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Bioengineering

फोटोध्वनिक फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ओवेरियन कैंसर डिटेक्शन

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60279
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

Summary

एक प्रोटोकॉल एक कस्टम निर्मित फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली और लक्षित फोलिक एसिड छाया हुआ तांबा सल्फाइड नैनोकणों का उपयोग परिसंचारी अंडाशय ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रस्तुत किया है ।

Abstract

कई अध्ययनों से पता चलता है कि परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) की गणना अंडाशय के कैंसर के लिए एक शकुन उपकरण के रूप में वादा दिखा सकते हैं । सीटीसी का पता लगाने के लिए वर्तमान रणनीतियों में फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस, और रियल-टाइम पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) शामिल हैं। हाल की प्रगति के बावजूद, प्रारंभिक अंडाशय के कैंसर मेटास्टैसिस का पता लगाने के तरीकों में अभी भी नैदानिक अनुवाद के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और विशिष्टता की कमी है। यहां, एक कस्टम चैंबर और सिरिंज पंप सहित एक कस्टम तीन आयामी (3 डी) मुद्रित प्रणाली का उपयोग करफोटोध्वनिक प्रवाह साइटोमेट्री (PAFC) द्वारा ओवेरियन परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत की जाती है। यह विधि पाएफसी द्वारा स्कोव-3 ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए फोलिक एसिड-कैप्ड कॉपर सल्फाइड नैनोकणों (एफए-CuS NPs) का उपयोग करती है। यह काम अंडाशय के कैंसर कोशिकाओं के लिए इन विपरीत एजेंटों की आत्मीयता को दर्शाता है। परिणाम ों में फ्लोयोरसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एनपी लक्षण वर्णन, PAFC डिटेक्शन और एनपी तेज दिखाया गया है, इस प्रकार शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर अंडाशय सीटीसी का पता लगाने के लिए इस उपन्यास प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन किया गया है।

Introduction

ओवेरियन कैंसर सबसे घातक स्त्री रोगों में से एक है और इसके परिणामस्वरूप 20181में दुनिया भर में अनुमानित 184,800 मौतें हुईं। कई अध्ययनों से ओवेरियन कैंसर प्रगति (यानी, मेटाटैसिस) और सीटीसी2,3,4की उपस्थिति के बीच संबंध दिखाया गया है। सीटीसी का पता लगाने और अलगाव के लिए सबसे आम तरीका सेलसर्च सिस्टम का उपयोग करता है, जो ईपीकैम रिसेप्टर5को लक्षित करता है। हालांकि, ईपीसीकैम अभिव्यक्ति को मेसेंचिमल संक्रमण के लिए एपिथेलियल में डाउनरेक्टोरल किया जाता है, जिसे कैंसर मेटास्तासिस6में फंसाया गया है। अग्रिमों के बावजूद, वर्तमान नैदानिक प्रौद्योगिकियां अभी भी कम सटीकता, उच्च लागत और जटिलता से पीड़ित हैं। इन कमियों के कारण, ओवेरियन सीटीसी की खोज और गणना के लिए नई प्रौद्योगिकियां अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गई हैं ।

हाल ही में, पीएएफसी कैंसर कोशिकाओं का गैर-आक्रामक पता लगाने, नैनोमैटेरियल्स के विश्लेषण और बैक्टीरिया7,8,9की पहचान के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में उभरा। पीएएफसी फोटोध्वनिक का उपयोग करके प्रवाह में एनालाइट्स का पता लगाकर पारंपरिक फ्लोरेसेंस प्रवाह साइटोमेट्री से अलग है। फोटोध्वनिक प्रभाव तब उत्पन्न होता है जब लेजर प्रकाश को एक ऐसी सामग्री द्वारा अवशोषित किया जाता है जो थर्मोलेस्टिक विस्तार का कारण बनता है, एक ध्वनिक तरंग का उत्पादन करता है जिसका पता अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर10,11द्वारा लगाया जा सकता है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री विधियों पर पीएएफसी के फायदे सादगी, नैदानिक सेटिंग्स में अनुवाद में आसानी, और रोगी नमूनों में अभूतपूर्व गहराई पर सीटीसी का पता लगाना शामिल है12,13। हाल के अध्ययनों में एंडोजेनस और एक्सोजेनस कंट्रास्ट14,15का उपयोग करकोशिकाओं का पता लगाने के लिए पीएएफसी प्रणालियों का उपयोग किया गया है । निकट अवरक्त (एनआईआर) प्रकाश को अवशोषित करने वाले विपरीत एजेंट जैसे इंडोसियाइन ग्रीन डाइ, और धातु एनपीएस (जैसे, सोना और सीयूएस) का उपयोग फोटोध्वनिक इमेजिंग16,17,18के संयोजन में कोशिकाओं और ऊतकों की चयनात्मक लेबलिंग के लिए किया गया है। जैविक ऊतकों के भीतर एनआईआर प्रकाश की बेहतर पैठ गहराई के कारण, अवशोषकों का फोटोध्वनिक पता लगाना नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अधिक गहराई पर किया जा सकता है। क्लिनिक में उपयोग की अपनी महान क्षमता के कारण, पीएएफसी के साथ लक्षित एनआईआर कंट्रास्ट एजेंटों के संयोजन ने सीटीसी का पता लगाने के लिए काफी रुचि उत्पन्न की है।

लक्षित विपरीत एजेंटों के संयोजन में पीएएफसी बढ़ी हुई सटीकता और सीटीसी का लक्षित पता लगाने के साथ रोगी नमूनों के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण प्रदान करता है। सीटीसी के लिए प्रमुख पता लगाने की रणनीतियों में से एक ब्याज की कोशिका पर मौजूद झिल्ली प्रोटीन का विशिष्ट लक्ष्यीकरण है। ओवेरियन सीटीसी की एक उल्लेखनीय विशेषता उनके बाहरी झिल्ली19पर स्थित फोलेट रिसेप्टर्स की अतिअभिव्यक्ति है । फोलेट रिसेप्टर लक्ष्यीकरण रक्त में अंडाशय सीटीसी की पहचान के लिए एक आदर्श रणनीति है क्योंकि एंडोजेनस कोशिकाएं, जिनमें फोलिक एसिड रिसेप्टर्स की उच्च अभिव्यक्ति होती है, आम तौर पर चमकदार होती हैं और रक्त प्रवाह20के लिए सीमित एक्सपोजर होती हैं। कॉपर सल्फाइड एनपीएस (CuS NPs) हाल ही में कैंसर कोशिकाओं21पर व्यक्त फोलेट रिसेप्टर्स को लक्षित करने की क्षमता के लिए पहचाना गया है । उनकी जैव अनुकूलता, संश्लेषण में आसानी, और एनआईआर में गहरी अवशोषण के साथ संयुक्त, ये एनपी कंट्रास्ट एजेंट एएफसी का उपयोग करने वाले अंडाशय सीटीसी का पता लगाने के लिए एक आदर्श लक्ष्यीकरण रणनीति बनाते हैं।

यह काम एफए-CuS NPs की तैयारी और एक फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली में अंडाशय कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उनके उपयोग का वर्णन करता है । CuS NPs को विशेष रूप से ओवेरियन सीटीसी को लक्षित करने के लिए फोलिक एसिड के साथ संशोधित किया जाता है और 1,053 एनएम लेजर के साथ उत्तेजित होने पर फोटोध्वनिक संकेत उत्सर्जित किया जाता है। परिणाम पीएएफसी प्रणाली के भीतर इन फोटोध्वनिक विपरीत एजेंटों के साथ इनक्यूबेटेड अंडाशय कैंसर कोशिकाओं का सफल पता लगाने का संकेत देते हैं । ये परिणाम ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए नीचे 1 सेल/μL की सांद्रता के लिए दिखाते हैं, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी SKOV-3 अंडाशय कैंसर कोशिकाओं द्वारा इन कणों के सफल तेज की पुष्टि22। यह काम एफए-CuS NPs संश्लेषण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए नमूनों की तैयारी, फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली के निर्माण, और अंडाशय के कैंसर कोशिकाओं का फोटोध्वनिक पता लगाने का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। प्रस्तुत विधि एफए-CuS NPs का उपयोग प्रवाह में अंडाशय सीटीसी की सफल पहचान से पता चलता है । भविष्य का काम अंडाशय के कैंसर मेटास्टैसिस का जल्दी पता लगाने की दिशा में इस तकनीक के नैदानिक अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित करेगा ।

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Protocol

1. नैनोपार्टिकल संश्लेषण और कार्यात्मकता

नोट: एफए-CuS NPs का संश्लेषण पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल21से अनुकूलित एक बर्तन संश्लेषण विधि का उपयोग करके हासिल किया जाता है।
सावधानी: सभी संश्लेषण एक हवादार रासायनिक धुएं हुड में होना चाहिए।

  1. संश्लेषण से पहले, लगभग 300 मीटर की डिओनाइज्ड (डीआई) पानी को फ़िल्टर करें, हालांकि 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर।
  2. डिटर्जेंट समाधान के साथ एक 250 मीटर ग्लास गोल बॉटम फ्लास्क साफ करें और डीआई पानी के साथ कुल्ला करें। 1 एमएम समाधान बनाने के लिए डीआई पानी के 100 मीटर में क्यूसीएल2 के 0.0134 ग्राम जोड़ें।
  3. क्यूसीएल2 समाधान में 0.015 ग्राम फोलिक एसिड (एफए) जोड़ें और चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके ~ 5 मिन के लिए हलचल करें।
  4. 200 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करने वाले प्रतिक्रिया मिश्रण में लगभग 10 एस पर एनए2एस9एच2ओ (100 माइक्रोन डीआई पानी में 0.024 ग्राम) जोड़ें।
    नोट: एनए2S·9H2O के अलावा, समाधान हल्के पीले रंग से गहरे भूरे रंग में रंग बदल जाएगा।
  5. प्रतिक्रिया और एक तेल स्नान में जगह टोपी, 90 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट, और एक चुंबकीय हलचल बार के साथ सरगर्मी जारी है। लगभग 15 वर्ष के बाद, या जब तेल स्नान 85−90 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है, तो प्रतिक्रिया को अतिरिक्त घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें। आपका मिश्रण धीरे-धीरे गहरे हरे रंग की ओर मुड़ना चाहिए।
    नोट: दबाव buildup से बचने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गर्म करते समय सिस्टम वेंट करना सुनिश्चित करें।
  6. तेल स्नान से प्रतिक्रिया पोत निकालें और एक बर्फ स्नान करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले लगभग 10 से 15 किमी के लिए कमरे के तापमान पर संक्षेप में शांत ।
  7. एक बार प्रतिक्रिया मिश्रण 20 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा हो जाने के बाद, शेष फोलिक एसिड को समाधान में भंग करने के लिए पीएच को 1M नाओएच का उपयोग करके 10 में समायोजित करें।
  8. 30 केडीए सेंट्रलिजन कॉलम का उपयोग करके एफए-सीयूएस प्रतिक्रिया मिश्रण को शुद्ध करें। कॉलम में 15 एमएल बैचों में समाधान जोड़ें और 15 मिन के लिए 3,082 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  9. एक बार प्रतिक्रिया मिश्रण के सभी केंद्रित किया गया है, केंद्रित अंशों को फिर से मिलाने और 30 केडीए केंद्रीकरण कॉलम में पीएच 10 NaOH के 15 मिलीग्राम के साथ 4x धोने ।
  10. बड़े पैमाने पर माप के लिए, समाधान के 1/3 (~ 66 μL) ले और तीन गिलास शीशियों में विभाजित। ~ 27 एमएमएचजी के वैक्यूम के तहत 40 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वैक्यूम ओवन में सूखजाएं।
  11. केंद्रित समाधान के अन्य 2/3 को पीबीएस के 250 माइक्रोन में भंग करें और आगे उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  12. एफए-CuS NPs का उपयोग करने से पहले, उन्हें एक उच्च सेटिंग पर स्नान सोनिकेटर में 30 min के लिए सोनीकेट करें।

2. एनपी लक्षण वर्णन

  1. डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस) डीआई पानी के चरण 1.1.14 से 2 मिलीएल तक पीबीएस समाधान में केंद्रित एफए-सीएएस एनपीएस के 10 माइक्रोन जोड़ें। डीएलएस द्वारा लक्षण वर्णन से पहले, अवशिष्ट धूल को हटाने के लिए 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर के माध्यम से एक उच्च सेटिंग पर स्नान सोनिकेटर में 30 मिन के लिए कणों को फ़िल्टर करें।
  2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) करें: वैक्स पेपर के एक टुकड़े में पीबीएस समाधान में केंद्रित एफए-सीएएस एनपीएस के 10 माइक्रोन जोड़ें। बूंद के शीर्ष पर एक फॉर्मवर लेपित कॉपर ग्रिड उलटा और 2 मिन के लिए बैठते हैं। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फॉर्मवर-लेपित ग्रिड के किनारे को फिल्टर पेपर के एक टुकड़े में स्पर्श करें। हवा को सूखने दें। छवि तांबे ग्रिड 80 केवी के एक त्वरित वोल्टेज पर एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग.
    नोट: एफए-CuS एनपीएस लक्षण वर्णन से विशिष्ट परिणाम चित्र ा 1में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

3. सेल संस्कृति

  1. यह प्रोटोकॉल स्कोव-3 कोशिकाओं का उपयोग करता है। जब तक अन्यथा उल्लेख नहीं किया जाता है, मैककॉय के 5ए माध्यम में संस्कृति SKOV-3 कोशिकाओं को 10% एफबीएस, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया गया है, और एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।

4. माइक्रोस्कोपी के लिए एफए-CuS एनपीएस की फ्लोरोसेंट टैगिंग

  1. टेक्सास-रेड-एक्स succinimidyl ester जोड़ें (0.2 मिलीग्राम 10 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता पर DMSO में भंग) एक समाधान के लिए एफए के 2 मिलीग्राम-CuS NPs 1 m HHCO3 (pH ~ 9) बफर के 1 mL में युक्त ।
  2. कमरे के तापमान पर प्रकाश से दूर, 1 घंटे के लिए एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ।
  3. प्रतिक्रिया मिश्रण को 10 मीटर के लिए 4,000 x ग्राम पर घूमते हुए 4 मिली30 केडीए एमडब्ल्यूसीओ सेंट्रलिफायरेशन कॉलम में केंद्रित करें।
  4. केंद्रित समाधान 3x को 0.1 एम नाहको3 बफर (पीएच ~ 9) के 4 मिलील के साथ एक केंद्रीकरण कॉलम में धोएं। बाद में, डीआई पानी 3x के 4 मिलील के साथ केंद्रित समाधान को धोएं या जब तक कि यूवी-विस द्वारा प्रवाह में केवल एक ट्रेस मात्रा में दिखाई नहीं देता है।

5. ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं द्वारा एफए-CuS एनपीएस तेज

  1. एफए-CuS NPs के साथ ऊष्मायन से पहले, एक T75 फ्लास्क में इनक्यूबेट स्कोव-3 कोशिकाओं को फोलिक-एसिड मुक्त आरपीएमआई-1640 मीडिया के 8−15 mL के साथ 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ कम से 24 घंटे के लिए ।
  2. फोलिक-एसिड मुक्त आरपीएमआई-1640 के 0.5 किलोमें बीज कोशिकाएं 0.1 x 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर 24 अच्छी प्लेट में पूर्ण विकास मीडिया।
  3. अगले दिन फोलिक-एसिड-फ्री आरपीएमआई-1640 पूर्ण विकास मीडिया के 05 मीटर में 400 μg/mL एफए-CuS एनपीएस के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए पूरा विकास मीडिया।
  4. इस ऊष्मायन के बाद, ईटीए के साथ 0.25% ट्रिप्सिन के 0.5 मिलील के साथ कोशिकाओं को ट्रिप्सिन करें। ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए फोलिक-एसिड-फ्री आरपीएमआई-1640 पूर्ण विकास मीडिया के कम से कम 1 एमएल जोड़ें, और 6 मिन के लिए 123 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित करें।
  5. अधिनेता को हटादें, पीबीएस के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और 6 मिन के लिए 123 x ग्राम पर अपकेंद्री करें। किसी भी अनबाउंड एनपी को हटाने के लिए इस वॉश स्टेप 2x को करें।
  6. 2% ट्वीन समाधान के साथ पीबीएस के 1−2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. हीमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। यदि कोशिका की गिनती बहुत अधिक है तो आगे कोशिकाओं को पतला करें। पता लगाने के लिए चुनी एकाग्रता के लिए 2% ट्वीन के साथ पीबीएस में कोशिकाओं को पतला करें।
  8. अब कोशिकाओं का विश्लेषण पीएएफसी सिस्टम से करने की तैयारी है।

6. एफए-CuS एनपीएस तेज की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

  1. चरण 5.1 में सूचीबद्ध चरणों को दोहराएं और माइक्रोस्कोपी के लिए नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
  2. 0.1 x 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर बीज कोशिकाओं फोलिक के 0.5 mL में-एसिड मुक्त RPMI-1640 एक 24 अच्छी तरह से थाली में कांच कवरस्लिप पर पूर्ण विकास मीडिया।
  3. अगले दिन, फ्लोरोसेंटी टैग एफए-CuS NPs के साथ कोशिकाओं को ट्रिपलकेट में, १०० μg/mL, २०० μg/mL, ३०० μg/mL, और ४०० μg/mL की सांद्रता पर फोलिक-एसिड मुक्त RPMI-१६४० पूर्ण विकास मीडिया के ०.५ mL में इनक्यूबेट ।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए एनपीएस के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें
  5. इस ऊष्मायन अवधि के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 3x धोएं।
    नोट: सभी धोने के चरणों के लिए, कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए अच्छी प्लेट के किनारे पर समाधान को ध्यान से जोड़ें। इसके बाद, ध्यान से थाली झुकाएं और कुएं के किनारे से समाधान निकाल ें।
  6. पीबीएस में 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 0.5 mL के साथ कोशिकाओं को 15 मीटर के लिए इनक्यूबेट करें और ग्लास कवरस्लिप को एक नई 24 अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
    सावधानी: पीएफए एक ज्ञात कैंसरकारक है। एक हवादार रासायनिक धूम हुड में सभी निर्धारण करते हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं।
  7. 5 मिन के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स के साथ 3.7% पीएफए के समाधान में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. प्रत्येक 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के 0.5 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं और कवरस्लिप को एक नई प्लेट में स्थानांतरित करें।
  9. प्रकाश से दूर 5 मिन के लिए डीएपीआई (0.5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान के 0.5 मिलीग्राम/एमएल का उपयोग धुंधला करने के लिए) युक्त पीबीएस समाधान के 0.5 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  10. कोशिकाओं को पीबीएस 3x से धोएं।
  11. अंतिम पीबीएस वॉश के बाद, बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड पर कवरस्लिप माउंट।
  12. कोशिकाओं को अब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज्ड करने के लिए तैयार हैं । चित्रा 2 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विशिष्ट सेल लक्षण वर्णन का एक उदाहरण दिखाता है।

7. फ्लो सिस्टम आर्किटेक्चर

  1. फ्लो चैंबर निर्माण
    नोट: पूरक सामग्रीमें 3 डी मुद्रित प्रवाह टैंक की एक सॉलिडवर्क्स फाइल पाई जा सकती है।
    1. प्रदान की गई सॉलिडवर्क्स फ़ाइल का उपयोग करके, एबीएस थर्मोप्लास्टिक या पीएलए प्लास्टिक का उपयोग करके प्रवाह टैंक को 3डी प्रिंट करें। यदि सॉलिडवर्क्स अनुपलब्ध है तो नीचे आयाम प्रदान किए जाते हैं। चित्रा 3ए इस मॉडल का प्रतिनिधित्व दिखाता है। प्रवाह टैंक का शरीर 2.5 सेमी x 1.5 सेमी x 7.5 सेमी है। प्रवाह टैंक के सुदूर सिरों में केशिका ट्यूब युक्त ट्यूबिंग के प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए व्यास में लगभग 5 मिमी छेद शामिल हैं।
      नोट: प्रवाह टैंक में अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के प्लेसमेंट के लिए 1 सेमी छेद, केशिका ट्यूब के अभिविन्यास के लिए लंबवत है। एक ही आंतरिक व्यास के साथ एक बेलनाकार बाहर निकालना के रूप में छेद टैंक में 6 मिमी फैली हुई है । रियल टाइम इमेजिंग के लिए फ्लो टैंक में सीधे केशिका ट्यूब के नीचे 1 एमएम x 3 एमएम स्लॉट दिया गया है।
    2. 3 डी फ्लो टैंक मुद्रण के बाद, उपयोग के लिए सिस्टम को साफ और इकट्ठा करें।
    3. 1 मिमी x 3 मिमी स्लॉट और प्रवाह प्रणाली में 1 सेमी छेद पर कांच कवरस्लिप रखें।
    4. रिसाव को रोकने के लिए सिलिकॉन के साथ सावधानी से सील करें।
    5. केशिका ट्यूब को सिलिकॉन ठीक ट्यूबों में फिट करें। ट्यूबों को प्रवाह कक्ष में डालें हालांकि प्रवाह टैंक के किनारे जैसे कि ग्लास केशिका ट्यूब सीधे ऊपर और 3 मिमी स्लॉट और 1 सेमी छेद के सामने है।
    6. रिसाव को रोकने के लिए सिलिकॉन का उपयोग कर टयूबिंग सील करें।
  2. फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली सेटअप
    नोट: चित्रा 3बी और चित्रा 3सी प्रवाह प्रणाली वास्तुकला का एक उदाहरण दिखाते हैं।
    1. ट्रांसड्यूसर को अल्ट्रासाउंड पल्सर/रिसीवर से कनेक्ट करें। 59 डीबी लाभ के साथ संकेत बढ़ाना।
    2. फ़िल्टर के आउटपुट को बिल्ट-इन फील्ड प्रोग्राम करने योग्य गेट सरणी से लैस एक बहुउद्देशीय पुनर्विन्यास ऑस्टिकस्कोप से कनेक्ट करें।
    3. प्रत्येक शाखा में दो सिरिंज पंपों से जुड़े, प्रवाह कक्ष से एक टी जंक्शन के लिए आने वाली ट्यूबों में से एक कनेक्ट करें ।
    4. सिरिंज पंपों में से एक को हवा से भरें और दूसरे पंप का सैंपल लेकर विश्लेषण किया जाए। 40 μL/मिन की प्रवाह दर के लिए हवा युक्त पंप सेट और 20 μL/मिन की प्रवाह दर के लिए नमूना युक्त पंप। परिणामस्वरूप दो चरण प्रवाह 1 μL के नमूना मात्रा का उत्पादन होगा । इस प्रवाह दर पर, प्रणाली प्रति मिनट लगभग 6.4 नमूनों का परीक्षण करेगी।
      नोट: कोशिकाओं के लगातार वितरण को बनाए रखने के लिए, परीक्षण किए जाने से तुरंत पहले प्रत्येक नमूने को हल्के से भंवर करें। इसके अलावा कोशिकाओं को समाधान में बसने से रोकने के लिए हर कुछ मिनट में सिरिंज घुमाएं।
    5. प्रवाह प्रणाली से बाहर निकलने वाली शेष ट्यूब को 10% ब्लीच के साथ एक कंटेनर से कनेक्ट करें, प्रवाह प्रणाली से बाहर निकलने के बाद कोशिकाओं को निपटाने के लिए।
      नोट: प्रवाह प्रणाली का उपयोग करने से पहले, लीक की जांच करें, क्योंकि ये प्रवाह को प्रभावित कर सकते हैं। प्रक्रिया के दौरान जैविक सुरक्षा बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को एक बंद प्रणाली के भीतर नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    6. 3 डी मुद्रित टैंक का डिजाइन न्यूनतम अंशांकन के साथ ट्रांसड्यूसर और लेजर लाइट के बीच लगातार और दोहराने योग्य संरेखण की अनुमति देता है। जब कस्टम टैंक के भीतर सही ढंग से रखा जाता है, तो क्वार्ट्ज केशिका ट्यूब यह सुनिश्चित करता है कि ट्रांसड्यूसर और लेजर सीधे गठबंधन कर रहे हैं।
    7. क्वार्ट्ज केशिका ट्यूब के खंड को ट्रांसड्यूसर के साथ सीधे संरेखण में रखें, माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में, नमूने के ऊपर ऑप्टिकल फाइबर के सावधानीपूर्वक प्लेसमेंट की अनुमति देता है ताकि यह ट्यूब की पूरी चौड़ाई को रोशन करता है।
    8. 1,053 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर एक डायोड पंप ठोस राज्य लेजर ऑपरेटिंग एक ऑप्टिकल फाइबर चैनलिंग का उपयोग कर नमूना किरणमय। नमूने पर लेजर लाइट घटना और फोटोध्वनिक प्रभाव को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रांसड्यूसर दोनों अनफोकस्ड हैं।
    9. नमूने पर लेजर घटना की ऊर्जा लगभग 8 एमजे है और 10 हर्ट्ज लेजर दर प्रत्येक नमूने को कई बार रोशन करने के लिए पर्याप्त है क्योंकि यह सिस्टम से गुजरता है।
    10. प्रवाह प्रणाली को एक उल्टे माइक्रोस्कोप के शीर्ष पर रखें और सुनिश्चित करें कि लेजर पल्स और नमूने का रास्ता दोनों दिखाई देते हैं क्योंकि नमूना प्रवाह प्रणाली के गुजरता है। माइक्रोस्कोप पर चढ़कर कैमरे का इस्तेमाल कररिकॉर्ड फ्लो।
    11. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करअल्ट्रासाउंड अधिग्रहण रिकॉर्ड करें (सामग्री की तालिकादेखें)। एफपीएए का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड और स्पंदित लेजर को ट्रिगर करना। पीबीएस 2% ट्वीन के साथ पीबीएस का उपयोग करें, और एफए-CuS NPs पीबीएस 2% ट्वीन में 100 μg/mL की एकाग्रता पर क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में।
    12. एक माइक्रोस्कोप घुड़सवार कैमरे का उपयोग, दोनों लेजर की गोलीबारी और नमूनों के पारित होने हालांकि प्रवाह प्रणाली रिकॉर्ड । इन रिकॉर्डिंग का उपयोग लेजर की गोलीबारी के साथ ट्रांसड्यूसर द्वारा दर्ज ध्वनिक संकेत को सहसंबंधित करने के लिए किया जाएगा। के रूप में नमूने लेजर की गोलीबारी के सामने से गुजारें, संकेत तो विश्लेषण के लिए जिसके परिणामस्वरूप फोटोध्वनिक संकेत से सहसंबद्ध किया जा सकता है । 10 हर्ट्ज की सैंपलिंग रेट पर लेजर हर प्लग को कई बार रोशन करेगा।

8. पोस्ट प्रोसेसिंग

  1. प्रत्येक संकेत अधिग्रहण के लिए, एस (टी), एक विश्लेषणात्मक संकेत बनाने के लिए हिलबर्ट ट्रांसफॉर्म, एच [एस (टी)] की गणना करें।
  2. विश्लेषणात्मक संकेत की भयावहता की गणना करके एक जटिल लिफाफा, एसई(टी) बनाएं, जैसे कि और प्रत्येक अधिग्रहण के परिणामस्वरूप कुल संकेत को मापने के लिए लिफाफे को एकीकृत करें। आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में टी-टेस्ट का उपयोग करते हुए प्रत्येक परीक्षण समूह (यानी, पीबीएस, टैग किए गए कोशिकाओं, एफए-सीएएस एनपीएस, अकेले कोशिकाओं) से संकेतों की तुलना करें। कच्चे फोटोध्वनिक संकेतों और उनके हिलबर्ट बदल चित्र 4में प्रस्तुत कर रहे हैं ।
  3. छवि पुनर्निर्माण के लिए, पूरे भाग में अधिकतम चोटी के आधार पर जटिल लिफाफे को सामान्य करें। यदि रन की एक श्रृंखला की तुलना, पूरी श्रृंखला में अधिकतम चोटी का उपयोग कर जटिल लिफाफा सामान्य । सामान्यीकरण के बाद, प्रत्येक अधिग्रहण को पिक्सेल मूल्यों की एक श्रृंखला में परिवर्तित करें। छवि पुनर्निर्माण में एक स्तंभ के रूप में पिक्सेल मूल्यों की प्रत्येक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करते हैं। पीबीएस के प्रतिनिधि पुनर्निर्माण और एफए-सीयूएस एनपीएस संकेतों को चित्रा 5में दिखाया गया है, जहां दोनों छवियों को दोनों रन में अधिकतम चोटी का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था।

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Representative Results

चित्रा 1ए संश्लेषित नैनोकणों की एक विशिष्ट TEM छवि दिखाता है। ठेठ नैनोपार्टिकल का औसत आकार लगभग 8.6 एनएम ± 2.5 एनएम है। इमेजजे में नैनोपार्टिकल मापने का प्रदर्शन किया गया था। माप के लिए कणों को अलग करने के लिए दहलीज और वाटरशेड कार्य लागू किए गए थे। प्रत्येक कण के क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर व्यास को एक दूसरे के लिए लंबवत मापा गया था और आगे औसत किया गया था। डीएलएस के लिए, एक प्रतिनिधि माप चित्रा 1बीमें दिखाया गया है । इन कणों के लिए औसत हाइड्रोडायनामिक व्यास 73.6 एनएम है। कॉपर सल्फाइड नैनोकणों में एक विशेषता अवशोषण वक्र होता है जो एनआईआर में फैली हुई है, जैसा कि चित्र 1सीमें दिखाया गया है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा लेजर के स्विचन के कारण 850 एनएम के आसपास एक मामूली विरूपण साक्ष्य है।

फ्लोरोसेंसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों को फ्लोरोसेंटी टैग किए गए नैनोकणों के साथ इनक्यूबेटकिया गया चित्र चित्र 2में देखा जा सकता है । नैनोपार्टिकल तेज कोशिका भर में फ्लोरेसेंस की उपस्थिति से कल्पना की जा सकती है। नैनोकणों के साथ इनक्यूबेटेड नहीं कोशिकाएं कोई फ्लोरेसेंस सिग्नल नहीं दिखाती हैं। इस फ्लोरेसेंस सिग्नल की उपस्थिति कणों के सफल तेज और प्रवाह प्रणाली में पता लगाने की उनकी क्षमता को इंगित करती है।

चित्रा 3 फोटोध्वनिक प्रवाह प्रणाली के सामान्य सेटअप को दिखाता है। चित्रा 3ए 3 डी फ्लो चैंबर का विस्तृत मॉडल दिखाता है। इस कक्ष को इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदान की गई .stl फ़ाइल का उपयोग करके मुद्रित किया जा सकता है। चित्रा 3बी फ्लो टैंक सेटअप का अवलोकन दिखाता है। चित्रा 3सी प्रवाह टैंक और डेटा अधिग्रहण प्रणाली का एक सामान्य सेटअप दिखाता है।

विशिष्ट डेटा अधिग्रहण संकेत चित्र4में दिखाए गए हैं। कच्चे डेटा नैनोपार्टिकल टैग कोशिकाओं, PBS, और एफए CuS NPs के बीच संकेत में अंतर इंगित करता है । एक अधिग्रहण एक लेजर पल्स से उत्पन्न परिणामी फोटोध्वनिक संकेत है। लेजर की तेजी से गोलीबारी दर के कारण, प्रत्येक नमूना विश्लेषण कई अधिग्रहण उत्पन्न करता है। हिलबर्ट ट्रांसफॉर्म का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्तिगत अधिग्रहण के लिए एक लिफाफा उत्पन्न किया गया था। यह लिफाफा लेजर पल्स से उत्पन्न संकेत की कुल मात्रा को मापने के लिए एकीकृत किया गया था। पिछले अध्ययन में, इन आंकड़ों का विश्लेषण आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था, जहां टी-टेस्ट के लिए विश्लेषण किए गए अधिग्रहणों की संख्या क्रमशः एनपीएस, अकेले कोशिकाओं, पीबीएस और अकेले एनपीएस के साथ कोशिकाओं के लिए २०३, १५०, १६० और १३१ थी। डेटा लॉग ट्रांसफॉर्मेशन द्वारा सामान्यीकृत किया गया था और आर में वेल्च के टी-टेस्ट का उपयोग करने की तुलना में। १०० μg/mL की एकाग्रता पर अकेले एफए-CuS NPs से जिसके परिणामस्वरूप संकेतों नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में एक बहुत अधिक संकेत दिखाया । नकारात्मक नियंत्रण और टैग किए गए अंडाशय सीटीसी के बीच संकेतों में अंतर सकारात्मक नियंत्रण से अधिक सूक्ष्म थे लेकिन टी-टेस्ट22द्वारा उनके साधनों के विश्लेषण के माध्यम से पता लगाया जा सकता है।

कस्टम लैबव्यू और मैटलैब सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, छवि पुनर्निर्माण क्रमशः वास्तविक समय और अधिग्रहण के बाद सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों से बने थे। फोटोध्वनिक पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए, हिलबर्ट ट्रांसफॉर्म का उपयोग करके प्रत्येक अधिग्रहण के एक लिफाफे की गणना की गई थी। व्यक्तिगत लिफाफे बाद में पिक्सेल मूल्यों में परिवर्तित और स्वतंत्र स्तंभों के रूप में प्रदर्शित किया गया । फोटोध्वनिक संकेत में स्पष्ट अंतर एफए-CuS NPs के बीच १०० μg/mL और PBS नमूना(चित्रा 5)की एकाग्रता पर होते हैं । सिस्टम के लिए नियंत्रण यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि सिस्टम पर्याप्त रूप से फोटोध्वनिक संकेत का उत्पादन कर रहा है जिसे ट्रांसड्यूसर द्वारा पाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि एनपी लक्षण वर्णन। (A)संश्लेषित एफए-CuS NPs. स्केल बार = 50 एनएम की TEM छवि। (ख)संश्लेषित एफए-CuS एनपीएस के प्रतिनिधि डीएलएस तीव्रता वितरण ।(सी)प्रतिनिधि एफए-CuS एनपीएस अवशोषण वक्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: SKOV-3 कोशिकाओं के प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां। कोशिकाओं के साथ और बिना ४०० μg/mL फ्लोरोसेंटली टैग NPs । स्केल बार = ५० μm के बिना इनक्यूबेटेड थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र3: फोटोध्वनिक प्रवाह साइटोमेट्री प्रणाली और प्रवाह कक्ष की प्रतिनिधि छवियां। (A)3डी मुद्रित प्रवाह कक्ष का विस्तृत दृश्य। (ख)पीएएफसी प्रणाली का आरेख । (ग)फ्लो सिस्टम आर्किटेक्चर: एसपी = सिरिंज पंप; DAQ/FPGA = डेटा अधिग्रहण/क्षेत्र प्रोग्राम गेट सरणी; ओबी = उद्देश्य लेंस; = ऑप्टिकल फाइबर; एफसी = फाइबर कपलर; यूटी = अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर; एफटी = फ्लो टैंक। यह आंकड़ा लुस्क एट अल22से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि कच्चे डेटा सिग्नल और हिलबर्ट प्रवाह प्रणाली में परीक्षण नमूनों के बदल जाते हैं । (ए)एनपीएस और(डी)हिलबर्ट डेटा के रूपांतरण के साथ इनक्यूबेटेड पीबीएस और कोशिकाओं से प्रतिनिधि कच्चे डेटा संकेत । (ख)प्रतिनिधि कच्चे डेटा अकेले कोशिकाओं से संकेत और एफए-CuS NPs और(ई)के साथ इनक्यूबेटेड कोशिकाओं डेटा के हिलबर्ट बदलना । (ग)पीबीएस से प्रतिनिधि रॉ डेटा सिग्नल और 100 μg/mL एफए-CuS NPs और(एफ)हिबर्ट डेटा का रूपांतरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: फोटोध्वनिक डेटा के प्रतिनिधि फोटोध्वनिक छवि पुनर्निर्माण। {100 μg/mL एफए-CuS NPs और(B)पीबीएस के छवि पुनर्निर्माण प्रवाह प्रणाली के भीतर परीक्षण किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1: फ्लो चैंबर एसटीएल। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल पीएएफसी और एक लक्षित CuS कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग करने वाले अंडाशय सीटीसी का पता लगाने के लिए एक सीधी विधि है। ओवेरियन सीटीसी का पता लगाने के लिए कई तरीकों का पता लगाया गया है, जिनमें माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस, आरटी-पीसीआर और फ्लोरेसेंस फ्लो साइटोमेट्री23,24,25शामिल हैं । ये जटिलता, लागत और सटीकता में हैं, नैदानिक सेटिंग्स में उनकी प्रभावशीलता को सीमित करते हैं। PAFC सीटीसी का पता लगाने के लिए इन पारंपरिक तरीकों पर कई लाभ ों का परिचय, रोगी के नमूनों के भीतर CTCs का पता लगाने की क्षमता सहित, और वीवो अनुप्रयोगों में अनुवाद की अपनी आसानी । पीएएफसी को भी लक्षित कंट्रा एजेंटों के साथ संयुक्त रूप से26,27में सीटीसी इन विट्रो और वीवो में सही ढंग से पता लगाने के लिए दिखाया गया है ।

इस काम में, एफए-CuS एनपी कंट्रास्ट एजेंटों को शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर सीटीसी पता लगाने की सटीकता में सुधार करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया था । पीबीएस में अलग-थलग पड़े स्कोव-3 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने का उपयोग करके अध्ययन किए गए । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण इन कणों के सफल तेज का संकेत दिया । परिणामों ने SKOV-3 कोशिकाओं को 1 कोशिका/μL22की एकाग्रता के नीचे पाया । इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमनैनोपार्टिक संश्लेषण और फोटोध्वनिक प्रवाह सेटअप के संरेखण शामिल हैं। नैनोपार्टिकल संश्लेषण के दौरान, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि तेल स्नान से मिश्रण को हटाने से पहले समाधान ने गहरे हरे रंग का रंग बदल दिया है। प्रवाह प्रणाली के लिए, एक नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण चल रहा है, हालांकि नमूना परीक्षण से पहले प्रणाली यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि प्रणाली लेबल कोशिकाओं के बाद का पता लगाने के लिए पर्याप्त फोटोध्वनिक संकेत का उत्पादन कर रहा है । प्रवाह प्रणाली को चलाते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि फाइबर ऑप्टिक से घटना प्रकाश पूरी तरह से केशिका ट्यूब को रोशन कर रहा है, और ट्रांसड्यूसर प्रवाह कक्ष के पक्ष के खिलाफ सुखद है। अंत में, लीक के लिए प्रणाली का कठोर परीक्षण प्रणाली की जैविक सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए और चैंबर के माध्यम से लगातार प्रवाह के लिए आवश्यक है ।

वर्तमान PAFC प्रणाली के लिए, प्रारंभिक अध्ययनों ट्रांसड्यूसर और प्रवर्धन प्रणाली का उपयोग कर फोटोध्वनिक पता लगाने की पुष्टि की । इनमें से अधिकांश संकेतों में कम आवृत्ति संकेत (<20 मेगाहर्ट्ज) शामिल थे। इस बात की पुष्टि करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है कि क्या यह उत्पन्न फोटोध्वनिक संकेतों की वास्तविक आवृत्ति या एम्पलीफायर के 35 मेगाहर्ट्ज बैंडविड्थ के कारण है। भविष्य के अध्ययन ट्रांसड्यूसर की केंद्रीय आवृत्ति के साथ-साथ प्रवर्धन प्रणाली की बैंडविड्थ को अनुकूलित करने के लिए पाए गए संकेतों के आवृत्ति घटकों की जांच करेंगे। वर्तमान प्रणाली सीटीसी के पूर्व वीवो डिटेक्शन के लिए विशेष रूप से अनुकूल है। हालांकि, यह विधि वीवो में एफए-CuS NPs के भविष्य के आवेदन के लिए क्षमता की पहचान करती है।

भविष्य के अध्ययनों का उद्देश्य मिश्रित संस्कृतियों, मानव नैदानिक नमूनों और वीवो मॉडल28,29,30के भीतर अंडाशय के कैंसर कोशिकाओं का पता लगाना है। इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन इन नैनोकणों बनाम गैर लक्षित नियंत्रण की विशिष्टता की जांच करेंगे । इस विधि के भविष्य के सत्यापन में मानव नैदानिक नमूनों के साथ इस उपकरण का परीक्षण, उच्च थ्रूपुट परीक्षण और विश्लेषण का कार्यान्वयन और नैदानिक सेटिंग्स में अनुवाद शामिल होगा। यह फोटोध्वनिक तकनीक विपरीत एजेंटों और एनालाइट्स की एक श्रृंखला में नैदानिक अनुप्रयोगों और बीमारियों की एक विस्तृत विविधता के लिए भविष्य के अनुवाद के लिए क्षमता दिखाती है। पीएएफसी का उपयोग करने वाले एनालाइट्स का फोटोध्वनिक पता लगाने में सीटीसी और अन्य रोगजनकों की देखभाल का बिंदु-देखभाल पता लगाने की क्षमता अधिक तेजी से और सस्ती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक संश्लेषण के साथ उसकी मदद के लिए Madeleine Howell स्वीकार करना चाहते हैं, उसकी मदद के लिए मैथ्यू छाती प्रवाह प्रणाली डिजाइन, और एसे Marschall SolidWorks के साथ सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.025% Trypsin With EDTA Corning 25-053-Cl
0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit VWR 10040-440 For filtering larger volumes of DI water.
0.2 µm sterile syringe filter VWR 28145-477
3D Printed Tank Custom-made
Acquisition Card National Instruments PXIe-5170R 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit
Alconox Sigma-Aldrich 242985-1.8KG Detergent used for cleaning glassware.
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Millipore UFC903024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters Millipore UFC803024
Bright-Line Hematocytometer Hausser Scientific 1492
Copper(II) Chloride ACROS ORGANICS 206532500
Coupling Objective Thorlabs LMH-10x-532 To couple pulsed light to optical fiber.
Coupling Stage Newport F-91-C1-T Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath Fisherbrand Model CPX3800
Data Acquisition software National Instruments NI LabVIEW 2017 (32-bit) LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition.
Data Processing Software Mathworks Matlab R2016a Reconstructions and graphs produced using Matlab software.
FBS Sigma-Aldrich F2442-500ML
Fiber Chuck Newport FPH-DJ Used to hold the bare fiber.
Fiber Coupler Newport FP-1A 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective.
Folic Acid Sigma-Aldrich F7876-10G
Formvar Coated TEM Grids Electron Microscopy Sciences FCF300-CU-SB
Masterflex Tubing Cole Parmer EW-96420-14
McCoy's 5A Medium ATCC 30-2007
Norm-Ject 10 mL Syringes HENKE SASS WOLF 4100-X00V0
Optical Fiber Thorlabs FG550LEC Used to expose sample to pulsed light.
PBS Alfa Aesar J62036
Penicillin Streptomycin GIBCO 15140-122
Pulsed Laser RPMC Lasers Inc Quantus-Q1D-1053 Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum.
Pulser/Receiver Olympus 5077PR Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain.
Quartz Capillary Tube Sutter Instrument QF150-75-10
RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free Gibco 27016-021
Silicone Momentive Performance Materials, Inc. GE284
SKOV-3 Cells ATCC HTB-77
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795-500G
Sodium Hydroxide Beads BDH BDH9292-500G
Sodium Sulfide Nonahydrate Sigma-Aldrich 431648-50G
Syringe Pumps New Era Pump Systems Inc DUAL-1000
Texas Red-X-Succinimydl ester Invitrogen 1949071
Transducer Olynmpus V214-BB-RM Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%.
Trypan Blue Solution 0.4% Amresco K940-100ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML
Ultrasound Gel Parker Laboratories Inc. Aquasonic 100 Ultrasound gel for transducer coupling

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References

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