Summary
En protokoll er presentert for å oppdage sirkulerende eggstokkene tumorceller benytter en skreddersydd photoacoustic Flow system og målrettede folsyre-avkortet kobber sulfid nanopartikler.
Abstract
Mange studier tyder på at opplisting av sirkulerende tumorceller (CTC) kan vise løftet som et Prognostisk verktøy for eggstokkene kreft. Gjeldende strategier for påvisning av CTC inkluderer Flow flowcytometri, mikrovæskebasert enheter, og sanntids polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR). Til tross for nylige fremskritt, metoder for påvisning av tidlig eggstokkene kreft metastasering fortsatt mangler følsomhet og spesifisitet som kreves for klinisk oversettelse. Her er en ny metode presentert for påvisning av eggstokkene sirkulerende tumorceller ved photoacoustic Flow flowcytometri (PAFC) bruker en tilpasset tredimensjonal (3D) trykt system, inkludert en Flow kammer og sprøyte pumpen. Denne metoden utnytter folsyre-avkortet kobber sulfid nanopartikler (FA-CuS NPs) til målet SKOV-3 eggstokkene kreftceller ved PAFC. Dette arbeidet demonstrerer affinitet av disse kontrast agentene for eggstokkene kreftceller. Resultatene viser NP karakterisering, PAFC deteksjon, og NP opptak av fluorescens mikroskopi, og dermed demonstrere potensialet i denne romanen system for å oppdage eggstokkene CTC på fysiologisk relevante konsentrasjoner.
Introduction
Kreft i eggstokkene er en av de farligste gynekologisk ondartede og resulterte i anslagsvis 184 800 dødsfall over hele verden i 20181. Flere studier har vist sammenhengen mellom kreft progresjon for eggstokkene (dvs. metastasering) og tilstedeværelsen av CTC2,3,4. Den vanligste metoden for deteksjon og isolering av CTC utnytter Cellsearch systemet, som er rettet mot EpCam reseptoren5. EpCam uttrykk er imidlertid downregulated i epitel til mesenchymal overgang, som har vært innblandet i kreft metastasering6. Til tross for fremskritt, dagens kliniske teknologier fortsatt lider av lav nøyaktighet, høye kostnader og kompleksitet. På grunn av disse ulempene, nye teknologier for oppdagelsen og opplisting av eggstokkene CTC har blitt et viktig område for forskning.
Nylig dukket PAFC som en effektiv metode for de ikke-invasiv påvisning av kreftceller, analyse av nanomaterialer, og identifisering av bakterier7,8,9. PAFC skiller seg fra tradisjonelle fluorescens Flow flowcytometri ved å oppdage analytter i flyt ved å utnytte photoacoustics. Photoacoustic-effekten genereres når laser lyset absorberes av et materiale som forårsaker thermoelastic ekspansjon, og produserer en akustisk bølge som kan oppdages av en ultralyd svinger10,11. Fordeler med PAFC over tradisjonelle flyt flowcytometri metoder inkluderer enkelhet, enkel oversettelse til kliniske innstillinger, og påvisning av CTC på enestående dybder i pasientprøver12,13. Nyere studier har benyttet PAFC systemer for påvisning av celler ved hjelp av endogene og eksogene kontrast14,15. Nær infrarød (NIR) lett absorberende kontrastmidler som indocyanine Green Dye, og metall NPs (f. eks gull og CuS) har blitt brukt for selektiv merking av celler og vev i kombinasjon med photoacoustic Imaging16,17,18. På grunn av den forbedrede gjennomtrengning dybden av NIR lys innen biologisk vev, photoacoustic deteksjon av dempere kan utføres på større dybder for kliniske anvendelser. På grunn av sitt store potensial for bruk i klinikken, har kombinasjonen av målrettede NIR kontrast agenter med PAFC generert betydelig interesse for påvisning av CTC.
PAFC i kombinasjon med målrettede kontrastmidler gir en forbedret tilnærming for analyse av pasientprøver med høy gjennomstrømming, med forbedret nøyaktighet og målrettet påvisning av CTC. En av de viktigste oppdagelsen strategier for CTC er den spesifikke målretting av membran proteiner til stede på cellen av interesse. En bemerkelsesverdig karakteristisk for eggstokkene CTC er overuttrykte av folat-reseptorer som ligger på deres ytre membran19. Folat reseptor målretting er en ideell strategi for identifisering av eggstokkene CTC i blodet fordi endogene celler, som har høyere uttrykk for folsyre reseptorer, er generelt luminal og har begrenset eksponering for blodet20. Kobber sulfid NPs (CuS NPs) har nylig blitt anerkjent for deres evne til å målrette folat-reseptorer uttrykt på kreftceller21. Kombinert med deres biokompatibilitet, enkel syntese, og absorpsjon dypt i NIR, disse NP kontrast agentene gjør en ideell målretting strategi for påvisning av eggstokkene CTC utnytte PAFC.
Dette arbeidet beskriver utarbeidelse av FA-CuS NPs og deres bruk for påvisning av eggstokkene kreftceller i et photoacoustic Flow system. CuS NPs er modifisert med folsyre å spesifikt målrette eggstokkene CTC og avgir et photoacoustic signal når stimulert med en 1 053 NM laser. Resultatene indikerer vellykket påvisning av eggstokkene kreftceller inkubert med disse photoacoustic kontrastmidler innenfor PAFC systemet. Disse resultatene viser deteksjon av kreftceller for eggstokkene ned til konsentrasjoner av 1 celle/μL, og fluorescens mikroskopi bekrefter vellykket opptak av disse partiklene ved SKOV-3 eggstokkene kreftceller22. Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av FA-CuS NPs syntese, utarbeidelse av prøver for fluorescens mikroskopi, bygging av photoacoustic Flow system, og photoacoustic deteksjon av eggstokkene kreftceller. Den presenterte metoden viser vellykket identifisering av eggstokkene CTC i flyt utnytte FA-CuS NPs. Future arbeid vil fokusere på klinisk anvendelse av denne teknologien mot tidlig påvisning av eggstokkene kreft metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nanopartikkel syntese og Funksjonalisering
Merk: syntese av FA-CuS NPs oppnås ved hjelp av en pott syntese metode som er tilpasset fra en tidligere publisert protokoll21.
FORSIKTIG: alle syntese skal forekomme i en ventilert kjemisk avtrekks hette.
- Før syntese, filter ca 300 mL deionisert (DI) vann om et 0,2 μm sterilt filter.
- Rengjør et 250 mL glass rund bunn kolbe med et vaskemiddel og skyll med DI vann. Tilsett 0,0134 g CuCl2 i 100 ml av di vann for å lage en 1 mm løsning.
- Tilsett 0,015 g av folsyre (FA) til CuCl2 -løsningen og rør i ~ 5 min ved hjelp av en magnetisk røre bar.
- Legg na2S · 9h2O (0,024 g i 100 μL di vann) over ca. 10 S til reaksjonsblandingen ved bruk av en 200 μL pipette.
Merk: ved tillegg av na2S · 9h2O, vil løsningen endre farge fra en lys gul til en mørk brun. - Cap reaksjonen og plasser i et oljebad, satt til 90 ° c, og fortsette omrøring med en magnetisk rør bar. Etter ca. 15 minutter, eller når olje badet har nådd 85 − 90 ° c, la reaksjonen fortsette i en ekstra time. Din blanding bør gradvis slå til en mørk grønn farge.
Merk: Sørg for å lufte systemet mens du varmer opp reaksjonsblandingen for å unngå trykkoppbygging. - Fjern reaksjons fartøyet fra olje badet og kort kjølig ved romtemperatur i ca 10 til 15 min før du overfører til et is bad.
- Når reaksjonsblandingen er avkjølt under 20 ° c, justerer du pH-verdien til 10 ved å bruke 1M NaOH for å oppløse den resterende folsyre i løsningen.
- Rens-reaksjonsblandingen i FA-CuS ved hjelp av en 30 kDa sentrifugering-kolonne. Legg til løsning i 15 mL batcher til kolonnen og sentrifuger på 3 082 x g i 15 min.
- Når alle reaksjonsblandingen er konsentrert, recombine de konsentrerte fraksjonene og vasker 4X med 15 mL pH 10 NaOH i sentrifugering-kolonnen på 30 kDa.
- For masse målinger tar du 1/3 av oppløsningen (~ 66 μL) og deles inn i tre hetteglass. Tørk i en vakuum ovn over natten ved 40 ° c under et vakuum på ~ 27 mmHg.
- Løs opp den andre 2/3 med konsentrert oppløsning til 250 μL av PBS og oppbevar ved 4 ° c inntil videre bruk.
- Før utnytte FA-CuS NPs, sonikere dem i 30 min i et bad sonicator på en høy innstilling.
2. NP karakterisering
- Utføre dynamisk lysspredning (DLS) tilsett 10 μL av konsentrert FA-CuS NPS i PBS-løsning fra trinn 1.1.14 til 2 mL av DI vann. Før karakterisering av DLS, sonikere partiklene i 30 min i et bad sonicator på en høy innstilling og filter gjennom et 0,2 μm sterilt filter for å fjerne rester av støv.
- Utfør overførings elektron mikroskopi (TEM): tilsett 10 μL av konsentrert FA-CuS NPS i PBS-løsning til et stykke voks papir. Inverter en formbar belagt kobber rutenett på toppen av dråpe og la sitte i 2 min. Berør kanten av det formbar rutenettet til et stykke filter papir for å fjerne overflødig væske. La luften tørke. Image kobber risten utnytte et elektronmikroskop ved en akselererende spenning på 80 kV.
Merk: typiske resultater fra FA-CuS NPS karakterisering er presentert i figur 1.
3. Cell kultur
- Denne protokollen benytter SKOV-3 celler. Med mindre annet er angitt, kultur SKOV-3 celler i McCoy ' s 5A medium supplert med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, og 100 μg/mL Streptomycin, og opprettholde ved 37 ° c i en fuktet 5% CO2 inkubator.
4. fluorescerende merking av FA-CuS NPS for mikroskopi
- Legg til Texas-Red-X succinimidyl Ester (0,2 mg oppløst i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mg/mL) til en løsning som inneholder 2 mg FA-CuS NPs i 1 mL 0,1 M NaHCO3 (pH ~ 9) buffer.
- Rør reaksjonsblandingen ved hjelp av en magnetisk røre bar for 1 h, vekk fra lys ved romtemperatur.
- Konsentrer reaksjonsblandingen i en 4 mL 30 kDa MWCO sentrifugering kolonne ved å spinne ved 4 000 x g i 10 min.
- Vask den konsentrerte løsningen 3x med 4 mL 0,1 M NaHCO3 buffer (pH ~ 9) i en sentrifugering søyle. Deretter vaskes den konsentrerte løsningen med 4 mL DI vann 3x eller til bare en spor mengde fluorescens forblir synlig i sonore av UV-VIS.
5. FA-CuS NPS opptak av eggstokkene kreftceller
- Før inkubasjons med FA-CuS NPs, ruge SKOV-3 celler i en T75 kolbe med 8 − 15 mL av folsyre-frie RPMI-1640 medier med 10% FBS og 1% penicillin/Streptomycin i minst 24 h.
- Seed celler i 0,5 mL av folsyre-fri RPMI-1640 komplett vekst medier ved en tetthet på 0,1 x 106 celler/ml i en 24 brønn plate.
- Neste dag, ruge celler med 400 μg/mL FA-CuS NPS i 0,5 mL av folsyre-fri RPMI-1640 komplett vekst medier for 2 t.
- Etter denne inkubasjons trypsinize cellene med 0,5 mL 0,25% Trypsin med EDTA. Legg til minst 1 mL folsyre-fri RPMI-1640 komplett vekst medier for å nøytralisere Trypsin, og sentrifuger cellene ved 123 x g i 6 min.
- Fjern supernatanten, resuspend cellene i 2 mL PBS, og sentrifuger ved 123 x g i 6 min. Utfør dette vaske trinnet 2x for å fjerne ubundet NPs.
- Resuspend cellene i 1 − 2 mL PBS med 2% mellom løsning.
- Tell cellene ved hjelp av en hemocytometer og trypan blå. Videre fortynne celler hvis cellen teller er for høy. Fortynne celler i PBS med 2% mellom til den valgte konsentrasjonen for deteksjon.
- Cellene er nå klare til å bli analysert av PAFC systemet.
6. fluorescens mikroskopi av FA-CuS NPS-opptak
- Gjenta trinn oppført i trinn 5,1, og fortsett med protokollen nedenfor for mikroskopi.
- Seed celler i en tetthet på 0,1 x 106 celler/mL i 0,5 ml av folsyre-fri RPMI-1640 komplett vekst medier på glass coverslips i en 24 brønn plate.
- Dagen etter, ruge cellene med fluorescensmerkete merket FA-CuS NPs i tre eksemplarer, ved konsentrasjoner av 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, og 400 μg/mL i 0,5 mL av folsyre-fri RPMI-1640 komplett vekst Media.
- Ruge cellene med NPs for 2 t i 37 ° c inkubator
- Etter denne inkubasjonsperioden, vask cellene 3x med PBS.
Merk: for alle vasketrinn må du forsiktig legge til løsningen på siden av brønn platen for å ikke forstyrre cellene. Etter tillegg forsiktig vippe platen og trekke løsningen fra siden av brønnen. - Ruge cellene med 0,5 mL 3,7% paraformaldehyde (PFA) i PBS i 15 min og Overfør glass coverslips til en ny 24 brønn plate.
FORSIKTIG: PFA er et kjent kreftfremkallende stoff. Gjør all fiksering i en ventilert kjemisk avtrekks hette og bruk egnet personlig verneutstyr. - Ruge cellene i en løsning av 3,7% PFA med 0,1% Triton-X i PBS for 5 min.
- Vask cellene med 0,5 mL PBS 3x i 5 minutter hver, og Overfør coverslips til en ny plate.
- Ruge cellene med 0,5 mL av en PBS-løsning som inneholder DAPI (20 μL/mL av en 0,5 mg/mL lager oppløsning, brukes til farging) i 5 minutter, vekk fra lys.
- Vask cellene med PBS 3x.
- Etter den siste PBS vask, montere coverslips på lysbilder med montering medium.
- Cellene er nå klare til å bli avbildet av fluorescens mikroskopi. Figur 2 viser et eksempel på typiske celle karakterisering av fluorescens mikroskopi.
7. Flow system arkitektur
- Flow kammer konstruksjon
Merk: en SolidWorks-fil med en 3D-trykt strømnings tank finnes i tilleggsmaterialene.- Når du bruker den med følgende SolidWorks-filen, skriver 3D ut strømnings tanken med ABS-termoplastisk eller PLA-plast. Dimensjoner er gitt nedenfor hvis SolidWorks er utilgjengelig. Figur 3a viser en representasjon av denne modellen. Liket av strømnings tanken er 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Den langt endene av strømnings tanken inkluderer hull ca 5 mm i diameter for å muliggjøre oppføring av slangen som inneholder kapillærrøret.
Merk: strømnings tanken har et hull på 1 cm, vinkelrett på retningen til kapillærrøret, for plassering av ultralyd svingeren. En sylindrisk ekstrudering med samme indre diameter som hullet strekker seg 6 mm inn i tanken. For sann tids avbildning har strømnings tanken en 1 mm x 3 mm-åpning rett under kapillærrøret. - Etter å ha skrevet ut 3D Flow tank, rengjør og Monter systemet for bruk.
- Plasser glass coverslips over 1 mm x 3 mm-sporet og 1 cm-hullet i strømnings systemet.
- Forsiktig tetning med silikon for å unngå lekkasje.
- Sett kapillærrøret inn i silikon herdet rør. Sett rørene inn i strømnings kammeret selv om siden av strømnings tanken slik at glass kapillærrøret er rett over og foran 3 mm-sporet og 1 cm-hullet.
- Forsegle slangen med silikon for å unngå lekkasje.
- Når du bruker den med følgende SolidWorks-filen, skriver 3D ut strømnings tanken med ABS-termoplastisk eller PLA-plast. Dimensjoner er gitt nedenfor hvis SolidWorks er utilgjengelig. Figur 3a viser en representasjon av denne modellen. Liket av strømnings tanken er 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Den langt endene av strømnings tanken inkluderer hull ca 5 mm i diameter for å muliggjøre oppføring av slangen som inneholder kapillærrøret.
- Oppsett av Photoacoustic Flow-system
Merk: Figur 3B og Figur 3C Vis et eksempel på Flow system Architecture.- Koble svingeren til en ultralyd pulser/-mottaker. Forsterke signalet med en 59 dB gevinst.
- Koble produksjonen av filteret til et Multipurpose rekonfigurerbare oscilloskop utstyrt med en innebygd felt programmerbar gate array.
- Koble en av rørene som kommer fra strømnings kammeret til et T-kryss, koblet til to sprøyte pumper på hver gren.
- Fyll en av sprøyte pumpene med luft og den andre pumpen med prøven som skal analyseres. Still pumpen med luft til en strømningshastighet på 40 μL/min og pumpen som inneholder prøven, til en strømningshastighet på 20 μL/min. Den resulterende to-faset flyten vil produsere prøve volumer på 1 μL. På denne strømningshastighet, vil systemet teste ca 6,4 prøver per minutt.
Merk: for å opprettholde en konsekvent fordeling av celler, må du lett Vortex hver prøve umiddelbart før den testes. I tillegg roterer du sprøyten med noen få minutter for å forhindre at cellene blir avgjort i løsningen. - Koble det resterende røret som går ut av strømnings systemet til en beholder med 10% blekemiddel, for å kvitte seg med celler etter at de har gått ut av strømnings systemet.
Merk: før du bruker strømnings systemet, sjekk for lekkasjer, da disse kan påvirke flyten. Celler må finnes i et lukket system for å opprettholde biologisk sikkerhet under inngrepet. - Utformingen av 3D trykt tank gir konsistent og repeterbar justering mellom transduseren og laser lys med minimal kalibrering. Når det plasseres riktig i den egendefinerte tanken, sørger kvarts kapillærrøret for at svingeren og laseren er direkte justert.
- Plasser den delen av kvarts kapillærrøret i direkte innretting med svingeren, i synsfeltet til mikroskopet, noe som åpner for forsiktig plassering av den optiske fiber over prøven slik at den lyser opp hele bredden av røret.
- Irradiate prøven ved hjelp av en optisk fiber kanalisere en diode-pumpet Solid State laser opererer i en bølgelengde på 1 053 NM. Laser lys hendelsen på prøven og svingeren som brukes til å måle den photoacoustic effekten, er begge ufokusert.
- Energien i laser hendelsen på prøven er ca 8 mJ og 10 Hz laser rate er tilstrekkelig til å belyse hver prøve flere ganger når den passerer gjennom systemet.
- Plasser strømnings systemet på toppen av et omvendt mikroskop og sikre både laser pulsen og banen til prøven er synlige som prøven passerer om flyten systemet. Record Flow ved hjelp av et mikroskop-montert kamera.
- Ta opp ultralyd oppkjøp ved hjelp av datainnsamlingsprogram vare (se tabell over materialer). Trigger ultralyd og pulserende laser ved hjelp av FPGA. Bruk PBS med 2% mellom, og FA-CuS NPs ved en konsentrasjon av 100 μg/mL i PBS 2% mellom, som henholdsvis negative og positive kontroller.
- Ved hjelp av et mikroskop-montert kamera, ta opp både avfyring av laseren og passering av prøvene om strømnings systemet. Disse opptakene vil bli benyttet for å koordinere det akustiske signalet innspilt av svingeren med avfyring av laseren. Som prøvene passere foran avfyring av laseren, kan signalet da være korrelert til den resulterende photoacoustic signal for analyse. Ved en samplingsfrekvens på 10 Hz vil laseren belyse hver plugg flere ganger.
8. etterbehandling
- For hvert signal anskaffelse, s (t), beregne Hilbert Transform, H [s (t)], for å skape et analytisk signal.
- Lag en kompleks konvolutt, se(t), ved å beregne omfanget av det analytiske signalet, slik at
og integrere konvolutten for å måle det totale signalet som følge av hver anskaffelse. Sammenlign signalene fra hver testgruppe (dvs. PBS, kodede celler, FA-CuS NPs, celler alene) ved hjelp av en t-test i R statistisk programvare. Rå photoacoustic signaler og deres Hilbert forvandler presenteres i Figur 4. - For rekonstruksjon av bildet, normalisere den komplekse konvolutten basert på den maksimale toppen over hele kjøringen. Hvis du sammenligner en serie med kjøringer, kan du normalisere den komplekse konvolutten ved å bruke den maksimale toppen på tvers av hele serien. Etter normalisering konverterer du hver anskaffelse til en serie med piksel verdier. Representerer hver serie med piksel verdier som en kolonne i bilde gjenoppbyggingen. Representative rekonstruksjoner av PBS og FA-CuS NPs signalene er vist i figur 5, der begge bildene ble normalisert bruke maksimal topp på tvers av begge går.
og integrere konvolutten for å måle det totale signalet som følge av hver anskaffelse. Sammenlign signalene fra hver testgruppe (dvs. PBS, kodede celler, FA-CuS NPs, celler alene) ved hjelp av en t-test i R statistisk programvare. Rå photoacoustic signaler og deres Hilbert forvandler presenteres i Figur 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a viser en typisk tem bilde av syntetisert nanopartikler. Den gjennomsnittlige størrelsen på den typiske nanopartikkel er ca 8,6 NM ± 2,5 NM. Nanopartikkel måling ble utført i ImageJ. Det ble brukt terskel-og vannskille funksjoner for å skille partiklene for måling. Den horisontale og vertikale diameter av hver partikkel ble målt vinkelrett på hverandre og ytterligere gjennomsnitt. For DLS er en representativ måling vist i figur 1B. Gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter for disse partiklene er 73,6 NM. Kobber sulfid nanopartikler har en karakteristisk absorbansen kurve som strekker seg inn i NIR, som vist i figur 1C. Det er en liten gjenstand rundt 850 NM som ble forårsaket av veksling av lasere av spektrofotometer.
Fluorescens mikroskopi bilder av celler inkubert med fluorescensmerkete merkede nanopartikler kan sees i figur 2. Nanopartikkel opptak kan bli visualisere av tilstedeværelsen av fluorescens over cellen. Celler som ikke inkubert med nanopartikler, viser ingen fluorescens signal. Tilstedeværelsen av dette fluorescens signalet indikerer vellykket opptak av partiklene og deres evne til å bli oppdaget i strømnings systemet.
Figur 3 viser det generelle oppsettet av photoacoustic Flow-systemet. Figur 3a viser en detaljert modell av 3D Flow kammeret. Dette kammeret kan skrives ut ved hjelp av STL-filen som følger med denne protokollen. Figur 3B viser en oversikt over oppsettet av strømnings tanken. Figur 3C viser et generelt oppsett av strømnings tanken og datainnsamlings systemet.
Typiske datainnsamlings signaler vises i Figur 4. Rådata indikerer forskjellene i signalet mellom nanopartikkel kodede celler, PBS og FA-CuS NPs. Et oppkjøp er det resulterende photoacoustic signalet generert fra en enkelt laser puls. På grunn av den raske avfyring hastigheten på laseren, genererer hver prøve analysert flere oppkjøp. En konvolutt for hvert enkelt kjøp ble generert ved hjelp av Hilbert-transformeringen. Denne konvolutten ble integrert for å måle den totale mengden signal som genereres fra laser pulsen. I en tidligere studie ble disse dataene analysert ved hjelp av R statistisk programvare, der antall oppkjøp analysert for t-testen var 203, 150, 160 og 131, for celler med NPs, celler alene, PBS og NPs alene, henholdsvis22. Dataene ble normalisert etter Logg transformasjon og sammenlignet utnytte en Welch ' s t-test i R. Signalene som oppstår fra FA-CuS NPs alene ved en konsentrasjon på 100 μg/mL viste et mye høyere signal enn den negative kontrollen. Forskjellen i signalene mellom negativ kontroll og den merkede eggstokkene CTC var mer subtil enn den positive kontrollen, men kunne oppdages gjennom analysen av deres midler av en t-test22.
Benytter skikk og bruk LabView og MATLAB programvare, image rekonstruksjoner var fremstilt av det positiv og negativ Kontroller inne virkelig-tid og stolpe-oppkjøpet, respectively. For å generere photoacoustic rekonstruksjoner ble det beregnet en konvolutt for hver anskaffelse ved hjelp av Hilbert-transformeringen. Individuelle konvolutter ble deretter konvertert til piksel verdier og vist som uavhengige kolonner. Klare forskjeller i photoacoustic signalet mellom FA-CuS NPs ved en konsentrasjon på 100 μg/mL og PBS prøven (figur 5). Kontroller for systemet er viktig å kjøre for å sikre at systemet er tilstrekkelig produsere photoacoustic signal som kan oppdages av svingeren.
Figur 1: REPRESENTATIVE np karakterisering. (A) tem-bilde av syntetisert FA-CuS NPs. Scale bar = 50 NM. (B) representant DLS intensitet distribusjon av syntetisert FA-cus NPS. (C) representative FA-cus NPS absorbansen kurve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant fluorescens mikroskopi bilder av SKOV-3-celler. Cellene ble inkubert med og uten 400 μg/mL fluorescensmerkete-kodet NPs. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative bilder av photoacoustic Flow flowcytometri system og Flow kammer. (A) detaljert visning av 3D trykt strømnings kammer. (B) diagram av PAFC system. (C) Flow systemarkitektur: SP = sprøyte pumpe; DAQ/FPGA = datainnhenting/felt programmerbare gate array; OB = objektiv linse; AV = optisk fiber; FC = fiber kopling; UT = ultralyd svinger; FT = strømnings tank. Dette tallet er tilpasset fra Lusk et al.22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative rådata signal og Hilbert forvandler av prøver testet i Flow-systemet. (A) representative rådata signal fra PBS og celler inkubert med NPs og (D) Hilbert transformere data. (B) representative rå data signal fra cellene alene og cellene INKUBERT med FA-CuS NPs og (E) Hilbert transformere av dataene. (C) representativt rå data signal fra PBS og 100 μg/ml FA-CuS NPs og (F) Hilbert transformere av dataene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant photoacoustic bilde rekonstruksjoner av photoacoustic data. (A) rekonstruksjon av 100 μg/ml FA-CuS NPs og (B) PBS testet i Flow-systemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Flow CHAMBER STL. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er en grei metode for påvisning av eggstokkene CTC utnytte PAFC og en målrettet CuS kontrastmiddel. Mange metoder har blitt utforsket for påvisning av eggstokkene CTC, inkludert mikrovæskebasert enheter, RT-PCR, og fluorescens Flow flowcytometri23,24,25. Disse varierer i kompleksitet, kostnader og nøyaktighet, og begrenser effektiviteten i kliniske innstillinger. PAFC introduserer flere fordeler fremfor disse tradisjonelle metodene for påvisning av CTC, inkludert muligheten til å oppdage CTC i pasientprøver, og dens enkle oversettelse til in vivo-applikasjoner. PAFC er også vist å nøyaktig detektere CTC in vitro og in vivo når det kombineres med målrettede kontrastmidler26,27.
I dette arbeidet ble det vurdert å evaluere verdiene i FA-CuS NP-kontrast for deres evne til å forbedre nøyaktigheten av CTC-deteksjon ved fysiologisk relevante konsentrasjoner. Studier ble utført ved hjelp av isolerte SKOV-3 celler resuspendert i PBS. Analyse av fluorescens mikroskopi indikerte vellykket opptak av disse partiklene. Resultatene oppdaget SKOV-3 celler ned til en konsentrasjon av 1 celle/μL22. Avgjørende skritt i denne protokollen innebære nanopartikkel syntese og justering av photoacoustic flyt oppsett. Under nanopartikkel syntese, er det viktig å sørge for at løsningen har slått en mørk grønn farge før du fjerner blandingen fra oljebad. For Flow-systemet, kjører en negativ og positiv kontroll selv om systemet før prøven testing er nødvendig for å sikre at systemet produserer tilstrekkelig photoacoustic signal for senere påvisning av merket celler. Mens du kjører Flow-systemet, er det viktig å sikre at hendelsen lyset fra fiberoptisk er helt belyse kapillærrøret, og at svingeren er tettsittende mot siden av strømnings kammeret. Endelig er grundig testing av systemet for lekkasjer nødvendig for å sikre den biologiske sikkerheten til systemet og for konsistent flyt gjennom kammeret.
Foreløpige studier bekreftet photoacoustic deteksjon ved hjelp av svingeren og forsterknings systemet for det gjeldende PAFC-systemet. De fleste av disse signalene besto av lavere frekvens signaler (< 20 MHz). Videre studier er nødvendig for å bekrefte om dette skyldes den faktiske hyppigheten av de genererte photoacoustic signaler eller 35 MHz båndbredde på forsterkeren. Fremtidige studier vil undersøke frekvens komponenter av de oppdagede signalene for å optimalisere den sentrale frekvensen av transduseren samt båndbredden til forsterknings systemet. Det nåværende systemet er spesielt egnet for ex vivo deteksjon av CTC. Denne metoden identifiserer imidlertid potensialet for fremtidig anvendelse av FA-CuS NPs in vivo.
Fremtidige studier tar sikte på å påvise kreftceller for eggstokkene i blandede kulturer, kliniske prøver og in vivo-modeller28,29,30. Videre vil fremtidige studier undersøke spesifisitet av disse nanopartikler kontra ikke-målrettede kontroller. Fremtidig validering av denne metoden vil omfatte testing av dette verktøyet med menneskelige kliniske prøver, gjennomføring av høy gjennomstrømming testing og analyse, og oversettelse til kliniske innstillinger. Denne photoacoustic teknikken viser potensialet for fremtidig oversettelse til et bredt spekter av kliniske anvendelser og sykdommer på tvers av en rekke kontrastmidler og analytter. Photoacoustic påvisning av analytter utnytte PAFC har potensial til å gjøre det punktet-av-omsorg deteksjon av CTC og andre patogener raskere og billig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Madeleine Howell for hennes hjelp med syntese, Matthew Chest for hans hjelp designe Flow-systemet, og Ethan Marschall for å få hjelp med SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
