Summary
프로토콜은 맞춤형 광음향 흐름 시스템 및 표적 엽산 덮인 구리 황화물 나노 입자를 활용하여 순환 난소 종양 세포를 검출하기 위해 제시된다.
Abstract
많은 연구는 순환 종양 세포의 열거제안 (CTC) 난소 암에 대한 예후 도구로 약속을 표시 할 수 있습니다. CTC 검출을 위한 현재 전략에는 유세포 분석, 미세 유체 장치 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 포함됩니다. 최근의 발전에도 불구하고, 조기 난소암 전이를 검출하는 방법은 여전히 임상 번역에 필요한 민감도 및 특이성이 결여되어 있다. 여기서, 유동챔버 및 주사기 펌프를 포함하는 맞춤형 3차원(3D) 인쇄 시스템을 활용한 광음향 유동 세포분석(PAFC)에 의한 난소 순환 종양 세포의 검출을 위한 새로운 방법이 제시된다. 이 방법은 엽산으로 덮인 구리 황화물 나노 입자 (FA-CuS NPs)를 사용하여 PAFC에 의해 SKOV-3 난소 암 세포를 표적으로 합니다. 이 작품은 난소 암 세포를 위한 이 조영제의 친화성을 보여줍니다. 결과는 형광 현미경 검사법에 의하여 NP 특성, PAFC 탐지 및 NP 장악을 보여주고, 따라서 생리적으로 관련있는 농도에서 난소 CTC를 검출하는 이 새로운 시스템의 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양 중 하나이며 2018 년 전 세계적으로 약 184,800 명의 사망자가발생했습니다 1. 다중 연구는 난소암 진행 (즉, 전이)과CTCs2,3,4의존재 사이의 상관 관계를 보여주었습니다. CTC의 검출 및 격리를 위한 가장 일반적인 방법은 EpCam 수용체5를표적으로 하는 셀서치 시스템을 이용합니다. EpCam 발현은, 그러나, 암 전이6에서 연루된 중간엽 전이에 상피에서 하향조절된다. 진보에도 불구하고, 현재의 임상 기술은 여전히 낮은 정확도, 높은 비용 및 복잡성으로 고통받고 있습니다. 이러한 단점으로 인해 난소 CTC의 발견 및 열거를 위한 새로운 기술이 연구의 중요한 영역이 되었습니다.
최근, PAFC는 암세포의 비침습적 검출, 나노물질의 분석 및 박테리아의 식별을 위한 효과적인 방법으로 나타났다7,8,9. PAFC는 광음향을 활용하여 유동 분석액을 검출하여 기존의 형광 유동 세포측정과 다릅니다. 광음향 효과는 레이저 빛이 열탄성 팽창을 일으키는 물질에 의해 흡수될 때 생성되며, 초음파 트랜스듀서10,11에의해 검출될 수 있는 음향파를 생성한다. 전통적인 유량 세포 분석 방법에 비해 PAFC의 장점은 단순성, 임상 설정으로의 번역 용이성 및 환자 샘플12,13에서전례없는 깊이에서 CTC의 검출을 포함한다. 최근 연구는 내인성 및 외인성대조14,15를사용하여 세포의 검출을 위한 PAFC 시스템을 활용하고 있다. 근적외선(NIR) 광흡수 조영제 예컨대 인도시아닌 녹색 염료, 및 금속 NPs(예를 들어, 금 및 CuS)는 광음향 이미징16,17,18과함께 세포 및 조직의 선택적 라벨링에 사용되어 왔다. 생물학적 조직 내에서 NIR 광의 침투 깊이가 개선되어 흡수제의 광음향 검출이 임상 응용을 위해 더 깊은 곳에서 수행될 수 있습니다. 클리닉에서 사용할 수 있는 잠재력이 뛰어나기 때문에 표적 NIR 조영제와 PAFC의 조합은 CTC 검출에 상당한 관심을 불러일으켰습니다.
표적 조영제와 함께 PAFC는 CTC의 향상된 정확도 및 표적 검출을 통해 환자 샘플의 높은 처리량 분석을 위한 향상된 접근 방식을 제공합니다. CTC를 위한 주요 검출 전략의 한개인은 관심 있는 세포에 존재하는 막 단백질의 특정 표적화이다. 난소 CTC의 한 가지 주목할만한 특징은 외부 막19에위치한 엽산 수용체의 과발현입니다. 엽산 수용체 표적화는 엽산 수용체의 발현이 더 높은 내인성 세포가 일반적으로 발광이고 혈류량20에제한된 노출을 가지고 있기 때문에 혈액에서 난소 CTC의 식별을위한 이상적인 전략이다. 구리 황화물 NPs(CuS NPs)는 최근암세포(21)에발현된 엽산 수용체를 표적으로 하는 능력으로 인정받고 있다. 생체 적합성, 합성 용이성 및 NIR 깊숙이 흡수되는 이 NP 조영제는 PAFC를 활용한 난소 CTC 검출을 위한 이상적인 표적화 전략을 수립합니다.
이 작품은 광음향 흐름 시스템에서 난소 암 세포의 검출을 위한 FA-CuS NPs의 제조 및 그들의 사용을 기술합니다. CuS NPs는 엽산으로 변형되어 난소 CTC를 구체적으로 표적으로 하고 1,053 nm 레이저로 자극될 때 광음향 신호를 방출합니다. 결과는 PAFC 시스템 내의 이러한 광음향 조영제로 배양된 난소암세포의 성공적인 검출을 나타낸다. 이러한 결과는 난소암세포의 검출을 1세포/μL의 농도까지, 및 형광 현미경검사법은 SKOV-3난소암세포(22)에의한 이들 입자의 성공적인 섭취를 확인시켜 준다. 이 작품은 FA-CuS NPs 합성, 형광 현미경 검사법 시료 의 준비, 광음향 흐름 시스템의 구성 및 난소 암 세포의 광음향 검출에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 제시된 방법은 FA-CuS NPs를 이용한 유동에서 난소 CTC의 성공적인 식별을 보여줍니다.
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Protocol
1. 나노 입자 합성 및 기능화
참고: FA-CuS NPs의 합성은 이전에 게시된프로토콜(21)으로부터적응된 하나의 냄비 합성 방법을 사용하여 달성된다.
주의: 모든 합성은 환기 화학 연기 후드에서 발생해야합니다.
- 합성에 앞서, 0.2 μm 멸균 필터를 통해 약 300 mL의 탈이온화(DI) 물을 걸러낸다.
- 250 mL 유리 둥근 바닥 플라스크를 세제 용액으로 청소하고 DI 물로 헹구세요. CuCl2 0.0134 g을 DI 물 100 mL에 추가하여 1 mM 솔루션을 만듭니다.
- 0.015 g의 엽산(FA)을 CuCl2 용액에 넣고 자기 교반 막대를 사용하여 ~5분 간 저어줍니다.
- Na2S·9H2O(100 μL DI 물에서 0.024 g)를 200 μL 파이펫을 활용한 반응 혼합물에 약 10s이상 첨가한다.
참고 :Na2S·9H2O를 추가하면 용액이 밝은 노란색에서 어두운 갈색으로 변합니다. - 반응을 캡하고 오일 욕조에 놓고 90°C로 설정하고, 마그네틱 교반 막대로 계속 저어줍니다. 약 15분 후, 또는 오일 배스가 85-90°C에 도달하면, 반응이 추가 시간 동안 진행되도록 한다. 혼합물은 점차 적으로 진한 녹색으로 바뀝니다.
참고: 압력 축적을 피하기 위해 반응 혼합물을 가열하는 동안 시스템을 환기하십시오. - 오일 욕조에서 반응 용기를 제거하고 얼음 욕조로 옮기기 전에 실온에서 약 10-15 분 동안 잠시 식힙니다.
- 반응 혼합물이 20°C 이하로 냉각되면, 1M NaOH를 활용하여 pH를 10으로 조정하여 나머지 엽산을 용액으로 용해시다.
- 30 kDa 원심분리 컬럼을 사용하여 FA-CuS 반응 혼합물을 정제한다. 15mL 배치로 용액을 컬럼과 원심분리기에 15분 동안 3,082 x g으로 추가합니다.
- 모든 반응 혼합물이 농축되면, 농축된 분획을 재결합하고 30 kDa 원심분리 컬럼에서 15 mL의 pH 10 NaOH로 4x를 세척한다.
- 질량 측정의 경우 용액의 1/3(~66 μL)을 3개의 유리 바이알로 나눕니다. ~ 27 mmHg의 진공 하에서 40 °C에서 밤새 진공 오븐에서 건조.
- 농축 용액의 나머지 2/3을 250 μL의 PBS에 녹이고 추가 사용이 될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
- FA-CuS NP를 활용하기 전에 높은 설정에서 목욕 초음파 처리기에서 30 분 동안 초음파 처리하십시오.
2. NP 특성화
- 동적 광 산란(DLS) 단계 1.1.14에서 2 mL의 DI 물에서 PBS 용액에 농축 된 FA-CuS NPS10 μL을 추가하십시오. DLS에 의한 특성화에 앞서, 높은 설정에서 목욕 초음파 처리기에서 30분 동안 입자를 초음파 처리하고 0.2 μm 멸균 필터를 통해 필터를 사용하여 잔류 먼지를 제거합니다.
- 투과 전자 현미경 검사법(TEM) 수행 : PBS 용액에 농축 된 FA-CuS NPS 10 μL을 왁스 페이퍼 에 추가하십시오. 액적의 상단에 formvar 코팅 구리 그리드를 반전하고 2 분 동안 앉아 보자. 공기가 건조하게 하십시오. 80 kV의 가속 전압에서 전자 현미경을 사용하는 구리 그리드를 이미지화합니다.
참고: FA-CuS NPS 특성화의 일반적인 결과는 그림 1에표시됩니다.
3. 세포 배양
- 이 프로토콜은 SKOV-3 세포를 활용합니다. 달리 언급되지 않는 한, 맥코이의 5A 배지에서 배양 SKOV-3 세포는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충하고, 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 유지한다.
4. 현미경 검사법에 대한 FA-CuS NPS의 형광 태그
- 텍사스-레드-X 수치니미딜 에스테르(10 mg/mL의 농도로 DMSO에 용해된 0.2 mg)를 0.1 MM NaHCO 3(pH~9) 완충액에 FA-CuS NPs 2 mg을 함유하는 용액에 첨가합니다.
- 자기 교반 막대를 사용하여 반응 혼합물을 실온에서 빛으로부터 1 시간 동안 저어줍니다.
- 반응 혼합물을 4 mL 30 kDa MWCO 원심분리 컬럼에 10분 동안 4,000 x g으로 회전시켜 농축한다.
- 농축액을 원심분리컬에서 0.1 M NaHCO3 완충액(pH~9)의 4 mL로 3x 세척한다. 이어서, 4 mL의 DI 물 3x로 농축 된 용액을 세척하거나 UV-VIS에 의해 유동에서 미량의 형광만 볼 때까지.
5. 난소 암세포에 의한 FA-CuS NPS 섭취량
- FA-CuS NPs로 배양하기 전에, 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토미신을 가진 8-15 mL의 엽산 없는 RPMI-1640 매체를 가진 T75 플라스크에 SKOV-3 세포를 배양합니다 적어도 24 시간 동안.
- 0.5 mL의 엽산 없는 RPMI-1640의 종자 세포는 0.1 x 106 세포/mL의 밀도에서 완전한 성장 매체를 24웰 플레이트에 넣습니다.
- 다음 날, 엽산이 없는 RPMI-1640의 0.5 mL에 400 μg/mL FA-CuS NPS로 세포를 배양하여 2시간 동안 완전한 성장 매체를 배양하였다.
- 이 배양 에 따라, 0.5 mL의 0.25% 트립신EDTA와 세포를 트립시니화. 트립신을 중화시키기 위해 엽산이 없는 RPMI-1640 완전 성장 매체를 1 mL 이상 추가하고, 세포를 6분 동안 123 x g으로 원심분리합니다.
- 상류를 제거하고, PBS의 2 mL에서 세포를 다시 중단하고, 원심 분리기를 123 x g에서 6 분 동안 수행하십시오.
- 2% 트웬 용액으로 PBS의 1-2 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 혈세포계와 트라이판 블루를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 수가 너무 높으면 세포를 추가로 희석하십시오. 검출을 위해 선택된 농도로 2% 트웬으로 PBS에서 세포를 희석한다.
- 이제 세포는 PAFC 시스템에 의해 분석될 준비가 되었습니다.
6. FA-CuS NPS 섭취량의 형광 현미경 검사법
- 5.1단계에 나열된 단계를 반복하고 현미경 검사법에 대한 아래 의정서를 진행하십시오.
- 종자 세포는 0.5 mL의 엽산프리 RPMI-1640의 밀도에서 24개의 웰 플레이트내의 유리 커버슬립에 완전한 성장 매체를 갖는다.
- 다음 날, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL의 농도로 플릭-산 프리 RPMI-1640 완전 성장 매체에서 형광 태그가 붙은 FA-CuS NPs로 세포를 배양합니다.
- 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 NPs로 세포를 배양
- 이 잠복기 다음, PBS로 세포를 3배 세척하십시오.
참고 : 모든 세척 단계의 경우, 조심스럽게 세포를 방해하지 않도록 웰 플레이트의 측면에 용액을 추가합니다. 추가 후, 조심스럽게 플레이트를 기울이고 우물의 측면에서 용액을 철회하십시오. - 0.5 mL의 3.7% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 PBS에서 15분 동안 배양하고 유리 커버슬립을 새로운 24웰 플레이트로 옮김을 전달한다.
주의: PFA는 알려진 발암 물질입니다. 통풍이 잘되는 화학 연기 후드에 모든 고정을 하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 3.7% PFA의 용액으로 세포를 PBS에서 0.1% 트리톤-X로 5분 동안 배양합니다.
- 0.5 mL의 PBS 3x로 세포를 각각 5 분 동안 씻고 커버 슬립을 새 접시로 옮김하십시오.
- DAPI를 함유하는 PBS 용액의 0.5 mL로 세포를 배양 (0.5 mg/mL 스톡 용액의 20 μL/mL은 염색에 사용된다)을 빛으로부터 5분 동안 배양합니다.
- PBS 3x로 세포를 씻으소서.
- 최종 PBS 세척 후, 장착 매체와 슬라이드에 커버 립을 장착합니다.
- 세포는 지금 형광 현미경 검사법에 의해 심상될 준비가 되었습니다. 도 2는 형광 현미경검사법에 의한 전형적인 세포 특성화의 예를 나타낸다.
7. 흐름 시스템 아키텍처
- 유량 챔버 시공
참고: 3D 인쇄 유동 탱크의 SolidWorks 파일은 보충 재질에서찾을 수 있습니다.- 제공된 SolidWorks 파일을 사용하여 ABS 열가소성 플라스틱 또는 PLA 플라스틱을 사용하여 유동 탱크를 3D 인쇄합니다. 솔리드웍스를 사용할 수 없는 경우 치수가 아래에 제공됩니다. 그림 3A는 이 모델의 표현을 보여줍니다. 유동 탱크의 본체는 2.5 cm x 1.5 cm x 7.5 cm입니다. 유동 탱크의 먼 끝은 모세관을 포함하는 튜브의 진입을 허용하기 위해 직경 약 5mm의 구멍을 포함한다.
참고 : 유동 탱크에는 초음파 트랜스듀서의 배치를 위해 모세관의 방향에 수직인 1cm 구멍이 있습니다. 구멍이 탱크로 6mm 연장되는 것과 동일한 내경을 가진 원통형 압출. 실시간 이미징을 위해 유동 탱크는 모세관 바로 아래에 1mm x 3mm 슬롯을 가지고 있습니다. - 3D 유동 탱크를 인쇄한 후 시스템을 청소하고 조립하여 사용할 수 있습니다.
- 유리 커버슬립을 1mm x 3mm 슬롯 위에 놓고 플로우 시스템의 1cm 구멍에 놓습니다.
- 누출을 방지하기 위해 실리콘으로 조심스럽게 밀봉하십시오.
- 모세관을 실리콘 경화 튜브에 맞춥습니다. 유리 모세관이 3mm 슬롯과 1cm 구멍 의 바로 위와 앞에 있도록 유동 탱크의 측면을 통해 튜브를 유동 챔버에 삽입합니다.
- 누출을 방지하기 위해 실리콘을 사용하여 튜브를 밀봉하십시오.
- 제공된 SolidWorks 파일을 사용하여 ABS 열가소성 플라스틱 또는 PLA 플라스틱을 사용하여 유동 탱크를 3D 인쇄합니다. 솔리드웍스를 사용할 수 없는 경우 치수가 아래에 제공됩니다. 그림 3A는 이 모델의 표현을 보여줍니다. 유동 탱크의 본체는 2.5 cm x 1.5 cm x 7.5 cm입니다. 유동 탱크의 먼 끝은 모세관을 포함하는 튜브의 진입을 허용하기 위해 직경 약 5mm의 구멍을 포함한다.
- 광음향 유동 시스템 설정
참고: 그림 3B 및 그림 3C는 흐름 시스템 아키텍처의 예를 보여줍니다.- 트랜스듀서를 초음파 펄스/수신기에 연결합니다. 59dB 게인으로 신호를 증폭합니다.
- 필터출력을 내장된 현장 프로그래밍 가능한 게이트 어레이가 장착된 다목적 재구성 가능한 오실로스코프에 연결합니다.
- 각 지점에서 두 개의 주사기 펌프에 연결된 유량 챔버에서 나오는 튜브 중 하나를 T 접합부에 연결합니다.
- 주사기 펌프 중 하나를 공기로 채우고 다른 펌프를 분석할 샘플로 채웁니다. 공기가 포함된 펌프를 40 μL/min의 유량으로 설정하고 시료를 함유하는 펌프를 20 μL/min의 유량으로 설정합니다. 생성된 2상 흐름은 1 μL의 샘플 체적을 생성합니다. 이 유량에서 시스템은 분당 약 6.4개의 샘플을 테스트합니다.
참고: 세포의 일관된 분포를 유지하기 위해 테스트 직전에 각 샘플을 가볍게 소용돌이치세요. 또한, 세포가 용액에 침전되는 것을 방지하기 위해 몇 분마다 주사기를 회전시다. - 유량 시스템을 빠져나가는 나머지 튜브를 10% 표백제가 있는 용기에 연결하여 유동 시스템을 종료한 후 세포를 폐기합니다.
참고: 유량 시스템을 활용하기 전에 흐름에 영향을 줄 수 있기 때문에 누수 여부를 확인하십시오. 시술 중 생물학적 안전성을 유지하기 위해 폐쇄된 시스템 내에 세포를 포함해야 합니다. - 3D 프린팅 탱크의 설계로 트랜스듀서와 레이저 라이트 간의 일관되고 반복 가능한 정렬이 최소화됩니다. 사용자 정의 탱크 내에 올바르게 배치하면 석영 모세관이 트랜스듀서와 레이저를 직접 정렬할 수 있습니다.
- 석영 모세관의 단면을 트랜스듀서와 직접 정렬하여 현미경의 시야에서 시료 위에 광섬유를 신중하게 배치하여 튜브의 전체 폭을 비춥니다.
- 1,053 nm의 파장에서 작동하는 다이오드 펌핑 솔리드 스테이트 레이저를 채널링하는 광섬유를 사용하여 샘플을 조사합니다. 광음향 효과를 측정하는 데 사용되는 샘플 및 트랜스듀서의 레이저 광 입사는 모두 초점이 맞지 않습니다.
- 샘플에 대한 레이저 입사의 에너지는 약 8 mJ이며 10 Hz 레이저 속도는 시스템을 통과할 때 각 샘플을 여러 번 비추기에 충분합니다.
- 유량 시스템을 반전된 현미경 위에 놓고 시료가 유동 시스템을 통과할 때 레이저 펄스와 시료 경로가 모두 표시되도록 합니다. 현미경 장착 카메라를 사용하여 흐름을 기록합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어를 활용하여 초음파 수집을 기록합니다(재료 표참조). FPGA를 사용하여 초음파 및 펄스 레이저를 트리거합니다. PBS 2% 트웬에서 100 μg/mL의 농도에서 2% 트웬트와 FA-CuS IP를 각각 음수 및 양성 대조군으로 활용한다.
- 현미경 장착 카메라를 활용하여 레이저 의 발사와 시료의 통과를 모두 유동 시스템을 통해 기록합니다. 이러한 기록은 트랜스듀서에 의해 기록된 음향 신호와 레이저의 발사를 상관시키는 데 활용될 것이다. 샘플이 레이저 발사 앞에 통과하면 신호를 분석을 위해 생성된 광음향 신호와 상관관계가 있을 수 있습니다. 10Hz의 샘플링 속도로 레이저는 각 플러그를 여러 번 비춥시됩니다.
8. 사후 처리
- 각 신호 수집에 대해 s(t)는 분석 신호를 생성하기 위해 힐베르트 변환 H[s(t)]를 계산합니다.
- 복잡한 봉투,se(t)를생성하고, 분석 신호의 크기를 계산하여, 봉투를
통합하여 각 획득으로부터 발생하는 총 신호를 측정한다. R 통계 소프트웨어에서 t-검정을 활용하여 각 테스트 그룹(즉, PBS, 태그가 지정된 세포, FA-CuS NPs, 셀 단독)의 신호를 비교한다. 원시 광음향 신호와 힐베르트 변환은 그림 4에표시됩니다. - 이미지 재구성의 경우 전체 실행의 최대 피크를 기준으로 복잡한 봉투를 정규화합니다. 일련의 실행을 비교하는 경우 전체 계열의 최대 피크를 사용하여 복잡한 봉투를 정규화합니다. 정규화 후 각 수집을 일련의 픽셀 값으로 변환합니다. 각 픽셀 값 시리즈를 이미지 재구성의 열로 나타냅니다. PBS및 FA-CuS NPs 신호의 대표적인 재구성은 그림 5에표시되며, 여기서 두 이미지는 두 실행에서 최대 피크를 사용하여 정규화되었습니다.
통합하여 각 획득으로부터 발생하는 총 신호를 측정한다. R 통계 소프트웨어에서 t-검정을 활용하여 각 테스트 그룹(즉, PBS, 태그가 지정된 세포, FA-CuS NPs, 셀 단독)의 신호를 비교한다. 원시 광음향 신호와 힐베르트 변환은 그림 4에표시됩니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1A는 합성된 나노입자의 전형적인 TEM 이미지를 나타낸다. 전형적인 나노입자의 평균 크기는 약 8.6 nm±2.5 nm이다. 나노입자 측정은 ImageJ에서 수행되었다. 측정을 위해 입자를 분리하기 위해 임계값 및 유역 함수를 적용했습니다. 각 입자의 수평 및 수직 직경은 서로 수직으로 측정되고 더 평균화되었습니다. DLS의 경우 대표적인 측정값이 그림 1B에나와 있습니다. 이 입자에 대한 평균 유체 역학 직경은 73.6 nm입니다. 구리 황화물 나노 입자는 그림 1C와같이 NIR로 확장되는 특성 흡광도 곡선을 갖는다. 분광광도계에 의해 레이저의 전환에 의해 발생 된 약 850 nm의 약간의 유물이있다.
형광 태그나노입자로 배양된 세포의 형광 현미경 이미지는 도 2에서확인할 수 있다. 나노 입자 섭취 는 세포에 걸쳐 형광의 존재에 의해 시각화 될 수 있다. 나노 입자로 배양되지 않은 세포는 형광 신호를 나타내지 않습니다. 이 형광 신호의 존재는 입자의 성공적인 섭취와 유동 시스템에서 검출되는 능력을 나타냅니다.
도 3은 광음향 유동 시스템의 일반적인 설정을 나타낸다. 도 3A는 3D 유동 챔버의 상세 모델을 나타낸다. 이 챔버는 이 프로토콜과 함께 제공되는 .stl 파일을 사용하여 인쇄할 수 있습니다. 그림 3B는 유동 탱크 설정에 대한 개요를 보여줍니다. 도 3C는 유동 탱크 및 데이터 수집 시스템의 일반적인 설정을 나타낸다.
일반적인 데이터 수집 신호는 그림 4에나와 있습니다. 원시 데이터는 나노입자 태그가 지정된 셀, PBS 및 FA-CuS PS 간의 신호 차이를 나타냅니다. 수집은 단일 레이저 펄스에서 생성된 광음향 신호입니다. 레이저의 빠른 발사 속도로 인해 분석된 각 샘플은 여러 개의 수집을 생성합니다. 힐베르트 변환을 사용하여 각 개별 획득에 대한 봉투가 생성되었습니다. 이 봉투는 레이저 펄스로부터 생성된 신호의 총량을 측정하기 위해 통합되었다. 이전 연구에서, 이들 데이터는 R 통계 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 여기서 t-검정을 위해 분석된 획득수는 203, 150, 160 및 131, NPs, 단독, 세포 단독, PBS 및 NPs를 가진 세포에 대해 각각22개였다. 데이터는 로그 변환을 통해 정규화되었으며 R에서 Welch의 t-test를 사용하여 비교했습니다. 100 μg/mL의 농도에서만 FA-CuS NPs에서 생성된 신호는 음성 대조군보다 훨씬 더 높은 신호를 보였다. 음성 대조군과 태그가 지정된 난소 CTC 사이의 신호의 차이는 양성 대조군보다 더 미묘했지만 t-test22에의한 그들의 수단의 분석을 통해 검출될 수 있었다.
사용자 지정 LabView 및 MATLAB 소프트웨어를 활용하여 이미지 재구성은 각각 실시간 및 사후 수집에서 긍정 및 부정 제어로 이루어졌습니다. 광음향 재구성을 생성하기 위해 힐베르트 변환을 사용하여 각 인수의 봉투를 계산했습니다. 이후 개별 봉투가 픽셀 값으로 변환되어 독립열로 표시되었습니다. 광음향 신호의 명확한 차이는 100 μg/mL의 농도에서 FA-CuS NPs와 PBS 샘플 사이에 발생합니다(그림5). 시스템이 트랜스듀서에 의해 감지될 수 있는 광음향 신호를 적절히 생성하고 있는지 확인하기 위해 시스템에 대한 제어를 실행하는 것이 중요합니다.
그림 1: 대표 NP 특성화. (A)합성 된 FA-CuS NPs의 TEM 이미지. 스케일 바 = 50 nm. (B)대표적인 DLS 강도 분포의 합성 FA-CuS NPs(C)대표적인 FA-CuS NPs 흡광도 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: SKOV-3 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지. 세포를 400 μg/mL형형 으로 태그가 붙은 NPs와 함께 또는 없이 배양하였다.
그림 3: 광음향 유동 세포 분석 시스템 및 유량 챔버의 대표적인 이미지. (A)3D 프린팅 플로우 챔버의 상세 보기. (B)PAFC 시스템의 다이어그램. (C)유동 시스템 아키텍처: SP = 주사기 펌프; DAQ/FPGA = 데이터 수집/필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이; Ob = 대물 렌즈; OF = 광섬유; FC= 섬유 커플러; UT = 초음파 트랜스듀서; FT = 유동 탱크. 이 수치는 Lusk 외22에서적응됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유량 시스템에서 테스트된 샘플의 대표적인 원시 데이터 신호 및 힐베르트 변환. (a)PBS 및 세포로부터의 대표적인 원시 데이터 신호는 NP와(D)힐베르트 형형혈으로 배양된 데이터의 것이다. (b)대표적인 원시 데이터 신호는 단독으로 세포로부터의 FA-CuS NPs 및(E)힐베르트 형형혈으로 배양된 세포로부터의 데이터를 한다. (C)PBS 및 100 μg/mL FA-CuS PS 및(F)힐베르트 데이터의 대표적인 원시 데이터 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 광음향 데이터의 대표적인 광음향 이미지 재구성. (A)100 μg/mL FA-CuS NPs 및(B)PBS의 이미지 재구성은 유량 시스템 내에서 테스트하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 흐름 챔버 STL. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
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Discussion
이 프로토콜은 PAFC 및 표적 CuS 조영제를 활용하는 난소 CTC의 검출을 위한 간단한 방법이다. 미세유체 장치, RT-PCR 및 형광 유동세포측정법 23,24,25를포함하는 난소 CTC의 검출을 위한 많은 방법이 탐구되었다. 이러한 복잡성, 비용 및 정확도범위는 임상 환경에서의 효율성을 제한합니다. PAFC는 환자 샘플 내에서 CTC를 검출하는 기능 및 생체 내 응용 프로그램으로의 번역 용이성을 포함하여 CTC 검출을 위한 이러한 전통적인 방법에 비해 몇 가지 이점을 소개합니다. PAFC는 또한 표적조영제(26,27)와결합될 때 생체외 및 생체내 CTC를 정확하게 검출하는 것으로 나타났다.
이 작품에서, FA-CuS NP 조영제는 생리학적으로 관련된 농도에서 CTC 검출의 정확도를 향상시키는 능력에 대해 평가되었다. 연구는 PBS에서 재중단된 단리된 SKOV-3 세포를 사용하여 수행하였다. 형광 현미경 검사법에 의하여 분석은 이 입자의 성공적인 장악을 표시했습니다. 결과는 1 세포 /μL22의농도로 아래로 SKOV-3 세포를 검출했습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 나노 입자 합성 및 광음향 흐름 설정의 정렬을 포함한다. 나노 입자 합성 중에 오일 욕조에서 혼합물을 제거하기 전에 용액이 진한 녹색으로 변했는지 확인하는 것이 중요합니다. 유량 시스템의 경우, 샘플 테스트 전에 시스템이 표지된 셀의 후속 검출을 위해 적절한 광음향 신호를 생성하고 있는지 확인하기 위해 시스템이 필요하지만 음의 양수 제어를 실행합니다. 유량 시스템을 실행하는 동안 광섬유의 입사광이 모세관을 완전히 비추고 트랜스듀서가 유동 챔버의 측면에 잘 맞도록 하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 시스템의 생물학적 안전성을 보장하고 챔버를 통한 일관된 흐름을 위해서는 누출에 대한 시스템의 엄격한 테스트가 필요합니다.
현재 의 PAFC 시스템의 경우, 예비 연구는 트랜스듀서 및 증폭 시스템을 사용하여 광음향 검출을 확인했다. 이러한 신호의 대부분은 낮은 주파수 신호(&20 MHz)로 구성되었습니다. 이 증폭기의 생성 된 광 음향 신호 또는 35 MHz 대역폭의 실제 주파수 때문인지 여부를 확인하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 향후 연구는 증폭 시스템의 대역폭뿐만 아니라 트랜스듀서의 중앙 주파수를 최적화하기 위해 검출된 신호의 주파수 성분을 조사할 것입니다. 현재 시스템은 특히 CTC의 생체 내 검출에 적합합니다. 그러나 이 방법은 FA-CuS NPs를 생체 내에서 향후 적용할 가능성을 식별합니다.
향후 연구는 혼합 배양, 인간 임상 샘플 및 생체내 모델28,29,30내에서 난소암 세포를 검출하는 것을 목표로 한다. 더욱이, 미래 연구는 비표적 대조군 대 이들 나노입자의 특이성을 조사할 것이다. 이 방법의 향후 검증에는 인간 임상 샘플로 이 도구를 테스트하고, 높은 처리량 테스트 및 분석을 구현하고, 임상 설정으로 변환하는 것이 포함됩니다. 이 광음향 기술은 다양한 조영제 및 세포체에 걸친 다양한 임상 응용 분야 및 질병으로 향후 번역할 수 있는 가능성을 보여줍니다. PAFC를 활용한 세포체의 광음향 검출은 CTC 및 기타 병원균의 요점 검출을 보다 신속하고 저렴하게 만들 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 합성에 대한 그녀의 도움마들렌 하웰을 인정하고 싶습니다, 흐름 시스템을 설계하는 그의 도움 매튜 가슴, 솔리드 웍스에 대한 도움에 대한 에단 마샬.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
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