בגודל 1 ס מ, בניצב לכיוון צינור הקפילר, למיקום מתמר האולטרסאונד. שחול גלילי עם אותו קוטר פנימי כמו החור מרחיב 6 מ"מ לתוך המיכל. עבור הדמיה בזמן אמת, מיכל הזרימה יש חריץ 1 מ"מ x 3 מ"מ ישירות מתחת לצינור נימי. - לאחר הדפסת מיכל זרימה תלת-ממדי, נקו והרכיבו את המערכת לשימוש.
- המקום שמיכות זכוכית על החריץ 1 מ"מ x 3 מ"מ ואת החור 1 ס"מ במערכת הזרימה.
- חותם בזהירות עם סיליקון כדי למנוע דליפה.
- להתאים את צינור נימי לתוך הסיליקון לרפא צינורות. הכנס את הצינורות לתוך תא הזרימה למרות הצד של מיכל הזרימה כגון צינור נימי זכוכית הוא ישירות מעל ולפני החריץ 3 מ"מ והחור 1 ס מ.
- חותם את אבובים באמצעות סיליקון כדי למנוע דליפה.
- באמצעות הקובץ המסופק SolidWorks, 3D להדפיס את המיכל הזרימה באמצעות שימוש בחומרים תרמופלסטיים או בפלסטיק PLA. ממדים מסופקים להלן אם SolidWorks אינה זמינה. איור 3מראה ייצוג של מודל זה. הגוף של טנק הזרימה הוא 2.5 ס"מ x 1.5 ס"מ x 7.5 ס"מ. הקצוות הרחוקים של מיכל הזרימה כוללים חורים כ 5 מ"מ קוטר כדי לאפשר כניסת אבובים המכיל את צינור נימי.
- התקנת מערכת זרימה אקוסטית
הערה: איור 3B ואיור 3ג הצג דוגמה לארכיטקטורת מערכת הזרימה.- חבר את ההמתמר לאולטרסאונד/מקלט. הגבר את האות עם רווח 59 dB.
- חבר את הפלט של המסנן לטווח הרחב הניתן להגדרה מחדש המצויד במערך שער מובנה לתיכנות בשדה.
- חברו את אחד הצינורות המגיעים מחדר הזרימה לצומת T, המחובר לשני משאבות מזרק בכל ענף.
- למלא את אחד משאבות מזרק באוויר ואת המשאבה השנייה עם המדגם להיות מנותח. הגדר את המשאבה המכילה אוויר לקצב הזרימה של 40 μL/min והמשאבה המכילה את המדגם לקצב זרימה של 20 μL/min. זרימת שני השלבים וכתוצאה מכך יפיק כרכים לדוגמה של 1 μL. בקצב זרימה זה, המערכת תבחן כ-6.4 דגימות לדקה.
הערה: כדי לשמור על התפלגות עקבית של תאים, מערבולת קלות כל דגימה מיד לפני שנבדק. בנוסף, לסובב את המזרק כל כמה דקות כדי למנוע את התאים להתיישב בפתרון. - חבר את הצינורית הנותרת ליציאה ממערכת הזרימה למכל עם 10% אקונומיקה, כדי להיפטר מתאים לאחר יציאה ממערכת הזרימה.
הערה: לפני ניצול מערכת הזרימה, בדוק אם יש דליפות, כפי שאלה יכולים להשפיע על הזרימה. תאים חייבים להיות כלולים במערכת סגורה כדי לשמור על בטיחות ביולוגית במהלך ההליך. - העיצוב של המיכל המודפס תלת-ממד מאפשר יישור עקבי לשחזור בין אור מתמר לייזר עם כיול מינימלי. כאשר ממוקם נכון בתוך המיכל מותאם אישית, צינור נימי הקוורץ מבטיח כי מתמר ולייזר מיושרים ישירות.
- מניחים את הקטע של צינור נימי הקוורץ ביישור ישיר עם התמר, בתחום התצוגה של המיקרוסקופ, ומאפשר מיקום קפדני של הסיבים האופטיים מעל המדגם, כך שהוא מאיר את כל רוחב הצינור.
- הצגת המדגם באמצעות סיבים אופטיים תקשור מוצק דיודה שאוב לייזר המצב הפעלה באורך גל של 1,053 ננומטר. האירוע אור לייזר על המדגם ואת מתמר השתמשו כדי למדוד את האפקט פוטואקוסטי הם לא ממוקדים.
- האנרגיה של האירוע לייזר על המדגם הוא כ 8 mJ ו 10 הרץ שיעור לייזר מספיק כדי להאיר כל מדגם פעמים מרובות כפי שהוא עובר דרך המערכת.
- מניחים את מערכת הזרימה על גבי מיקרוסקופ הפוך ולהבטיח הן את הדופק לייזר ואת הנתיב של המדגם גלויים כמו המדגם עובר למרות מערכת הזרימה. זרימת שיא באמצעות מצלמה רכוב מיקרוסקופ.
- הקלט את רכישות האולטרסאונד באמצעות תוכנת רכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). ההדק אולטרסאונד ולייזר פעמו באמצעות FPGA. לנצל את ה-PBS עם 2% רצף, ואת פא-CuS NPs בריכוז של 100 μg/mL ב-PBS 2% יצירת רצף, כפקדים שליליים חיוביים, בהתאמה.
- ניצול המצלמה רכוב מיקרוסקופ, להקליט הן את הירי של הלייזר ואת המעבר של דגימות למרות מערכת הזרימה. הקלטות אלה יהיה מנוצל כדי לתאם את האות האקוסטי שהוקלט על ידי מתמר עם ירי של הלייזר. כמו הדגימות לעבור מול הירי של הלייזר, האות יכול להיות מתואם את האות פוטואקוסטי המתקבל לניתוח. בקצב דגימה של 10 הרץ, הלייזר יאיר את כל התקע מספר פעמים.
8. לאחר העיבוד
- עבור כל רכישת אותות, s (t), חשב את ההמרה של הילברט, H [s (t)], כדי ליצור אות אנליטי.
- צור מעטפה מורכבת, se(t), על-ידי חישוב סדר הגודל של האות
האנליטי, כגון זה ושילוב המעטפה כדי למדוד את האות הכולל הנובע מכל רכישה. השווה את האותות מכל קבוצת בדיקה (כלומר, PBS, תאים מתויגים, פא-קוס NPs, תאים בלבד) ניצול מבחן t ב-R בתוכנה סטטיסטית. אותות פוטואקוסטיים גולמיים ושינויי הילברט שלהם מוצגים באיור 4. - לשחזור תמונה, לנרמל את המעטפה המורכבת בהתבסס על השיא המקסימלי לאורך כל ההפעלה. אם השוואת סידרת רצפים, נרמל את המעטפה המורכבת באמצעות השיא המקסימלי לאורך כל הסידרה. לאחר הנורמליזציה, המירו כל אחת מהרכישות לסדרה של ערכי פיקסלים. מייצגים כל סדרה של ערכי פיקסלים כעמודה בשחזור התמונה. השחזורים הנציגים של ה-PBS והאותות של הפא-קוס מוצגים באיור 5, כאשר שתי התמונות היו מנורמלות באמצעות השיא המקסימלי לאורך שני הריצות.
האנליטי, כגון זה ושילוב המעטפה כדי למדוד את האות הכולל הנובע מכל רכישה. השווה את האותות מכל קבוצת בדיקה (כלומר, PBS, תאים מתויגים, פא-קוס NPs, תאים בלבד) ניצול מבחן t ב-R בתוכנה סטטיסטית. אותות פוטואקוסטיים גולמיים ושינויי הילברט שלהם מוצגים באיור 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A מראה תמונה אופיינית של חלקיקים מסונתז. הגודל הממוצע של ננו-חלקיק אופייני הוא כ 8.6 ננומטר ± 2.5 nm. מדידת ננו-חלקיק בוצעה ב-ImageJ. הפונקציות של הסף ופרשת השדה הוחלו כדי להפריד בין החלקיקים למדידה. הקטרים האופקיים והאנכיים של כל חלקיק נמדדו בניצב אחד לשני וממוצעים עוד יותר. עבור DLS, מדידה ייצוגית מוצגת באיור 1ב. קוטר ההידרודינמי הממוצע לחלקיקים אלה הוא 73.6 ננומטר. חלקיקי נחושת גופרתי יש עקומת ספיגה אופיינית המשתרעת לתוך הניר, כפי שמוצג באיור 1ג. יש חפץ קל סביב 850 ננומטר שנגרמה על ידי מיתוג של לייזרים על ידי ספקטרוסקופיה.
תמונות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית של תאים מודבטים עם מתויג fluorescently חלקיקים ניתן לראות באיור 2. ספיגה ננו-חלקיק יכול להיות מדמיין על ידי נוכחות של זריחה על פני התא. תאים לא מודתים עם חלקיקים להראות לא אות פלואורסצנטי. הנוכחות של האות הזה זריחה מציין את ספיגת מוצלחת של החלקיקים ואת יכולתם להתגלות במערכת הזרימה.
איור 3 מציג את הכיוונון הכללי של מערכת הזרימה פוטואקוסטית. איור 3מראה דגם מפורט של תא הזרימה התלת-ממדית. ניתן להדפיס את החדר הזה באמצעות קובץ. stl המצורף לפרוטוקול זה. איור 3ב מציג מבט כולל על מלכודת מיכל הזרימה. איור 3ג מראה כיוונון כללי של מיכל הזרימה ומערכת רכישת נתונים.
אותות רכישת נתונים טיפוסיים מוצגים באיור 4. הנתונים הגולמיים מציינים את ההבדלים באות בין התאים המתויגים הננו-חלקיק, PBS ו-FA-CuS. רכישה היא האות פוטואקוסטי שנוצר מפעימת לייזר אחת. בשל קצב הירי המהיר של הלייזר, כל מדגם שנותח יוצר מספר רב של רכישות. מעטפה עבור כל רכישה בודדת נוצרה באמצעות המרה של הילברט. מעטפה זו שולבו כדי למדוד את הכמות הכוללת של האות שנוצר מפעימת הלייזר. במחקר קודם, נתונים אלה נותחו באמצעות התוכנה הסטטיסטית R, שבו מספר הרכישות שנותחו עבור t-test היו 203, 150, 160, ו 131, עבור תאים עם NPs, תאים לבד, PBS, ו-NPs לבד, בהתאמה22. הנתונים הונורממו על ידי המרת יומן והשוו במבחן t של וולש ב R. האותות הנובעים פא-CuS הNPs לבד בריכוז של 100 μg/mL הראו אות גבוה הרבה יותר מאשר השליטה השלילית. ההבדל בין האותות בין השליטה השלילית המתויג CTCs השחלות היו עדינים יותר מאשר פקד חיובי אבל יכול להתגלות באמצעות ניתוח של האמצעים שלהם על-ידי מבחן t22.
ניצול מותאם אישית LabView ו-MATLAB, שחזורים תמונה נעשו של שליטה חיובית ושלילית בזמן אמת ולאחר הרכישה, בהתאמה. כדי ליצור שחזורים פוטואקוסטיים, מעטפה של כל רכישה חושבה באמצעות המרה של הילברט. מעטפות בודדות הומרו לערכי פיקסלים והוצגו כעמודות עצמאיות. הבדלים ברורים באות פוטואקוסטיים מתרחשים בין הפא-קוס NPs בריכוז של 100 μg/mL ודגימת ה-PBS (איור 5). בקרות עבור המערכת חשוב להפעיל כדי להבטיח כי המערכת מספקת האות photoacoustic שניתן לזהות על ידי מתמר.
איור 1: אפיון הנציג של NP. (א) TEM תמונה של מסונתז פא-קוס NPs. סרגל קנה מידה = 50 ננומטר. (ב) התפלגות DLS אינטנסיביות של מסונתז פא-קוס nps (ג) נציג פא-קוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מיקרוסקופיה של הנציגה הפלואורסצנטית של התאים סקוב -3. התאים היו מודבטים עם ובלי מבלי 400 μg/mL-מתויג ב-NPs. סרגל סרגל = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות של הזרימה הפוטואקוסטית של המערכת cy, לשכת הזרימה. (א) תצוגה מפורטת של תא הזרימה המודפס התלת-ממדי. (ב) תרשים של מערכת פמג. (ג) מערכת זרימה בארכיטקטורת: SP = משאבת מזרק; DAQ/FPGA = מערך שער הניתן לתיכנות של נתוני רכישה/שדה; Ob = העדשה האובייקטיבית; של = סיבים אופטיים; FC = מצמד סיבים; UT = אולטראסאונד מתמר; FT = מיכל זרימה. הדמות מותאמת לוסטיק ואח '22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אות הנתונים הגולמיים של הנציג, הערכת הדוגמיות הנבדקת במערכת הזרימה. (א) נציג הנתונים הגולמיים של ה-PBS והתאים המכילים את הנתונים של NPs ושינוי הצורה (D) של הילברט. (ב) נציג הנתונים הגולמיים של התאים בלבד והתאים שעברו מודתים עם הפא-קוס NPs ו-(E) את שינוי הצורה של הילברט של הנתונים. (ג) נציג נתונים גולמיים מערוץ PBS ו-100 μg/mL פא-קוס ו-(ו) את שינוי הצורה של הילברט של הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שחזורים של תמונה מייצגת של תמונות פוטואקוסטיות של נתוני הפוטואקוסטיים. (A) שחזור תמונה של 100 μg/mL פא-קוס (ב) הערוץ הזורם בתוך מערכת הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: תא זרם STL. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוא שיטה ישירה לזיהוי של CTCs השחלות ניצול פג ו סוכן ניגודיות ממוקד של CuS. שיטות רבות נחקרו לאיתור ctcs השחלות, כולל התקנים microflu, RT-PCR, ו זרם הזריחהcy, 22,24,25. טווח זה במורכבות, עלות ודיוק, הגבלת האפקטיביות שלהם בהגדרות הקליניות. פגלה מציג מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות אלה לאיתור CTCs, כולל היכולת לזהות CTCs בתוך דגימות החולה, ואת קלות התרגום שלה ביישומים vivo. פלק הוכח לזהות במדויק את ctcs ב מבחנה ובvivo בשילוב עם סוכני ניגודיות ממוקדים26,27.
בעבודה זו, סוכני ניגודיות של פא-CuS NP הוערכו על יכולתם לשפר את הדיוק של זיהוי CTC בריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. מחקרים בוצעו באמצעות מבודד סקוב 3 תאים מושעה מחדש ב-PBS. אנליזה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הצביע על ספיגה מוצלחת של חלקיקים אלה. התוצאות זוהו בסקוב-3 תאים עד לריכוז של תא 1/μL22. צעדים מכריעים בפרוטוקול זה כרוכים בסינתזה הננו-חלקיק וביישור של התקנת הזרימה האקוסטית. במהלך סינתזה ננו-חלקיק, חשוב לוודא כי הפתרון הפך צבע ירוק כהה לפני הסרת התערובת ממרחץ השמן. עבור מערכת הזרימה, הפעלת פקד שלילי וחיובי למרות המערכת לפני בדיקות לדוגמה היא הכרחית כדי להבטיח כי המערכת מייצרת אות פוטואקוסטית נאותה לאיתור בעקבות התאים המסומנים בתווית. בזמן הפעלת מערכת הזרימה, חשוב להבטיח כי אור התקרית מסיבים אופטיים הוא מאיר לחלוטין את צינור נימי, וכי מתמר הוא הצמוד לצד תא הזרימה. לבסוף, בדיקות קפדניות של המערכת עבור דליפות יש צורך להבטיח את הבטיחות הביולוגית של המערכת ועל זרימה עקבית דרך החדר.
עבור מערכת ה-פג הנוכחית, מחקרים ראשוניים אישרו זיהוי פוטואקוסטי באמצעות מערכת מתמר והגברה. רוב האותות הללו היו מורכבים מאותות תדר נמוך יותר (< 20 מגה-הרץ). מחקרים נוספים נחוצים כדי לאשר אם זה נובע מתדירות בפועל של אותות פוטואקוסטיים שנוצרו או רוחב פס 35 MHz של המגבר. מחקרים עתידיים יבדקו את מרכיבי התדר של האותות המזוהים כדי למטב את התדר המרכזי של מתמר, כמו גם את רוחב הפס של מערכת הגברה. המערכת הנוכחית מתאימה במיוחד לזיהוי vivo ex של CTCs. עם זאת, שיטה זו מזהה את הפוטנציאל ליישום עתידי של הפא-קוס NPs בvivo.
מחקרים עתידיים מטרתו לזהות תאים סרטניים בשחלות בתוך תרבויות מעורבות, דגימות קליניות אנושיות, ובvivo מודלים28,29,30. יתר על כן, מחקרים עתידיים יבדקו את הספציפיות של חלקיקים אלה לעומת פקדים לא ממוקדות. האימות העתידי של שיטה זו יכלול בדיקת כלי זה עם דגימות קליניות אנושיות, יישום של בדיקות תפוקה גבוהה וניתוח ותרגום לתוך הגדרות קליניות. טכניקה זו פוטואקוסטית מראה פוטנציאל לתרגום עתידי למגוון רחב של יישומים קליניים ומחלות על פני מגוון של סוכני ניגודיות, אנליטים. זיהוי פוטואקוסטי של אנליטים ניצול פלק יש את הפוטנציאל לעשות את נקודת הטיפול של CTCs ופתוגנים אחרים מהירה יותר זולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את מדלן האוול על עזרתה עם סינתזה, מתיו החזה על עזרתו עיצוב מערכת הזרימה, ואיתן מרשהכל לקבלת סיוע עם SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
