Summary
Um protocolo é apresentado para detectar células tumorais ovarianas circulantes utilizando um sistema de fluxo fotoacústico feito medida e nanopartículas de sulfeto de cobre cobertas de ácido fólico.
Abstract
Muitos estudos sugerem que a enumeração das células tumorais circulantes (CTCs) pode mostrar a promessa como uma ferramenta prognóstico para o câncer de ovário. As estratégias atuais para a detecção de CTCs incluem citometria de fluxo, dispositivos microfluídicos e reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Apesar dos avanços recentes, os métodos para a detecção da metástase precoce do câncer de ovário ainda não têm a sensibilidade e especificidade necessárias para a tradução clínica. Aqui, um novo método é apresentado para a detecção de células tumorais circulantes ovarianas por citometria de fluxo fotoacústico (PAFC) utilizando um sistema impresso tridimensional personalizado (3D), incluindo uma câmara de fluxo e uma bomba de seringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfeto de cobre tampados com ácido fólico (FA-CuS NPs) para atingir células cancerosas ovarianas SKOV-3 pela PAFC. Este trabalho demonstra a afinidade destes agentes de contraste para pilhas ovarianas do cancro. Os resultados mostram caracterização de PN, detecção de PAFC e captação de NP por microscopia de fluorescência, demonstrando assim o potencial deste novo sistema para detectar CTCs ovarianos em concentrações fisiologicamente relevantes.
Introduction
O câncer de ovário é uma das neoplasias ginecológicas mais mortais e resultou em cerca de 184.800 mortes em todo o mundo em 20181. Vários estudos têm mostrado a correlação entre a progressão do câncer de ovário (ou seja, metástase) e a presença de CTCs2,3,4. O método mais comum para detecção e isolamento de CTCs utiliza o sistema Cellsearch, que tem como alvo o receptor EpCam5. Expressão EpCam, no entanto, é downregulated em epitelial para transição mesenchymal, que tem sido implicado na metástase do câncer6. Apesar dos avanços, as tecnologias clínicas atuais ainda sofrem de baixa precisão, alto custo e complexidade. Devido a essas desvantagens, novas tecnologias para a descoberta e enumeração de CTCs ovarianos tornou-se uma área importante para a pesquisa.
Recentemente, a PAFC surgiu como um método eficaz para a detecção não invasiva de células cancerosas, análise de nanomateriais e identificação de bactérias7,8,9. PAFC difere da citometria do fluxo de fluorescência tradicional, detectando anallítos no fluxo, utilizando fotoacústica. O efeito fotoacústico é gerado quando a luz laser é absorvida por um material que causa expansão termoelástica, produzindo uma onda acústica que pode ser detectada por um transdutor de ultrassom10,11. As vantagens da PAFC em relação aos métodos tradicionais de citometria de fluxo incluem simplicidade, facilidade de tradução para ambientes clínicos e a detecção de CTCs em profundidades sem precedentes nas amostras de pacientes12,13. Estudos recentes têm utilizado sistemas de PAFC para a detecção de células usando contraste endógeno e exógeno14,15. Agentes de contraste de absorção de luz próximos ao infravermelho (NIR), como corante verde de indocianina, e NPs metálicos (por exemplo, ouro e CuS) têm sido usados para a rotulagem seletiva de células e tecidos em combinação com imagens fotoacústicas16,17,18. Devido à profundidade melhorada da penetração da luz nir dentro dos tecidos biológicos, a detecção fotoacústica de absorventes pode ser realizada em maiores profundidades para aplicações clínicas. Devido ao seu grande potencial de utilização na clínica, a combinação de agentes de contraste nir alvo com PAFC tem gerado um interesse considerável para a detecção de CTCs.
A PAFC em combinação com agentes de contraste direcionados fornece uma abordagem melhorada para análise de alta taxa de taxa de taxa de avaliação de amostras de pacientes com maior precisão e detecção direcionada de CTCs. Uma das principais estratégias de detecção para CTCs é a segmentação específica das proteínas de membrana presentes na célula de interesse. Uma característica notável dos CTCs ovarianos é a superexpressão dos receptores de folato localizados em sua membrana externa19. A segmentação do receptor de folato é uma estratégia ideal para a identificação de CTCs ovarianos no sangue porque as células endógenas, que têm maior expressão de receptores de ácido fólico, são geralmente luminais e têm exposição limitada à corrente sanguínea20. NPs sulfeto de cobre (CuS NPs) foram recentemente reconhecidos por sua capacidade de atingir receptores de folato expressos em células cancerosas21. Combinados com sua biocompatibilidade, facilidade de síntese e absorção profunda no NIR, esses agentes de contraste np fazem uma estratégia de segmentação ideal para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC.
Este trabalho descreve a preparação de FA-CuS NPs e seu uso para a detecção de células cancerosas ovarianas em um sistema de fluxo fotoacústico. Os PNNs CuS são modificados com ácido fólico para atingir especificamente CTCs ovarianos e emitem um sinal fotoacústico quando estimulados com um laser de 1.053 nm. Os resultados indicam a detecção bem sucedida de células cancerosas ovarianas incubadas com esses agentes de contraste fotoacústico dentro do sistema PAFC. Estes resultados mostram a detecção de células cancerosas ovarianas até concentrações de 1 célula/μL, e microscopia fluorescência confirma a captação bem sucedida dessas partículas por células cancerosas ovarianas SKOV-322. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da síntese fa-cus nps, preparação de amostras para microscopia de fluorescência, construção do sistema de fluxo fotoacústico, e a detecção fotoacústica de células cancerosas ovarianas. O método apresentado mostra a identificação bem sucedida de CTCs ovarianos no fluxo que utiliza FA-CuS NPs. O trabalho futuro centrar-se-á sobre a aplicação clínica desta tecnologia para a deteção adiantada da metástase ovariana do cancro.
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Protocol
1. Síntese e Funcionalização de Nanopartículas
NOTA: Síntese do FA-CuS NPs é alcançado usando um método de síntese de um pote adaptado de um protocolo publicado anteriormente21.
CUIDADO: Toda a síntese deve ocorrer em uma capa química ventilada da emuman.
- Antes da síntese, filtre aproximadamente 300 mL de água desionizada (DI) através de um filtro estéril de 0,2 μm.
- Limpe um frasco de fundo redondo de vidro de 250 mL com uma solução detergente e lave com água DI. Adicione 0,0134 g de CuCl2 em 100 mL de água DI para criar uma solução de 1 mM.
- Adicione 0,015 g de ácido fólico (FA) à solução CuCl2 e mexa por ~ 5 min usando uma barra de agitação magnética.
- Adicionar Na2S·9H2O (0,024 g em 100 μL DI água) mais de aproximadamente 10 s para a mistura de reação utilizando uma pipeta de 200 μL.
NOTA: Após a adição do Na2S·9H2O, a solução vai mudar a cor de um amarelo claro para um marrom escuro. - Tampe a reação e coloque em um banho de óleo, definido como 90 °C, e continue mexendo com uma barra de agitação magnética. Após aproximadamente 15 min, ou quando o banho de óleo atingiu 85 a 90 °C, permita que a reação prossiga por mais uma hora. Sua mistura deve gradualmente girar para uma cor verde escura.
NOTA: Certifique-se de desabafar o sistema enquanto aquece a mistura de reação para evitar o acúmulo de pressão. - Retire o vaso de reação do banho de óleo e arrefecer brevemente à temperatura ambiente por aproximadamente 10 a 15 min antes de se transferir para um banho de gelo.
- Uma vez que a mistura de reação esfriou abaixo de 20 °C, ajuste o pH para 10 utilizando 1M NaOH para dissolver o ácido fólico restante em solução.
- Purifique a mistura de reação FA-CuS usando uma coluna de centrífuga de 30 kDa. Adicione a solução em 15 lotes de mL para a coluna e centrífuga em 3.082 x g para 15 min.
- Uma vez que toda a mistura de reação tenha sido concentrada, recombine as frações concentradas e lave 4x com 15 mL de pH 10 NaOH na coluna de centrifugação de 30 kDa.
- Para medições em massa, pegue 1/3 da solução (~66 μL) e divida em três frascos de vidro. Seco em forno a vácuo durante a noite a 40 °C um vácuo de ~ 27 mmHg.
- Dissolva o outro 2/3 da solução concentrada em 250 μL de PBS e armazene em 4 °C até o uso mais adicional.
- Antes de utilizar o FA-CuS NPs, sonicate-los por 30 minutos em um sonicator banho em uma configuração alta.
2. Caracterização np
- Realize a dispersão dinâmica de luz (DLS) Adicione 10 μL de NPS FA-CuS concentrado na solução PBS do passo 1.1.14 a 2 mL de água DI. Antes da caracterização por DLS, sonicate as partículas para 30 min em um sonicator do banho em um ajuste elevado e filtraa através de um filtro estéril de 0.2 μm para remover a poeira residual.
- Realizar microscopia eletrônica de transmissão (TEM) : Adicione 10 μL de FA-CuS nps concentrado na solução PBS para um pedaço de papel de cera. Inverta uma grade de cobre revestida de formvar na parte superior da gotícula e deixe sentar-se por 2 min. Toque na borda da grade revestida de formvar para um pedaço de papel de filtro para remover o excesso de líquido. Deixe o ar secar. Imagem da grade de cobre utilizando um microscópio eletrônico em uma tensão acelerada de 80 kV.
NOTA: Os resultados típicos da caracterização do NPS da FA-CuS são apresentados na Figura 1.
3. Cultura celular
- Este protocolo utiliza células SKOV-3. Salvo indicação em contrário, as células Cultura SKOV-3 no meio 5A de McCoy complementadas com 10% FBS, 100 u/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina, e mantêm-se a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2.
4. Marcação fluorescente de FA-CuS NPS para microscopia
- Adicione o succinimidyl succinimidyl ester do Texas-Vermelho-X (0,2 mg dissolvido em DMSO a uma concentração de 10 mg/mL) a uma solução contendo 2 mg de Fa-CuS NPs em 1 mL de 0,1 M NaHCO3 (pH ~9) buffer.
- Mexa a mistura de reação usando uma barra de agitação magnética por 1 h, longe da luz à temperatura ambiente.
- Concentre a mistura de reação em uma coluna de centrífuga de 4 mL 30 kDa MWCO girando a 4.000 x g por 10 min.
- Lave a solução concentrada 3x com 4 mL de 0,1 M NaHCO3 buffer (pH ~9) em uma coluna de centrífuga. Posteriormente, lave a solução concentrada com 4 mL de água DI 3x ou até que apenas uma quantidade de fluorescência permaneça visível no fluxo por UV-VIS.
5. FA-CuS NPS Captação por células de câncer de ovário
- Antes da incubação com FA-CuS NPs, incubar células SKOV-3 em um frasco T75 com 8-15 mL de hPMI-1640 sem ácido fólico com 10% FBS e 1% penicilina / estreptomicina por pelo menos 24 h.
- Células de sementes em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico a uma densidade de 0,1 x 106 células/mL em uma placa de 24 poços.
- No dia seguinte, incubam células com 400 μg/mL FA-CuS NPS em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico para 2 h.
- Após esta incubação, trippsinizar as células com 0,5 mL de 0,25% de tripsina com EDTA. Adicione pelo menos 1 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico para neutralizar a trippsina e centrífuga as células a 123 x g por 6 min.
- Retire o supernatant, resuspender as células em 2 mL de PBS, e centrífuga em 123 x g para 6 min. Executar este passo de lavagem 2x para remover qualquer NPs desvinculados.
- Resuspenda as células em 1 a 2 mL de PBS com solução tween de 2%.
- Conte as células usando um hemocytometer e trypan azul. Mais células diluídas se a contagem de células for muito alta. Diluir as células em PBS com 2% tween para a concentração escolhida para detecção.
- As células estão agora prontas para serem analisadas pelo sistema PAFC.
6. Microscopia fluorescência da captação de FA-CuS NPS
- Repita etapas listadas na etapa 5.1 e prossiga com o protocolo abaixo para microscopia.
- Células de sementes a uma densidade de 0,1 x 106 células/mL em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico em lábios de vidro em uma placa de 24 poços.
- No dia seguinte, incubam as células com NPs FA-CuS fluorescentemarcados em triplicado, em concentrações de 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL e 400 μg/mL em 0,5 mL de mídia de crescimento completo RPMI-1640 sem ácido fólico.
- Incubar as células com os NPs por 2 h na incubadora de 37 °C
- Após este período de incubação, lave as células 3x com PBS.
NOTA: Para todas as etapas da lavagem, adicione com cuidado a solução no lado da placa do poço para não perturbar as pilhas. Após a adição, incline cuidadosamente a placa e retire a solução do lado do poço. - Incubar as células com 0,5 mL de 3,7% de paraformaldeído (PFA) na PBS por 15 min e transferir os lábios de vidro para uma nova placa de 24 poços.
CUIDADO: PFA é um agente cancerígeno conhecido. Faça toda a fixação em uma capa química ventilada da emumel e desgaste o equipamento protetor pessoal apropriado. - Incubar as células em uma solução de 3,7% PFA com 0,1% Triton-X em PBS por 5 min.
- Lave as células com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada e transfira os lábios para uma nova placa.
- Incubar as células com 0,5 mL de uma solução PBS contendo DAPI (20 μL/mL de uma solução de estoque de 0,5 mg/mL é usada para coloração) por 5 min, longe da luz.
- Lave as células com PBS 3x.
- Após a lavagem final pbs, montar os coverslips em slides com montagem média.
- As células estão agora prontas para serem imagemdas por microscopia de fluorescência. A figura 2 mostra um exemplo de caracterização celular típica por microscopia de fluorescência.
7. Arquitetura do sistema de fluxo
- Construção da câmara de fluxo
NOTA: Um arquivo SolidWorks de um tanque de fluxo impresso em 3D pode ser encontrado nos Materiais Suplementares.- Usando o arquivo SolidWorks fornecido, impressão 3D do tanque de fluxo usando termoplástico ABS ou plástico PLA. As dimensões são fornecidas abaixo se a SolidWorks não estiver disponível. A Figura 3A mostra uma representação deste modelo. O corpo do tanque de fluxo é de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. As extremidades distantes do tanque de fluxo incluem furos de aproximadamente 5 mm de diâmetro para permitir a entrada de tubos contendo o tubo capilar.
NOTA: O tanque de fluxo tem um buraco de 1 cm, perpendicular à orientação do tubo capilar, para a colocação do transdutor de ultra-som. Uma extrusão cilíndrica com o mesmo diâmetro interno que o buraco se estende 6 mm no tanque. Para imagens em tempo real, o tanque de fluxo tem um slot de 1 mm x 3 mm diretamente abaixo do tubo capilar. - Depois de imprimir o tanque de fluxo 3D, limpe e monte o sistema para uso.
- Coloque os lábios de vidro sobre o slot de 1 mm x 3 mm e o buraco de 1 cm no sistema de fluxo.
- Selar cuidadosamente com silicone para evitar vazamentos.
- Coloque o tubo capilar nos tubos curados de silicone. Insira os tubos na câmara de fluxo, embora o lado do tanque de fluxo de tal forma que o tubo capilar de vidro está diretamente acima e na frente do slot de 3 mm e o buraco de 1 cm.
- Selar a tubulação usando silicone para evitar vazamentos.
- Usando o arquivo SolidWorks fornecido, impressão 3D do tanque de fluxo usando termoplástico ABS ou plástico PLA. As dimensões são fornecidas abaixo se a SolidWorks não estiver disponível. A Figura 3A mostra uma representação deste modelo. O corpo do tanque de fluxo é de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. As extremidades distantes do tanque de fluxo incluem furos de aproximadamente 5 mm de diâmetro para permitir a entrada de tubos contendo o tubo capilar.
- Configuração do sistema de fluxo fotoacústico
NOTA: Figura 3B e Figura 3C mostram um exemplo da arquitetura do sistema de fluxo.- Conecte o transdutor a um pulser/receptor do ultra-som. Amplificar o sinal com um ganho de 59 dB.
- Conecte a saída do filtro a um osciloscópio reconfigurável multiuso equipado com uma matriz de portão programável de campo embutido.
- Conecte um dos tubos provenientes da câmara de fluxo a uma junção T, conectada a duas bombas de seringa em cada ramo.
- Encha uma das bombas de seringa com ar e a outra bomba com a amostra a ser analisada. Defina a bomba contendo ar a uma taxa de fluxo de 40 μL/min e a bomba contendo a amostra a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. O fluxo de duas fases resultante produzirá volumes de amostra de 1 μL. Nessa taxa de fluxo, o sistema testará aproximadamente 6,4 amostras por minuto.
NOTA: Para manter uma distribuição consistente das células, vórtice levemente cada amostra imediatamente antes de ser testado. Além disso, gire a seringa a cada poucos minutos, a fim de evitar que as células se estabeleçam na solução. - Conecte o tubo restante que sae do sistema de fluxo a um recipiente com o descorante de 10%, para dispr das pilhas depois que saem do sistema de fluxo.
NOTA: Antes de utilizar o sistema de fluxo, verifique se há vazamentos, pois estes podem afetar o fluxo. As células devem ser contidas dentro de um sistema fechado para manter a segurança biológica durante o procedimento. - O projeto do tanque impresso em 3D permite um alinhamento consistente e repetível entre o transdutor e a luz laser com calibração mínima. Quando colocado corretamente dentro do tanque personalizado, o tubo capilar de quartzo garante que o transdutor e o laser estejam diretamente alinhados.
- Coloque a seção do tubo capilar de quartzo em alinhamento direto com o transdutor, no campo de visão do microscópio, permitindo a colocação cuidadosa da fibra óptica acima da amostra de tal forma que ilumina toda a largura do tubo.
- Irradiar a amostra usando uma fibra óptica canalizando um laser de estado sólido bombeado por diodo operando a um comprimento de onda de 1.053 nm. O incidente da luz laser na amostra e o transdutor usado para medir o efeito fotoacústico são ambos desfocados.
- A energia do incidente do laser na amostra é de aproximadamente 8 mJ e a taxa de laser de 10 Hz é suficiente para iluminar cada amostra várias vezes à medida que passa pelo sistema.
- Coloque o sistema de fluxo em cima de um microscópio invertido e certifique-se de que tanto o pulso de laser quanto o caminho da amostra sejam visíveis à medida que a amostra passa pelo sistema de fluxo. Fluxo de registro usando uma câmera montada no microscópio.
- Registre as aquisições de ultrassom utilizando software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais). Acione o ultra-som e o laser pulsado usando o FPGA. Utilize pbs com 2% tween, e FA-Cus NPs em uma concentração de 100 μg/mL em PBS 2% Tween, como controles negativos e positivos, respectivamente.
- Utilizando uma câmera montada em microscópio, grave o disparo do laser e a passagem de amostras através do sistema de fluxo. Estas gravações serão utilizadas para correlacionar o sinal acústico gravado pelo transdutor com o disparo do laser. À medida que as amostras passam na frente do disparo do laser, o sinal pode então ser correlacionado com o sinal fotoacústico resultante para análise. A uma taxa de amostragem de 10 Hz, o laser iluminará cada plugue várias vezes.
8. Pós-Processamento
- Para cada aquisição de sinal, s(t), calcule a transformação hilbert, H[s(t)], a fim de criar um sinal analítico.
- Crie um envelope complexo, se(t), calculando
a magnitude do sinal analítico, de modo que e integrar o envelope para medir o sinal total resultante de cada aquisição. Compare os sinais de cada grupo de teste (ou seja, PBS, células marcadas, FA-CuS NPs, células sozinhas) utilizando um t-test em software estatístico R. Os sinais fotoacústicos crus e suas transformações de Hilbert são apresentados na figura 4. - Para a reconstrução de imagens, normalize o envelope complexo com base no pico máximo em toda a execução. Se comparar uma série de corridas, normalize o envelope complexo usando o pico máximo em toda a série. Após a normalização, converta cada aquisição em uma série de valores de pixel. Represente cada série de valores de pixel como uma coluna na reconstrução de imagem. Reconstruções representativas do PBS e os sinais de NPs DA FA-CuS são mostradas na Figura 5,onde ambas as imagens foram normalizadas usando o pico máximo em ambas as corridas.
a magnitude do sinal analítico, de modo que e integrar o envelope para medir o sinal total resultante de cada aquisição. Compare os sinais de cada grupo de teste (ou seja, PBS, células marcadas, FA-CuS NPs, células sozinhas) utilizando um t-test em software estatístico R. Os sinais fotoacústicos crus e suas transformações de Hilbert são apresentados na figura 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1A mostra uma imagem TÍPICA DE TEM das nanopartículas sintetizadas. O tamanho médio da nanopartícula típica é de aproximadamente 8,6 nm ± 2,5 nm. A medição de nanopartículas foi realizada no ImageJ. As funções do ponto inicial e da bacia hidrográfica foram aplicadas para separar as partículas para medição. Os diâmetros horizontais e verticais de cada partícula foram medidos perpendiculares uns aos outros e mais em média. Para dls, uma medida representativa é mostrada na figura 1B. O diâmetro hidrodinâmico médio para essas partículas é de 73,6 nm. As nanopartículas de sulfeto de cobre têm uma curva de absorção característica que se estende para o NIR, como mostrado na Figura 1C. Há um ligeiro artefato em torno de 850 nm que foi causado pela troca de lasers pelo espectrômetro.
Imagens de microscopia de fluorescência de células incubadas com nanopartículas fluorescentes marcadas podem ser vistas na Figura 2. A captação de nanopartículas pode ser visualizada pela presença de fluorescência em toda a célula. Células não incubadas com nanopartículas não mostram sinal de fluorescência. A presença deste sinal de fluorescência indica a captação bem sucedida das partículas e sua capacidade de ser detectada no sistema de fluxo.
A figura 3 mostra a configuração geral do sistema de fluxo fotoacústico. A Figura 3A mostra um modelo detalhado da câmara de fluxo 3D. Esta câmara pode ser impressa utilizando o arquivo .stl fornecido com este protocolo. A Figura 3B mostra uma visão geral da configuração do tanque de fluxo. A Figura 3C mostra uma configuração geral do tanque de fluxo e do sistema de aquisição de dados.
Sinais típicos de aquisição de dados são mostrados na Figura 4. Os dados brutos indicam as diferenças de sinal entre as células marcadas por nanopartículas, PBS e FA-CuS NPs. Uma aquisição é o sinal fotoacústico resultante gerado a partir de um único pulso de laser. Devido à rápida taxa de disparo do laser, cada amostra analisada gera múltiplas aquisições. Um envelope para cada aquisição individual foi gerado usando a transformação de Hilbert. Este envelope foi integrado para medir a quantidade total de sinal gerado a partir do pulso de laser. Em um estudo anterior, esses dados foram analisados por meio de software estatístico R, onde o número de aquisições analisadas para o t-teste foi de 203, 150, 160 e 131, para células com NPs, células sozinhas, PBS e NPs sozinhas, respectivamente22. Os dados foram normalizados pela transformação do registro e comparados utilizando um teste t de Welch em R. Os sinais resultantes dos NPs FA-CuS sozinhos com uma concentração de 100 μg/mL mostraram um sinal muito maior do que o controle negativo. A diferença nos sinais entre o controle negativo e os CTCs ovarianos marcados era mais subtil do que o controle positivo mas poderia ser detectada com a análise de seus meios por um t-teste22.
Utilizando o software personalizado LabView e MATLAB, foram feitas reconstruções de imagem dos controles positivos e negativos em tempo real e pós-aquisição, respectivamente. Para gerar as reconstruções fotoacústicas, um envelope de cada aquisição foi calculado usando a transformação hilbert. Os envelopes individuais foram posteriormente convertidos em valores de pixele exibidos como colunas independentes. Diferenças claras no sinal fotoacústico ocorrem entre os NPs FA-CuS a uma concentração de 100 μg/mL e a amostra pbs(Figura 5). Os controles para o sistema são importantes para executar para garantir que o sistema está produzindo adequadamente o sinal fotoacústico que pode ser detectado pelo transdutor.
Figura 1: Caracterização representativa do NP. (A)TEM imagem de sintetizado FA-CuS NPs. Barra de escala = 50 nm. (B) Distribuição representativa de intensidade dls de nps sintetizados fa-cus. (C)representante FA-Cus NPs curva de absorção. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Imagens representativas da microscopia da fluorescência de pilhas De SKOV-3. As células foram incubadas com e sem 400 μg/mL fluorescente marcadoS NPs. Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Imagens representativas do sistema de citometria de fluxo fotoacústico e câmara de fluxo. (A)Visão detalhada da câmara de fluxo impressa em 3D. (B)Diagrama do sistema PAFC. (C)Arquitetura do sistema de fluxo: SP = bomba de seringa; DAQ/FPGA = matriz de porta programável de aquisição/campo de dados; Ob = lente objetiva; DE = fibra óptica; FC = acoplador de fibra; UT = transdutor de ultra-som; FT = tanque de fluxo. Este número é adaptado de Lusk et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Sinal de dados brutos representativos e Hilbert transforma de amostras testadas no sistema de fluxo. (A)Sinal de dados brutos representativos da PBS e células incubadas com NPs e a(D)Hilbert transformação dos dados. (B) Sinal de dados brutos representativos das células sozinho e as células incubadas com FA-CuS NPs e (E)a transformação Hilbert dos dados. (C) Sinal de dados brutos representativos da PBS e 100 μg/mL FA-CuS NPs e (F)a transformação hilbert dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Reconstruções representativas de imagens fotoacústicas dos dados fotoacústicos. (A)Reconstrução de imagem de 100 μg/mL FA-CuS NPs e (B)PBS testado dentro do sistema de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Arquivo suplementar 1: Câmara de Fluxo STL. Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).
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Discussion
Este protocolo é um método direto para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC e um agente de contraste CuS alvo. Muitos métodos têm sido explorados para a detecção de CTCs ovarianos, incluindo dispositivos microfluídicos, RT-PCR e citometria fluorescênciafluxo 23,24,25. Estes variam em complexidade, custo e precisão, limitando sua eficácia em ambientes clínicos. A PAFC introduz várias vantagens sobre esses métodos tradicionais para a detecção de CTCs, incluindo a capacidade de detectar CTCs dentro de amostras de pacientes e sua facilidade de tradução para aplicações in vivo. O PAFC também demonstrou detectar com precisão ctcs in vitro e in vivo quando combinado com agentes de contraste direcionados26,27.
Neste trabalho, os agentes de contraste fa-cus np foram avaliados por sua capacidade de melhorar a precisão da detecção de CTC em concentrações fisiologicamente relevantes. Foram realizados estudos com células SKOV-3 isoladas resuspensas na PBS. A análise por microscopia de fluorescência indicou a captação bem-sucedida dessas partículas. Os resultados detectaram células SKOV-3 até uma concentração de 1 célula/μL22. Etapas cruciais neste protocolo envolvem a síntese de nanopartículas e o alinhamento da configuração de fluxo fotoacústico. Durante a síntese de nanopartículas, é importante certificar-se de que a solução virou uma cor verde escura antes de remover a mistura do banho de óleo. Para o sistema de fluxo, executando um controle negativo e positivo, embora o sistema antes do teste da amostra seja necessário para garantir que o sistema esteja produzindo sinal fotoacústico adequado para a detecção subsequente de células rotuladas. Durante a execução do sistema de fluxo, é importante garantir que a luz incidente da fibra óptica está iluminando completamente o tubo capilar, e que o transdutor é confortável contra o lado da câmara de fluxo. Finalmente, testes rigorosos do sistema para vazamentos são necessários para garantir a segurança biológica do sistema e para fluxo consistente através da câmara.
Para o atual sistema PAFC, estudos preliminares confirmaram a detecção fotoacústica por meio do sistema de transdução e amplificação. A maioria destes sinais foi composta por sinais de menor frequência (<20 MHz). Mais estudos são necessários para confirmar se isso se deve à frequência real dos sinais fotoacústicos gerados ou à largura de banda de 35 MHz do amplificador. Estudos futuros investigarão os componentes de frequência dos sinais detectados para otimizar a frequência central do transdutor, bem como a largura de banda do sistema de amplificação. O sistema atual é especificamente adequado para a detecção de CTCs ex vivo. No entanto, este método identifica o potencial para a futura aplicação de NPs FA-CuS in vivo.
Estudos futuros visam detectar células cancerosas do ovário dentro de culturas mistas, amostras clínicas humanas e modelos in vivo28,29,30. Além disso, estudos futuros examinarão a especificidade dessas nanopartículas versus controles não direcionados. A validação futura deste método incluirá testar esta ferramenta com amostras clínicas humanas, implementação de testes e análises de alta taxa de taxa e tradução para ambientes clínicos. Esta técnica fotoacústica mostra potencial para tradução futura para uma grande variedade de aplicações clínicas e doenças em uma variedade de agentes de contraste e análises. A detecção fotoacústica de análises utilizando PAFC tem o potencial de tornar a detecção de ctcs e outros patógenos mais rápidos e baratos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer Madeleine Howell por sua ajuda com a síntese, Matthew Chest por sua ajuda para projetar o sistema de fluxo, e Ethan Marschall para assistência com SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
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