Summary
カスタムメイドの光音響流れ系と標的葉酸キャップ銅硫化銅ナノ粒子を利用した循環卵巣腫瘍細胞を検出するプロトコルが提示される。
Abstract
多くの研究は、循環腫瘍細胞(CtC)の列挙が卵巣癌の予後ツールとしての約束を示すかもしれないことを示唆している。CTCの検出のための現在の戦略は、フローサイトメトリー、マイクロ流体デバイス、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を含みます。最近の進歩にもかかわらず、早期卵巣癌転移の検出方法は、臨床翻訳に必要な感受性および特異性を依然として欠いている。ここでは、フローチャンバーやシリンジポンプを含むカスタム3次元(3D)プリントシステムを利用した光音響フローサイトメトリー(PAFC)による卵巣循環腫瘍細胞の検出に関する新しい方法を提示する。この方法は、PFCによるSKOV-3卵巣癌細胞を標的とする葉酸キャップ硫化銅ナノ粒子(FA-CuS NPs)を利用する。この研究は、卵巣癌細胞に対するこれらの造影剤の親和性を示す。その結果、蛍光顕微鏡によるNP特性評価、PAFC検出、NP取り込みが示され、生理学的に関連する濃度で卵巣CtCを検出するこの新規システムの可能性を実証した。
Introduction
卵巣癌は最も致命的な婦人科の悪性腫瘍の一つであり、2018年に世界中で推定184,800人の死亡をもたらした。複数の研究は、卵巣癌の進行(すなわち、転移)とCTC2、3、4の存在との間の相関関係を示している。CTCの検出および単離のための最も一般的な方法は、EpCam受容体5を標的とするセルサーチシステムを利用する。しかしながら、EpCam発現は、癌転移6に関与している間葉転移に対する上皮においてダウンレギュレートされる。進歩にもかかわらず、現在の臨床技術は依然として低い精度、高コスト、複雑さに苦しんでいます。これらの欠点により、卵巣CTCの発見と列挙のための新しい技術は、研究の重要な分野となっています。
近年、PAFCは、がん細胞の非侵襲的検出、ナノ材料の分析、および細菌7、8、9の同定に有効な方法として浮上した。PAFCは、光音響を利用して流れの中の分析物を検出することにより、従来の蛍光フローサイトメトリーとは異なります。光音響効果は、熱弾性膨張を引き起こす材料によってレーザー光が吸収されると生成され、超音波トランスデューサ10、11によって検出できる音響波を生成する。従来のフローサイトメトリー法に対するPAFCの利点は、簡潔さ、臨床設定への翻訳の容易さ、および患者サンプル12、13における前例のない深さでのCTCの検出を含む。最近の研究では、内因性および気球コントラスト14、15を用いた細胞の検出にPAFCシステムを利用している。近赤外線(NIR)は、インドシアニン緑色色素などの光吸収造影剤、および金属NP(例えば、金およびCuS)を光音響イメージング16、17、18と組み合わせて細胞および組織の選択的標識に使用されている。生体組織内のNIR光の浸透深さが改善されたため、吸収剤の光音響検出は臨床応用のためのより大きな深さで行うことができる。クリニックでの使用の可能性が大きいため、標的NIR造影剤とPAFCの組み合わせにより、CTCの検出に大きな関心が生じています。
PAFCとターゲット造影剤を組み合わせることで、CTCの精度向上と標的検出を行う患者サンプルの高スループット分析に対する改善されたアプローチが提供されます。CTCの主要な検出戦略の1つは、目的の細胞上に存在する膜タンパク質の特異的ターゲティングです。卵巣CtCの顕著な特徴の1つは、外膜19に位置する葉酸受容体の過剰発現である。葉酸受容体ターゲティングは、葉酸受容体の発現が高い内因性細胞が一般的に発光しており、血流20への暴露が制限されているため、血液中の卵巣CTCの同定のための理想的な戦略である。硫化銅NP(CuS NPs)は、最近、癌細胞21に発現する葉酸受容体を標的とする能力が認められている。NIRの生体適合性、合成の容易さ、吸収と組み合わせることで、これらのNP造影剤はPAFCを利用した卵巣CtCの検出に理想的なターゲティング戦略を作ります。
本研究では、FA-CuS NPの調製と光音響流れ系における卵巣癌細胞の検出のための使用について説明する。CuSのNPは、特に卵巣CTCを標的とし、1,053 nmレーザーで刺激されたときに光音響信号を放出するために葉酸で修飾されます。この結果は、PAFCシステム内でこれらの光音響造影剤をインキュベートした卵巣癌細胞の検出に成功したことを示している。これらの結果は、1細胞/μLの濃度まで卵巣癌細胞の検出を示し、蛍光顕微鏡検査は、SKOV−3卵巣癌細胞22によるこれらの粒子の取り込みに成功したことを確認する。本研究では、FA-CuSのNS合成、蛍光顕微鏡用試料の調製、光音響流れ系の構築、卵巣癌細胞の光音響検出について詳しく説明する。提示された方法は、FA-CuS NPsを利用した流れの卵巣CTCの正常な同定を示す。
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Protocol
1. ナノ粒子合成と機能化
注:FA-CuS SPの合成は、以前に公開されたプロトコル21から適合した1つのポット合成法を使用して達成される。
注意:すべての合成は、換気された化学ヒュームフードで発生する必要があります。
- 合成の前に、0.2μmの滅菌フィルターを用いて約300mLの脱イオン化(DI)水を濾過する。
- 洗剤液で250mLガラスの丸底フラスコを洗浄し、DI水で洗い流します。1mMの溶液を作成するために、100 mLのDI水にCuCl2の0.0134 gを追加します。
- CuCl2溶液に0.015gの葉酸(FA)を加え、磁気攪拌バーを使用して約5分間撹拌します。
- 200°Lピペットを利用した反応混合物に、Na2S・9H2O(100μL DI水で0.024g)を約10s以上添加します。
メモ:Na2S·9H2Oを追加すると、溶液は明るい黄色から濃い茶色に色を変更します。 - 反応をキャップし、オイルバスに入れ、90°Cに設定し、磁気攪拌バーで攪拌を続けます。約15分後、またはオイルバスが85-90°Cに達したら、さらに1時間反応を進めさせる。混合物は徐々に濃い緑色に変わるはずです。
メモ:圧力の蓄積を避けるために、反応混合物を加熱しながらシステムを通るようにしてください。 - オイルバスから反応容器を取り出し、室温で約10~15分間冷ましてから氷浴に移します。
- 反応混合物が20°C以下に冷却されたら、1M NaOHを利用してpHを10に調整し、残りの葉酸を溶液に溶解させる。
- 30 kDa遠心分離カラムを使用してFA-CuS反応混合物を精製します。15 mL バッチで溶液をカラムに追加し、3,082 x g で 15 分間遠心分離します。
- 全ての反応混合物が濃縮されたら、濃縮画分を再結合し、30kDa遠心分離カラムでpH10 NaOHの15 mLで4x洗浄する。
- 質量測定の場合は、溶液の1/3(〜66°L)を取り、3つのガラスバイアルに分割します。真空オーブンで40°Cで~27mmHgの真空下で一晩乾燥させます。
- 濃縮溶液の他の2/3を250°LのPBSに溶かし、さらに使用するまで4°Cで保存します。
- FA-CuSのNPを利用する前に、高い設定で浴ソニシエーターで30分間超音波処理します。
2. NP特性評価
- 動的光散乱(DLS)を実行し、ステップ1.1.14から2 mLのDI水からPBS溶液に濃縮FA-CuS NPSを10°L追加します。DLSによる特性評価の前に、高い設定で浴ソニシエーターで30分間粒子を超音波処理し、0.2μmの滅菌フィルターを通して残留粉塵を除去します。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)を行う:PBS溶液に濃縮FA-CuS NPSを10μLをワックス紙に加えます。液滴の上部にあるフォームバー被覆銅グリッドを反転し、2分間座らせます。空気を乾燥させてください。80kVの加速電圧で電子顕微鏡を利用した銅グリッドを画像化する。
注: FA-CuS NPS 特性評価の一般的な結果を図 1に示します。
3. 細胞培養
- このプロトコルはSKOV-3細胞を利用する。特に断りのない限り、マッコイの5A培地中のSKOV-3細胞を10%FBS、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加し、湿度の高い5%CO2インキュベーターで37°Cに維持した。
4. 顕微鏡検査のためのFA-CuS NPSの蛍光タグ付け
- 0.1 M NaHCO3 (pH ~9) バッファーの 1 mL で FA-CuS NPs の 2 mg を含む溶液にテキサスレッド-X コハニジルエステル (10 mg/mL の濃度で DMSO に溶解 0.2 mg) を追加します。
- 室温で光から離れて、磁気攪拌バーを使用して反応混合物を1時間攪拌する。
- 4mL 30 kDa MWCO遠心分離カラムに反応混合物を濃縮し、4,000 x gで10分間回転させます。
- 濃縮溶液3xを4mLの0.1 M NaHCO3緩衝液(pH~9)で遠心分離カラムで洗浄します。続いて、4mLのDI水3xで濃縮溶液を洗浄するか、UV-VISによる流れに微量の蛍光のみが見えるまで洗浄します。
5. FA-CuS NPS 卵巣癌細胞による取り込み
- FA-CuS NPsによるインキュベーションの前に、T75フラスコにSKOV-3細胞をインキュベートし、葉酸フリーRPMI-1640メディアの8-15 mLを10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを少なくとも24時間使用します。
- 葉酸を含まないRPMI-1640の0.5 mLの種子細胞は、24ウェルプレートに0.1 x 106細胞/mLの密度で完全な増殖媒体を完成させます。
- 翌日、葉酸フリーRPMI-1640完全成長媒体の0.5 mLで400μg/mL FA-CuS NPSで細胞を2時間インキュベートする。
- このインキュベーションに続いて、EDTAで0.5 mLの0.25%トリプシンで細胞をトリプシン化します。葉酸フリーRPMI-1640完全成長媒体の少なくとも1 mLを加えてトリプシンを中和し、細胞を123 x gで6分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、細胞を2mLのPBSで再サスペンドし、123 x gで6分間遠心分離機を行い、この洗浄ステップ2xを実行して非結合のNPを取り除きます。
- 2%の間引き溶液で1-2 mLのPBSで細胞を再サスペンドします。
- 血球計を使用して細胞をカウントし、青をトリパンします。セル数が多すぎる場合は、さらにセルを希釈します。検出のために選択した濃度に2%ツイーンでPBS内の細胞を希釈します。
- これで、セルを PAFC システムで分析する準備ができました。
6. FA-CuS NPS取り込みの蛍光顕微鏡
- 手順5.1に示す手順を繰り返し、顕微鏡検査のために以下のプロトコルに進みます。
- 葉酸フリーRPMI-1640の0.5 mLの密度0.1 x 106細胞/mLの種子細胞は、24ウェルプレートのガラスカバーリップ上の完全な成長媒体。
- 翌日、蛍光タグ付きFA-CuS NPを300μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mLの濃度で、葉酸フリーRPMI-1640完全成長媒体の0.5 mLでインキュベートします。
- 37°インキュベーターで2時間のNPsで細胞をインキュベートする
- このインキュベーション期間に続いて、細胞をPBSで3x洗浄する。
メモ:すべての洗浄手順について、ウェルプレートの側面に溶液を慎重に追加して、細胞を乱さないで下します。追加後、慎重にプレートを傾け、井戸の側面から溶液を引き出します。 - PBSで0.5 mLの3.7mLの細胞を15分間PBSでインキュベートし、ガラスカバーリップを新しい24ウェルプレートに移します。
注意: PFA は既知の発がん性物質です。換気された化学ヒュームフードですべての固定を行い、適切な個人的な保護具を着用してください。 - PBSで0.1%トリトンXを5分間用して3.7%PFAの溶液中の細胞をインキュベートする。
- それぞれ5分間、0.5 mLのPBS 3xで細胞を洗浄し、カバーリップを新しいプレートに移します。
- DAPIを含むPBS溶液の0.5 mLで細胞をインキュベートし(0.5 mg/mLの20 μL/mLを染色に使用)、光から離れた5分間インキュベートします。
- PBS 3xで細胞を洗浄します。
- 最後のPBS洗浄に続き、取り付け媒体を備えたスライドにカバーリップを取り付けます。
- 細胞は蛍光顕微鏡で画像化する準備ができました。図2は、蛍光顕微鏡による典型的な細胞特性評価の一例を示す。
7. フローシステムアーキテクチャ
- フローチャンバー構造
注:3DプリントフロータンクのSolidWorksファイルは、補足資料にあります。- 提供されている SolidWorks ファイルを使用して、ABS 熱可塑性または PLA プラスチックを使用してフロー タンクを 3D プリントします。SolidWorks が使用できない場合、寸法は以下に示します。図 3A は、このモデルの表現を示しています。流れタンクの本体は2.5cm x 1.5 cm x 7.5 cmです。流れタンクの遠端には、毛細管を含むチューブの入り口を可能にするために直径約5mmの穴が含まれる。
注:フロータンクは、1cmの穴を有し、毛細管の向きに垂直で、超音波トランスデューサの配置のため。穴と同じ内径の円筒形の押し出しは、タンクに6mm伸びる。リアルタイムイメージングのために、流れタンクは毛細管の直下に1 mm x 3 mmスロットを有する。 - 3Dフロータンクを印刷した後、使用するためにシステムをきれいにし、組み立てます。
- 1 mm x 3 mm スロットの上にガラスカバースリップを配置し、フロー システムの 1 cm の穴を配置します。
- 漏れを防ぐために慎重にシリコーンで密封してください。
- キャピラリーチューブをシリコーン硬化チューブに取り付けます。フロータンクの側面が3mmスロットと1cmの穴の真上と前面にあるように、フロータンクの側面を使用してチューブをフローチャンバーに挿入します。
- 漏れを防ぐためにシリコーンを使用してチューブを密封します。
- 提供されている SolidWorks ファイルを使用して、ABS 熱可塑性または PLA プラスチックを使用してフロー タンクを 3D プリントします。SolidWorks が使用できない場合、寸法は以下に示します。図 3A は、このモデルの表現を示しています。流れタンクの本体は2.5cm x 1.5 cm x 7.5 cmです。流れタンクの遠端には、毛細管を含むチューブの入り口を可能にするために直径約5mmの穴が含まれる。
- 光音響流れシステムのセットアップ
メモ:図3Bおよび図3Cは、フローシステムアーキテクチャの例を示しています。- 超音波パルサー/受信機にトランスデューサを接続します。59 dBゲインで信号を増幅します。
- フィルターの出力を、組み込みのフィールドプログラマブルゲートアレイを備えた多目的再構成可能オシロスコープに接続します。
- フローチャンバから来るチューブの1つをTジャンクションに接続し、各分岐で2つのシリンジポンプに接続します。
- 一方の注射器ポンプに空気を充填し、もう一方のポンプを分析するサンプルで満たします。空気を含むポンプを流量40μL/分、サンプルを含むポンプを20μL/分の流量に設定します。得られた2相流れは、1 μLのサンプル体積を生成します。この流量では、システムは毎分約6.4サンプルをテストします。
メモ:細胞の一貫した分布を維持するために、テストされる直前に各サンプルを軽く渦状にします。さらに、細胞が溶液中に沈降するのを防ぐために、数分ごとに注射器を回転させます。 - フローシステムを出る残りのチューブを10%漂白剤の容器に接続し、フローシステムを終了した後に細胞を処分します。
メモ:フローシステムを使用する前に、フローに影響を与える可能性があるため、リークを確認してください。細胞は、処置中に生物学的安全性を維持するために、閉じたシステム内に含まれている必要があります。 - 3Dプリントタンクの設計により、トランスデューサとレーザー光の間の一貫した繰り返し可能なアライメントを最小限のキャリブレーションで可能にします。カスタムタンク内に正しく配置されると、石英キャピラリーチューブはトランスデューサとレーザーが直接位置合わせされることを保証します。
- クォーツキャピラリーチューブの断面をトランスデューサと直接整列させ、顕微鏡の視野に入れ、試料の上に光ファイバを慎重に配置し、チューブの全幅を照らすことを可能にする。
- 1,053 nmの波長で作動するダイオードポンプ固体レーザーをチャネリングする光ファイバを用いて試料を照射する。光音響効果を測定するために使用されるサンプルおよびトランスデューサに入射するレーザー光は、両方とも焦点が合っていない。
- サンプルに入射するレーザーのエネルギーは約8mJで、10Hzレーザーレートは、各サンプルがシステムを通過する場合に複数回照らすのに十分です。
- 反転顕微鏡の上にフローシステムを置き、サンプルがフローシステムを通過する場合、レーザーパルスとサンプルのパスの両方が見えるようにします。顕微鏡に取り付けたカメラを使用した記録フロー。
- データ取得ソフトウェアを使用した超音波取得を記録します(材料表を参照)。FPGAを使用して超音波とパルスレーザーをトリガします。2% Tween の PBS と FA-CuS の NP を PBS 2% Tween で 100 μg/mL の濃度で使用し、それぞれ負および陽性のコントロールとして使用します。
- 顕微鏡搭載カメラを利用して、レーザーの発射とサンプルの通過の両方をフローシステムで記録します。これらの記録は、トランスデューサによって記録された音響信号とレーザーの焼成を相関させるために利用される。サンプルがレーザーの発射の前を通過すると、信号は分析のために得られる光音響信号と相関させることができます。10 Hzのサンプリングレートで、レーザーは各プラグを数回照らします。
8. 後処理
- 各信号集録s(t)について、分析信号を作成するためにヒルベルト変換H[s(t)]を計算します。
- 複素エンベロープを作成し、se(t)、分析信号の大きさを算出して、エンベロープ
を統合して各集録から得られる総信号を測定する。R統計ソフトウェアのt検定を利用して、各試験群(すなわち、PBS、タグ付き細胞、FA-CuS NPs、細胞単独)からの信号を比較します。生の光音響信号とそのヒルベルト変換を図4に示します。 - イメージの再構築では、実行全体の最大ピークに基づいて複雑なエンベロープを正規化します。一連の実行を比較する場合は、系列全体の最大ピークを使用して複雑なエンベロープを正規化します。正規化に続いて、各取得を一連のピクセル値に変換します。イメージの再構築の列として、ピクセル値の各系列を表します。PBS信号とFA-CuS NPs信号の代表的な再構成を図5に示し、両方の実行で最大ピークを使用して両方の画像を正規化した。
を統合して各集録から得られる総信号を測定する。R統計ソフトウェアのt検定を利用して、各試験群(すなわち、PBS、タグ付き細胞、FA-CuS NPs、細胞単独)からの信号を比較します。生の光音響信号とそのヒルベルト変換を図4に示します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1Aは、合成されたナノ粒子の典型的なTEM像を示す。典型的なナノ粒子の平均サイズは約8.6nm±2.5nmである。ナノ粒子測定はImageJで行った。閾値および流域機能は、測定のために粒子を分離するために適用された。各粒子の水平および垂直直径は互いに垂直に測定され、さらに平均した。DLS の場合、代表的な測定値を図 1Bに示します。これらの粒子の平均流体力学的直径は73.6nmである。硫化銅ナノ粒子は、図1Cに示すように、NIRに延びる特性吸光度曲線を有する。分光光度計によるレーザーの切り替えによって引き起こされた850 nmの周りのわずかなアーティファクトがあります。
蛍光タグ付きナノ粒子でインキュベートされた細胞の蛍光顕微鏡画像を図2に見ることができる。ナノ粒子の取り込みは、細胞全体にわたる蛍光の存在によって可視化することができる。ナノ粒子でインキュベートされていない細胞は蛍光シグナルを示さない。この蛍光シグナルの存在は、粒子の取り込みに成功し、フローシステムで検出される能力を示します。
図3は、光音響流れシステムの一般的な設定を示す。図3Aは、3Dフローチャンバの詳細なモデルを示す。このチャンバーは、このプロトコルで提供される.stlファイルを利用して印刷することができます。図 3Bは、フロー タンクの設定の概要を示しています。図3Cは、フロータンクとデータ集録システムの一般的な設定を示しています。
一般的なデータ集録信号を図4に示します。生データは、ナノ粒子タグ付きセル、PBS、およびFA-CuS NPs間の信号の違いを示します。集録とは、単一のレーザーパルスから生成される光音響信号です。レーザーの急速な発射速度のために、分析された各サンプルは複数の集録を生成する。ヒルベルト変換を使用して、個々の取得のエンベロープが生成されました。このエンベロープは、レーザーパルスから生成される信号の総量を測定するために統合されました。以前の研究では、これらのデータはR統計ソフトウェアを使用して分析され、t検定のために分析された集録の数は203、150、160、および131であり、NP、細胞単独、PBS、およびNP単独の細胞に対して、それぞれ22であった。データは、ログ変換によって正規化され、RでWelchのt検定を利用して比較されました。FA-CuSのNP単独から生じる信号は、100μg/mLの濃度で、負の制御よりもはるかに高い信号を示した。陰性対照とタグ付けされた卵巣CtCとの間の信号の違いは、陽性対照よりも微妙であったが、t検定22によってその手段の分析を通じて検出することができた。
カスタムLabViewおよびMATLABソフトウェアを使用して、画像の再構築は、それぞれリアルタイムおよび取得後の正と負のコントロールで作られました。光音響再構成を生成するために、ヒルベルト変換を用いて各集録のエンベロープを計算した。その後、個々のエンベロープはピクセル値に変換され、独立した列として表示されます。光音響信号の明確な違いは、100 μg/mLの濃度でFA-CuSのNPとPBSサンプルの間で起こります(図5)。システムの制御は、システムがトランスデューサによって検出できる光音響信号を適切に生成していることを確認するために実行することが重要です。
図 1: 代表的な NP 特性評価(A)合成 FA-CuS NPs の TEM イメージ スケール バー = 50 nm。(B)合成FA-CuS NPsの代表的なDLS強度分布(C)代表的なFA-CuS NPs吸光度曲線。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SKOV-3細胞の代表的な蛍光顕微鏡画像。細胞は400 μg/mL蛍光タグ付きのNPsの有無にかかわらずインキュベートされた。
図3:光音響フローサイトメトリーシステムおよびフローチャンバーの代表的な画像。(A) 3Dプリントフローチャンバーの詳細図。(B) PAFCシステムの図(C) フローシステムアーキテクチャ: SP = シリンジポンプ;DAQ/FPGA = データ集録/フィールドプログラマブルゲートアレイ。Ob = 対物レンズ;OF = 光ファイバ;FC = ファイバーカプラー;UT = 超音波トランスデューサ;FT = フロータンク。この図は、Luskら22から適合している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:フローシステムで試験されたサンプルの代表的な生データ信号とヒルベルト変換。(A)PBSおよび細胞からの代表的な生データ信号を、NPおよび(D)ヒルベルト変換でインキュベートしたデータ。(B)細胞単独からの代表的な生データ信号と、FA-CuS NPおよび(E)データのヒルベルト変換でインキュベートされた細胞。(C) PBSおよび100μg/mL FA-CuS NPsからの代表的な生データ信号と(F)データのヒルベルト変換。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:光音響データの代表的な光音響画像再構成。(A) フローシステム内で試験した100μg/mL FA-CuS NPsおよび(B)PBSの画像再構成。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: フローチャンバーSTL.このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
このプロトコルは、PAFCおよび標的CuS造影剤を利用した卵巣CTCの検出のための簡単な方法である。マイクロ流体デバイス、RT-PCR、および蛍光フローサイトメトリー23、24、25を含む卵巣CTCの検出のための多くの方法が検討されている。これらの範囲の複雑さ、コスト、および精度は、臨床現場での有効性を制限します。PAFCは、患者サンプル内のCTCを検出する機能や、生体内アプリケーションへの変換の容易さなど、CTCの検出に関するこれらの従来の方法に対していくつかの利点を導入しています。PAFCはまた、標的造影剤26、27と組み合わせた場合に、インビトロおよびインビボでCTCを正確に検出することも示されている。
本研究では、FA-CuS NP造影剤が生理学的に関連する濃度でCTC検出の精度を向上させる能力について評価した。試験は、PBSに再懸濁した単離されたSKOV-3細胞を用いて行った。蛍光顕微鏡による分析は、これらの粒子の取り込みに成功したことを示した。その結果、SKOV-3細胞を1細胞/μL22の濃度まで検出した。このプロトコルの重要なステップは、ナノ粒子合成と光音響流のセットアップのアライメントを含みます。ナノ粒子合成の間、溶液が油浴から混合物を除去する前に濃い緑色に変わっていることを確認することが重要です。フローシステムでは、サンプルテストの前にシステムがラベル付きセルの後続の検出に十分な光音響信号を生成していることを確認するために、システムを使用して負および陽性の制御を実行する必要があります。フローシステムを実行している間、光ファイバからの入射光が毛細管を完全に照らし、トランスデューサが流れ室の側面にぴったりであることを確認することが重要です。最後に、漏出のためのシステムの厳格なテストは、システムの生物学的安全性を確保し、チャンバーを通して一貫した流れのために必要です。
現在のPAFCシステムでは、予備調査ではトランスデューサと増幅システムを用いた光音響検出を確認した。これらの信号の大部分は、低周波信号(<20 MHz)で構成されていました。これは、生成された光音響信号の実際の周波数またはアンプの35 MHz帯域幅によるものかどうかを確認するために、さらなる研究が必要です。今後の研究では、トランスデューサの中心周波数と増幅システムの帯域幅を最適化するために、検出された信号の周波数成分を調査する。現在のシステムは、CTCのex vivo検出に特に適しています。ただし、この方法は、生体内での FA-CuS NPs の将来の適用の可能性を識別します。
今後の研究は、混合培養物、ヒト臨床試料、および生体内モデル28、29、30内の卵巣癌細胞を検出することを目的とする。さらに、今後の研究では、これらのナノ粒子と非標的制御の特異性を検討する。この方法の将来の検証には、ヒト臨床サンプルによるこのツールのテスト、高スループットのテストと分析の実装、臨床設定への変換が含まれます。この光音響技術は、様々な造影剤および分析物にわたる多種多様な臨床応用および疾患への将来の翻訳の可能性を示す。PAFCを利用した麻酔物の光音響検出は、CTCやその他の病原体のポイント・オブ・ケア検出をより迅速かつ安価にする可能性を秘めています。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者たちは、合成の助けのためにマドレーヌ・ハウエル、フローシステムを設計する彼の助けのためのマシュー・チェスト、およびSolidWorksの支援のためのイーサン・マーシャールを認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
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