Summary
Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.
Abstract
Molti studi suggeriscono che l'enumerazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) può mostrare promessa come strumento prognostico per il cancro ovarico. Le strategie attuali per il rilevamento dei CTC includono la citometria di flusso, i dispositivi microfluidici e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Nonostante i recenti progressi, i metodi per la rilevazione delle metastasi del cancro ovarico precoce mancano ancora della sensibilità e della specificità necessarie per la traduzione clinica. Qui, viene presentato un nuovo metodo per la rilevazione di cellule tumorali circolanti ovariche da citometria a flusso fotoacustica (PAFC) utilizzando un sistema stampato tridimensionale personalizzato (3D), tra cui una camera di flusso e una pompa di siringhe. Questo metodo utilizza nanoparticelle di solfuro di rame con controllo acido folico (FA-CuS NP) per indirizzare le cellule tumorali ovariche SKOV-3 da PAFC. Questo lavoro dimostra l'affinità di questi agenti di contrasto per le cellule tumorali ovariche. I risultati mostrano la caratterizzazione NP, il rilevamento PAFC e l'assorbimento di NP mediante microscopia a fluorescenza, dimostrando così il potenziale di questo nuovo sistema per rilevare i CTC ovarici a concentrazioni fisiologicamente rilevanti.
Introduction
Il cancro ovarico è una delle neoplasie ginecologiche più letali e ha provocato circa 184.800 decessi in tutto il mondo nel 20181. Studi multipli hanno dimostrato la correlazione tra la progressione del cancro ovarico (cioè la metastasi) e la presenza di CTC2,3,4. Il metodo più comune per il rilevamento e l'isolamento dei CTC utilizza il sistema Cellsearch, che si rivolge al recettore EpCam5. L'espressione EpCam, tuttavia, è downregolata nella transizione epiteliale a mesenchymic, che è stata implicata nella metastasi del cancro6. Nonostante i progressi compiuti, le attuali tecnologie cliniche soffrono ancora di bassa precisione, costi elevati e complessità. A causa di questi inconvenienti, le nuove tecnologie per la scoperta e l'enumerazione dei CTC ovarici sono diventate un'area importante per la ricerca.
Recentemente, il PAFC è emerso come un metodo efficace per la rilevazione non invasiva delle cellule tumorali, l'analisi dei nanomateriali e l'identificazione dei batteri7,8,9. IL PAFC differisce dalla tradizionale citometria del flusso di fluorescenza rilevando gli analiti nel flusso utilizzando la fotoacustica. L'effetto fotoacustico viene generato quando la luce laser viene assorbita da un materiale che causa l'espansione termoelastica, producendo un'onda acustica che può essere rilevata da un trasduttore ad ultrasuoni10,11. I vantaggi del PAFC rispetto ai metodi tradizionali di citometria di flusso includono semplicità, facilità di traduzione in ambienti clinici e il rilevamento di CTC a profondità senza precedenti nei campioni dei pazienti12,13. Recenti studi hanno utilizzato sistemi PAFC per il rilevamento delle cellule utilizzando contrasto endogeno ed esogeno14,15. Gli agenti di contrasto ad assorbimento della luce vicino all'infrarosso (NIR) come il colorante verde indocianina e gli NP metallici (ad esempio oro e CuS) sono stati utilizzati per l'etichettatura selettiva di cellule e tessuti in combinazione con l'imaging fotoacustico16,17,18. A causa della migliore profondità di penetrazione della luce NIR all'interno dei tessuti biologici, il rilevamento fotoacustico degli assorbitori può essere eseguito a maggiori profondità per le applicazioni cliniche. A causa del suo grande potenziale di utilizzo nella clinica, la combinazione di agenti di contrasto NIR mirati con PAFC ha generato un notevole interesse per il rilevamento dei CTC.
IL PAFC in combinazione con agenti a contrasto mirati fornisce un approccio migliorato per l'analisi ad alta velocità dei campioni dei pazienti con maggiore precisione e rilevamento mirato dei CTC. Una delle principali strategie di rilevamento per i CTC è il targeting specifico delle proteine della membrana presenti sulla cellula di interesse. Una caratteristica notevole dei CTC ovarici è la sovraespressione dei recettori del folato situati sulla loro membrana esterna19. Il targeting del recettore del folato è una strategia ideale per l'identificazione dei CTC ovarici nel sangue perché le cellule endogene, che hanno una maggiore espressione dei recettori degli acidi folichi, sono generalmente luminose e hanno un'esposizione limitata al flusso sanguigno20. Gli NP di solfuro di rame (CUS NP) sono stati recentemente riconosciuti per la loro capacità di indirizzare i recettori del folato espressi sulle cellule cancerose21. In combinazione con la loro biocompatibilità, facilità di sintesi e assorbimento in profondità nella NIR, questi agenti di contrasto NP fanno una strategia di targeting ideale per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano il PAFC.
Questo lavoro descrive la preparazione degli NP FA-CuS e il loro utilizzo per il rilevamento delle cellule tumorali ovariche in un sistema di flusso fotoacustico. Gli NP CuS sono modificati con acido folico per indirizzare specificamente CTC ovarici ed emettono un segnale fotoacustico quando stimolati con un laser da 1.053 nm. I risultati indicano il successo del rilevamento di cellule tumorali ovariche incubate con questi agenti di contrasto fotoacustico all'interno del sistema PAFC. Questi risultati mostrano il rilevamento delle cellule tumorali ovariche fino a concentrazioni di 1 cellula/L, e la microscopia a fluorescenza conferma l'assorbimento di successo di queste particelle da parte delle cellule tumorali ovariche SKOV-322. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della sintesi degli NP FA-CuS, la preparazione di campioni per la microscopia a fluorescenza, la costruzione del sistema a flusso fotoacustico e il rilevamento fotoacustico delle cellule tumorali ovariche. Il metodo presentato mostra una corretta identificazione dei CTC ovarici nel flusso che utilizzano gli NP FA-CuS. Il lavoro futuro si concentrerà sull'applicazione clinica di questa tecnologia verso la diagnosi precoce delle metastasi del cancro ovarico.
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Protocol
1. Sintesi e funzionalizzazione delle nanoparticelle
NOTA: la sintesi degli NP FA-CuS si ottiene utilizzando un metodo di sintesi a un piatto adattato da un protocollo pubblicato in precedenza21.
AVVISO: Tutta la sintesi dovrebbe avvenire in una cappa di fumi chimici ventilata.
- Prima della sintesi, filtrare circa 300 mL di acqua deionizzata (DI) attraverso un filtro sterile di 0,2 m.
- Pulire un pallone rotondo in vetro da 250 mL con una soluzione detergente e risciacquare con acqua DI. Aggiungere 0,0134 g di CuCl2 in 100 mL di acqua DI per creare una soluzione da 1 mM.
- Aggiungere 0,015 g di acido folico (FA) alla soluzione CuCl2 e mescolare per 5 min utilizzando una barra di stiring magnetico.
- Aggiungere Na2S-9H2O (0,024 g in 100 gradi l'acqua DI) su circa 10 s alla miscela di reazione utilizzando una pipetta da 200 ll.
NOTA: Dopo l'aggiunta del Na2S-9H2O, la soluzione cambierà colore da un giallo chiaro a un marrone scuro. - Anteporre la reazione e mettere in un bagno d'olio, impostare a 90 gradi centigradi, e continuare a mescolare con una barra di agitazione magnetica. Dopo circa 15 min, o quando il bagno d'olio ha raggiunto 85-90 gradi centigradi, permetterà alla reazione di procedere per un'ora supplementare. La miscela dovrebbe gradualmente trasformarsi in un colore verde scuro.
NOTA: Assicurarsi di sfiatare il sistema durante il riscaldamento della miscela di reazione per evitare l'accumulo di pressione. - Rimuovere il recipiente di reazione dal bagno d'olio e raffreddare brevemente a temperatura ambiente per circa 10-15 min prima di passare a un bagno di ghiaccio.
- Una volta che la miscela di reazione si è raffreddata al di sotto dei 20 gradi centigradi, regolare il pH a 10 utilizzando 1M NaOH per sciogliere l'acido folico rimanente in soluzione.
- Purificare la miscela di reazione FA-CuS utilizzando una colonna di centrifugazione 30 kDa. Aggiungere la soluzione in lotti da 15 mL alla colonna e centrifugare a 3.082 x g per 15 min.
- Una volta concentrata tutta la miscela di reazione, ricombinare le frazioni concentrate e lavare 4x con 15 mL di pH 10 NaOH nella colonna di centrifugazione 30 kDa.
- Per le misurazioni di massa, prendere 1/3 della soluzione (66 dollari l) e dividere in tre fiale di vetro. Asciugare in forno sottovuoto sotto vuoto di 27 mmHg.
- Sciogliere l'altro 2/3 della soluzione concentrata in 250 gradi di PBS e conservare a 4 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.
- Prima di utilizzare gli NP FA-CuS, sonoroarli per 30 minuti in un sonicatore da bagno su un ambiente elevato.
2. Caratterizzazione NP
- Eseguire la dispersione dinamica della luce (DLS) Aggiungere 10 -L di FA-CuS NPS concentrato in soluzione PBS dal punto 1.1.14 a 2 mL di acqua DI. Prima della caratterizzazione da parte delle DLS, sonicare le particelle per 30 minuti in un sonicatore da bagno su un'impostazione alta e filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m per rimuovere la polvere residua.
- Eseguire la microscopia elettronica di trasmissione (TEM): Aggiungere 10 -L di FA-CuS NPS concentrato in soluzione PBS a un pezzo di carta cerata. Invertire una griglia di rame rivestita formvar sulla parte superiore della goccia e lasciare spalare per 2 min. Toccare il bordo della griglia rivestita di formvar per un pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso. Lasciare asciugare l'aria. Immagine della griglia di rame che utilizza un microscopio elettronico ad una tensione accelerata di 80 kV.
NOTA: i risultati tipici della caratterizzazione dei criteri di rete FA-CuS sono presentati nella Figura 1.
3. Cultura cellulare
- Questo protocollo utilizza le cellule SKOV-3. Se non diversamente specificato, colture cellule SKOV-3 nel medio 5A di McCoy integrato con 10% FBS, 100 U/mL penicillina, e 100 streptomicino di g/mL, e mantenere a 37 gradi centigradi in un umidito 5% CO2 incubatore.
4. Tagging fluorescente di FA-CuS NPS per la microscopia
- Aggiungere Texas-Red-X succinimidyl ester (0,2 mg sciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL) a una soluzione contenente 2 mg di NP FA-CuS in 1 mL di 0,1 M NaHCO3 (pH 9) tampone.
- Mescolare la miscela di reazione utilizzando una barra di agitazione magnetica per 1 h, lontano dalla luce a temperatura ambiente.
- Concentrare la miscela di reazione in una colonna di centrifugazione MWCO da 4 mL da 30 kDa mWCO ruotando a 4.000 x g per 10 min.
- Lavare la soluzione concentrata 3x con 4 mL di buffer NaHCO3 da 0,1 M (pH 9) in una colonna di centrifugazione. Successivamente, lavare la soluzione concentrata con 4 mL di acqua DI 3x o fino a quando solo una traccia di fluorescenza rimane visibile nel flusso attraverso UV-VIS.
5. FA-CuS NPS Assorbimento da cellule tumorali ovariche
- Prima dell'incubazione con gli NP FA-CuS, incubare le cellule SKOV-3 in un flacone T75 con 8-15 mL di mpMI-1640 senza acido folico con 10% FBS e 1% penicillina /streptomicina per almeno 24 h.
- Le cellule di semi in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico completano il supporto di crescita ad una densità di 0,1 x 106 cellule / mL in una piastra di 24 pozzetti.
- Il giorno seguente, incubare le cellule con 400 g/mL FA-CuS NPS in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico per 2 h.
- A seguito di questa incubazione, provare le cellule con 0.5 mL di 0.25% trypsin con EDTA. Aggiungere almeno 1 mL di RPMI-1640 senza acido folico per neutralizzare la prova e centrifugare le cellule a 123 x g per 6 min.
- Rimuovere il supernatante, riutilizzare le cellule in 2 mL di PBS e centrifugare a 123 x g per 6 min. Eseguire questo passaggio di lavaggio 2x per rimuovere eventuali NP non associati.
- Risospendere le cellule in 1-2 mL di PBS con soluzione 2% Tween.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e trypan blu. Diluire ulteriormente le cellule se i conteggi delle cellule sono troppo alti. Diluire le cellule in PBS con 2% Tween alla concentrazione scelta per il rilevamento.
- Le cellule sono ora pronte per essere analizzate dal sistema PAFC.
6. Microscopia a fluorescenza dell'assorbimento di FA-CuS NPS
- Ripetere i passaggi elencati nel passaggio 5.1 e procedere con il protocollo riportato di seguito per la microscopia.
- Le cellule di semi ad una densità di 0,1 x 106 cellule/mL in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico completa su vetro si ripercano in una piastra di 24 pozzetti.
- Il giorno seguente, incubare le cellule con TAG fluorescenti FA-CuS IN triplice, a concentrazioni di 100 g/mL, 200 g/mL, 300 g/mL e 400 g/mL in 0,5 mL di foglia di RPMI-1640 senza acido.
- Incubare le cellule con le NP per 2 h nell'incubatrice a 37
- Dopo questo periodo di incubazione, lavare le cellule 3x con PBS.
NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio, aggiungere con attenzione la soluzione sul lato della piastra del pozzo per non disturbare le cellule. Dopo l'aggiunta, inclinare con attenzione la piastra e ritirare la soluzione dal lato del pozzo. - Incubare le cellule con 0,5 mL di 3,7% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 min e trasferire i coperchi di vetro in una nuova piastra di 24 pozzetti.
PRUDENTE: PFA è un cancerogeno noto. Eseguire tutte le fissazioni in una cappa di fumi chimici ventilata e indossare adeguati dispositivi di protezione personale. - Incubare le cellule in una soluzione del 3,7% di PFA con 0,1% Triton-X in PBS per 5 min.
- Lavare le celle con 0,5 mL di PBS 3x per 5 min ciascuna e trasferire i copricopertine in una nuova piastra.
- Incubare le cellule con 0,5 mL di una soluzione PBS contenente DAPI (20 l/mL di una soluzione di riserva di 0,5 mg/mL viene utilizzato per la colorazione) per 5 minuti, lontano dalla luce.
- Lavare le cellule con PBS 3x.
- Dopo il lavaggio PBS finale, montare i copricopre sui vetrini con supporto di montaggio.
- Le cellule sono ora pronte per essere immagini mediante microscopia a fluorescenza. La figura 2 mostra un esempio di caratterizzazione cellulare tipica mediante microscopia a fluorescenza.
7. Architettura del sistema di flusso
- Costruzione della camera di flusso
NOTA:Un file SolidWorks di un serbatoio di flusso stampato in 3D è disponibile nei materiali supplementari.- Utilizzando il file SolidWorks fornito, stampare in 3D il serbatoio di flusso utilizzando la termoplastica ABS o la plastica PLA. Le dimensioni sono fornite di seguito se SolidWorks non è disponibile. Figura 3A Mostra una rappresentazione di questo modello. Il corpo del serbatoio di flusso è 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Le estremità finali del serbatoio di flusso includono fori di circa 5 mm di diametro per consentire l'ingresso di tubi contenenti il tubo capillare.
NOTA: Il serbatoio di flusso ha un foro di 1 cm, perpendicolare all'orientamento del tubo capillare, per il posizionamento del trasduttore ad ultrasuoni. Un'estrusione cilindrica con lo stesso diametro interno del foro si estende per 6 mm nel serbatoio. Per l'imaging in tempo reale, il serbatoio di flusso ha uno slot da 1 mm x 3 mm direttamente sotto il tubo capillare. - Dopo aver stampato il serbatoio di flusso 3D, pulire e assemblare il sistema per l'uso.
- Posizionare le coperture in vetro sopra lo slot di 1 mm x 3 mm e il foro di 1 cm nel sistema di flusso.
- Sigillare con attenzione con silicone per evitare perdite.
- Montare il tubo capillare nei tubi curati in silicone. Inserire i tubi nella camera di flusso attraverso il lato del serbatoio di flusso in modo che il tubo capillare di vetro è direttamente sopra e davanti allo slot 3 mm e il foro di 1 cm.
- Sigillare i tubi con silicone per evitare perdite.
- Utilizzando il file SolidWorks fornito, stampare in 3D il serbatoio di flusso utilizzando la termoplastica ABS o la plastica PLA. Le dimensioni sono fornite di seguito se SolidWorks non è disponibile. Figura 3A Mostra una rappresentazione di questo modello. Il corpo del serbatoio di flusso è 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Le estremità finali del serbatoio di flusso includono fori di circa 5 mm di diametro per consentire l'ingresso di tubi contenenti il tubo capillare.
- Configurazione del sistema di flusso fotoacustico
NOTA: figura 3B e Figura 3C mostrano un esempio dell'architettura del sistema di flusso.- Collegare il trasduttore a un pulsatore/ricevitore a ultrasuoni. Amplifica il segnale con un guadagno di 59 dB.
- Collegare l'output del filtro a un oscilloscopio riconfigurabile multiuso dotato di un array di cancelli programmabili da campo integrato.
- Collegare uno dei tubi provenienti dalla camera di flusso ad una giunzione a T, collegata a due pompe di siringhe ad ogni ramo.
- Riempire una delle pompe di siringhe con aria e l'altra pompa con il campione da analizzare. Impostare la pompa contenente aria su una portata di 40 l/min e la pompa contenente il campione fino a una portata di 20 l/min. Il flusso in due fasi risultante produrrà volumi campione di 1 L. A questa portata, il sistema testerà circa 6,4 campioni al minuto.
NOTA: Per mantenere una distribuzione coerente delle cellule, vorticare leggermente ogni campione immediatamente prima di essere testato. Inoltre, ruotare la siringa ogni pochi minuti per evitare che le cellule si stabiliscano nella soluzione. - Collegare il tubo rimanente in uscita dal sistema di flusso a un contenitore con 10% candeggina, per smaltire le cellule dopo l'uscita dal sistema di flusso.
NOTA: prima di utilizzare il sistema di flusso, verificare la presenza di perdite, in quanto queste possono influire sul flusso. Le cellule devono essere contenute all'interno di un sistema chiuso per mantenere la sicurezza biologica durante la procedura. - Il design del serbatoio stampato in 3D consente un allineamento coerente e ripetibile tra il trasduttore e la luce laser con una calibrazione minima. Se posizionato correttamente all'interno del serbatoio personalizzato, il tubo capillare al quarzo assicura che il trasduttore e il laser siano allineati direttamente.
- Posizionare la sezione del tubo capillare al quarzo in allineamento diretto con il trasduttore, nel campo visivo del microscopio, consentendo un attento posizionamento della fibra ottica sopra il campione in modo da illuminare l'intera larghezza del tubo.
- Irradiare il campione utilizzando una fibra ottica che incanala un laser a stato solido pompato a diodo che opera ad una lunghezza d'onda di 1.053 nm. L'incidente della luce laser sul campione e sul trasduttore utilizzato per misurare l'effetto fotoacustico non è stato focalizzato.
- L'energia dell'incidente laser sul campione è di circa 8 mJ e la velocità laser a 10 Hz è sufficiente per illuminare ogni campione più volte mentre passa attraverso il sistema.
- Posizionare il sistema di flusso su un microscopio invertito e assicurarsi che sia l'impulso laser che il percorso del campione siano visibili man mano che il campione passa attraverso il sistema di flusso. Registrare il flusso utilizzando una telecamera montata al microscopio.
- Registrare le acquisizioni di ultrasuoni utilizzando il software di acquisizione dei dati (vedere Tabella dei materiali). Attivare ultrasuoni e laser pulsato utilizzando l'FPGA. Utilizzare PBS con 2% Tween e GLI NP FA-CuS a una concentrazione di 100 g/mL in PBS 2% Tween, rispettivamente come controlli negativi e positivi.
- Utilizzando una telecamera montata al microscopio, registrare sia la cottura del laser che il passaggio dei campioni attraverso il sistema di flusso. Queste registrazioni saranno utilizzate per correlare il segnale acustico registrato dal trasduttore con la cottura del laser. Quando i campioni passano davanti alla cottura del laser, il segnale può quindi essere correlato al segnale fotoacustico risultante per l'analisi. Ad una velocità di campionamento di 10 Hz, il laser illuminerà ogni spina più volte.
8. Post-elaborazione
- Per ogni acquisizione del segnale, s(t), calcolare la trasformazione Hilbert, H[s(t)], al fine di creare un segnale analitico.
- Creare un involucro complesso, se(t), calcolando la grandezza
del segnale analitico, in modo tale da integrare l'involucro per misurare il segnale totale risultante da ogni acquisizione. Confrontare i segnali di ogni gruppo di test (ad esempio PBS, celle con tag, NP FA-CuS, sole cellule) utilizzando un test t nel software statistico R. I segnali fotoacustici grezzi e le loro trasformazioni di Hilbert sono presentati nella Figura 4. - Per la ricostruzione dell'immagine, normalizzare l'inviluppo complesso in base al picco massimo dell'intera conduzione. Se si confronta una serie di condutture, normalizzare l'involucro complesso utilizzando il picco massimo dell'intera serie. Dopo la normalizzazione, converti ogni acquisizione in una serie di valori di pixel. Rappresenta ogni serie di valori di pixel come colonna nella ricostruzione dell'immagine. Le ricostruzioni rappresentative di PBS e dei segnali NP FA-CuS sono mostrate nella Figura 5, dove entrambe le immagini sono state normalizzate utilizzando il picco massimo in entrambe le esecuzioni.
del segnale analitico, in modo tale da integrare l'involucro per misurare il segnale totale risultante da ogni acquisizione. Confrontare i segnali di ogni gruppo di test (ad esempio PBS, celle con tag, NP FA-CuS, sole cellule) utilizzando un test t nel software statistico R. I segnali fotoacustici grezzi e le loro trasformazioni di Hilbert sono presentati nella Figura 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1A mostra una tipica immagine TEM delle nanoparticelle sintetizzate. La dimensione media della nanoparticella tipica è di circa 8,6 nm e 2,5 nm. La misurazione delle nanoparticelle è stata eseguita in ImageJ. Sono state applicate funzioni di soglia e spartiacque per separare le particelle per la misurazione. I diametri orizzontali e verticali di ogni particella sono stati misurati perpendicolarmente l'uno all'altro e ulteriormente mediati. Per DLS, una misura rappresentativa è illustrata nella Figura 1B. Il diametro idrodinamico medio per queste particelle è di 73,6 nm. Le nanoparticelle di solfuro di rame hanno una curva di assorbimento caratteristica che si estende nel NIR, come mostrato nella Figura 1C. C'è un leggero artefatto di circa 850 nm che è stato causato dalla commutazione di laser dallo spettrofotometro.
Le immagini di microscopia a fluorescenza di cellule incubate con nanoparticelle fluorescenti possono essere osservate nella Figura 2. L'assorbimento di nanoparticelle può essere visualizzato dalla presenza di fluorescenza in tutta la cellula. Le cellule non incubate con nanoparticelle non mostrano alcun segnale di fluorescenza. La presenza di questo segnale di fluorescenza indica il successo dell'assorbimento delle particelle e la loro capacità di essere rilevati nel sistema di flusso.
La figura 3 mostra la configurazione generale del sistema di flusso fotoacustico. Figura 3A mostra un modello dettagliato della camera di flusso 3D. Questa camera può essere stampata utilizzando il file .stl fornito con questo protocollo. Figura 3B mostra una panoramica della configurazione del serbatoio di flusso. Figura 3C mostra una configurazione generale del serbatoio di flusso e sistema di acquisizione dei dati.
I tipici segnali di acquisizione dei dati sono illustrati nella Figura 4. I dati grezzi indicano le differenze nel segnale tra le cellule con tag nanoparticelle, PBS e IP-CuS NP. Un'acquisizione è il segnale fotoacustico risultante generato da un singolo impulso laser. A causa del rapido tasso di cottura del laser, ogni campione analizzato genera più acquisizioni. Una busta per ogni singola acquisizione è stata generata utilizzando la trasformazione di Hilbert. Questa busta è stata integrata per misurare la quantità totale di segnale generato dall'impulso laser. In uno studio precedente, questi dati sono stati analizzati utilizzando il software statistico R, dove il numero di acquisizioni analizzate per il test t è stato 203, 150, 160 e 131, per le celle con NP, celle da sole, PBS e NP da soli, rispettivamente22. I dati sono stati normalizzati dalla trasformazione del log e confrontati utilizzando un test t di Welch in R.The data were normalized by log transformation and compareding utilizzando a Welch's t-test in R. I segnali risultanti dai soli NP FA-CuS ad una concentrazione di 100 g/mL hanno mostrato un segnale molto più alto rispetto al controllo negativo. La differenza nei segnali tra il controllo negativo e i CTC ovarici con tag era più sottile del controllo positivo, ma poteva essere rilevata attraverso l'analisi dei loro mezzi da un t-test22.
Utilizzando il software personalizzato LabView e MATLAB, sono state effettuate ricostruzioni di immagini dei controlli positivi e negativi in tempo reale e dopo l'acquisizione, rispettivamente. Al fine di generare le ricostruzioni fotoacustiche, è stata calcolata una busta di ogni acquisizione utilizzando la trasformazione di Hilbert. I singoli inviluppi sono stati successivamente convertiti in valori in pixel e visualizzati come colonne indipendenti. Si verificano chiare differenze nel segnale fotoacustico tra gli NP FA-CUS ad una concentrazione di 100 g/mL e il campione PBS (Figura 5). I controlli per il sistema sono importanti per garantire che il sistema produca in modo adeguato il segnale fotoacustico che può essere rilevato dal trasduttore.
Figura 1: Caratterizzazione NP rappresentativa. (A) Immagine TEM di NP FA-CuS sintetizzati. (B) Distribuzione di intensità DLS rappresentativa di NP FA-CuS di dimensioni sintetizzate (C) Rappresentante FA-CuS NPs curva di assorbimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini di microscopia a fluorescenza rappresentativa delle cellule SKOV-3. Le cellule sono state incubate con e senza 400 G/mL di NP fluorescenti.
Figura 3: Immagini rappresentative del sistema di citometria a flusso fotoacustico e della camera di flusso. (A) Vista dettagliata della camera a flusso stampata in 3D. (B) Diagramma del sistema PAFC. (C) Architettura del sistema di flusso: SP - pompa di siringa; DAQ/FPGA : array di porte programmabili per l'acquisizione/campo dei dati; Ob - lente obiettivo; OF - fibra ottica; FC - accoppiatore in fibra; UT - trasduttore ad ultrasuoni; FT - serbatoio di flusso. Questa cifra è adattata da Lusk et al.22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Segnale dati grezzi rappresentativo e trasformazioni Hilbert di campioni testati nel sistema di flusso. (A) Segnalazione rappresentativa dei dati grezzi provenienti da PBS e cellule incubate da NP e dalla trasformazione(D)di Hilbert dei dati. (B) I dati grezzi rappresentativi segnalano dalle sole cellule e dalle cellule incubate con NP FA-CuS e (E) la trasformazione di Hilbert dei dati. (C) Rappresentante segnale di dati grezzi da PBS e 100 G/mL FA-CuS NP e (F) la trasformazione Hilbert dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentazione ricostruzioni di immagini fotoacustiche dei dati fotoacustici. (A) Ricostruzione dell'immagine di 100 FP FA-CuS e PBS(B)testati all'interno del sistema di flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Camera di flusso STL. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Questo protocollo è un metodo semplice per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano PAFC e un agente di contrasto CuS mirato. Sono stati esplorati molti metodi per il rilevamento di CTC ovarici, tra cui dispositivi microfluidici, RT-PCR e citometria del flusso di fluorescenza23,24,25. Questi variano in complessità, costi e precisione, limitando la loro efficacia in ambienti clinici. PAFC introduce diversi vantaggi rispetto a questi metodi tradizionali per il rilevamento dei CTC, tra cui la capacità di rilevare i CTC all'interno dei campioni dei pazienti e la sua facilità di traduzione in applicazioni in vivo. PAFC ha anche dimostrato di rilevare con precisione i CTC in vitro e in vivo quando combinato con agenti di contrasto mirati26,27.
In questo lavoro, sono stati valutati gli agenti di contrasto FA-CuS NP per la loro capacità di migliorare l'accuratezza del rilevamento CTC a concentrazioni fisiologicamente rilevanti. Gli studi sono stati effettuati utilizzando cellule SKOV-3 isolate risospese in PBS. L'analisi mediante microscopia a fluorescenza ha indicato il successo dell'assorbimento di queste particelle. I risultati hanno rilevato cellule SKOV-3 fino a una concentrazione di 1 cellula/L22. I passi cruciali di questo protocollo riguardano la sintesi delle nanoparticelle e l'allineamento della configurazione del flusso fotoacustico. Durante la sintesi delle nanoparticelle, è importante assicurarsi che la soluzione abbia trasformato un colore verde scuro prima di rimuovere la miscela dal bagno d'olio. Per il sistema di flusso, l'esecuzione di un controllo negativo e positivo anche se il sistema prima del test del campione è necessaria per garantire che il sistema produca un segnale fotoacustico adeguato per il successivo rilevamento delle celle etichettate. Durante l'esecuzione del sistema di flusso, è importante assicurarsi che la luce incidente dalla fibra ottica stia illuminando completamente il tubo capillare e che il trasduttore sia aderente al lato della camera di flusso. Infine, è necessario testare rigorosamente il sistema per le perdite per garantire la sicurezza biologica del sistema e per un flusso coerente attraverso la camera.
Per l'attuale sistema PAFC, gli studi preliminari hanno confermato il rilevamento fotoacustico utilizzando il sistema di trasduttore e amplificazione. La maggior parte di questi segnali erano costituiti da segnali di frequenza più bassa (<20 MHz). Sono necessari ulteriori studi per confermare se ciò sia dovuto all'effettiva frequenza dei segnali fotoacustici generati o alla larghezza di banda a 35 MHz dell'amplificatore. Studi futuri studieranno i componenti di frequenza dei segnali rilevati al fine di ottimizzare la frequenza centrale del trasduttore e la larghezza di banda del sistema di amplificazione. L'attuale sistema è particolarmente adatto per il rilevamento ex vivo dei CTC. Tuttavia, questo metodo identifica il potenziale per la futura applicazione dei NP FA-CuS in vivo.
Studi futuri mirano a rilevare le cellule tumorali ovariche all'interno di colture miste, campioni clinici umani e modelli in vivo28,29,30. Inoltre, studi futuri esamineranno la specificità di queste nanoparticelle rispetto ai controlli non mirati. La futura convalida di questo metodo includerà il test di questo strumento con campioni clinici umani, l'implementazione di test e analisi ad alta velocità effettiva e la traduzione in ambienti clinici. Questa tecnica fotoacustica mostra il potenziale per la traduzione futura a un'ampia varietà di applicazioni cliniche e malattie in una vasta gamma di agenti di contrasto e analiti. Il rilevamento fotoacustico degli analiti che utilizzano PAFC ha il potenziale per rendere più rapida ed economica la rilevazione del punto di cura dei CTC e di altri patogeni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere Madeleine Howell per il suo aiuto con la sintesi, Matthew Chest per il suo aiuto nella progettazione del sistema di flusso e Ethan Marschall per l'assistenza con SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
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