Summary
Se presenta un protocolo para detectar células tumorales ováricas circulantes utilizando un sistema de flujo fotoacústico hecho a medida y nanopartículas de sulfuro de cobre con ácido fólico dirigido.
Abstract
Muchos estudios sugieren que la enumeración de las células tumorales circulantes (CTC) puede mostrar promesa como una herramienta de pronóstico para el cáncer de ovario. Las estrategias actuales para la detección de CTC incluyen citometría de flujo, dispositivos microfluídicos y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). A pesar de los avances recientes, los métodos para la detección de metástasis temprana del cáncer de ovario todavía carecen de la sensibilidad y especificidad necesarias para la traducción clínica. Aquí, se presenta un método novedoso para la detección de células tumorales circulantes ováricas por citometría de flujo fotoacústico (PAFC) utilizando un sistema impreso tridimensional personalizado (3D), incluyendo una cámara de flujo y una bomba de jeringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfuro de cobre cubiertas de ácido fólico (PN FA-CuS) para atacar las células cancerosas de ovario SKOV-3 por PAFC. Este trabajo demuestra la afinidad de estos agentes de contraste para las células cancerosas de ovario. Los resultados muestran la caracterización NP, la detección de PAFC y la toma np mediante microscopía de fluorescencia, lo que demuestra el potencial de este novedoso sistema para detectar CTCováles ováricos a concentraciones fisiológicamente relevantes.
Introduction
El cáncer de ovario es una de las neoplasias malignas ginecológicas más mortíferas y resultó en unas 184.800 muertes en todo el mundo en 20181. Múltiples estudios han demostrado la correlación entre la progresión del cáncer de ovario (es decir, metástasis) y la presencia de CTCs2,3,4. El método más común para la detección y aislamiento de CTCs utiliza el sistema Cellsearch, que se dirige al receptor EpCam5. La expresión EpCam, sin embargo, está regulada en la transición epitelial a mesenquimal, que se ha implicado en la metástasis del cáncer6. A pesar de los avances, las tecnologías clínicas actuales todavía sufren de baja precisión, alto costo y complejidad. Debido a estos inconvenientes, las nuevas tecnologías para el descubrimiento y la enumeración de CTCs ováricos se han convertido en un área importante para la investigación.
Recientemente, PAFC surgió como un método eficaz para la detección no invasiva de células cancerosas, análisis de nanomateriales, y la identificación de bacterias7,8,9. PAFC se diferencia de la citometría de flujo de fluorescencia tradicional mediante la detección de analitos en el flujo mediante la utilización de fotoacústica. El efecto fotoacústico se genera cuando la luz láser es absorbida por un material que provoca la expansión termoelástica, produciendo una onda acústica que puede ser detectada por un transductor de ultrasonido10,11. Las ventajas de PAFC sobre los métodos tradicionales de citometría de flujo incluyen simplicidad, facilidad de traducción a entornos clínicos y detección de CTCs a profundidades sin precedentes en muestras de pacientes12,13. Estudios recientes han utilizado sistemas PAFC para la detección de células utilizando contraste endógeno y exógeno14,15. Para el etiquetado selectivo de células y tejidos, en combinación con imágenes fotoacústicas16,17,18,se han utilizado agentes de contraste de infrarrojo cercano (NIR), como el tinte verde indocyanina, y los NP metálicos (por ejemplo, oro y CuS). Debido a la mejora de la profundidad de penetración de la luz NIR dentro de los tejidos biológicos, la detección fotoacústica de absorbentes se puede realizar a mayores profundidades para aplicaciones clínicas. Debido a su gran potencial de uso en la clínica, la combinación de agentes de contraste NIR dirigidos con PAFC ha generado un interés considerable para la detección de CTCs.
PAFC en combinación con agentes de contraste específicos proporciona un enfoque mejorado para el análisis de alto rendimiento de muestras de pacientes con mayor precisión y detección dirigida de CTCs. Una de las principales estrategias de detección de los CTC es la orientación específica de las proteínas de membrana presentes en la célula de interés. Una característica notable de los CTC ováricos es la sobreexpresión de los receptores de folato ubicados en su membrana externa19. La focalización de los receptores de folato es una estrategia ideal para la identificación de los CTC ováricos en la sangre porque las células endógenas, que tienen una mayor expresión de receptores de ácido fólico, son generalmente luminales y tienen una exposición limitada al torrente sanguíneo20. Los NP de sulfuro de cobre (PP de CuS) han sido reconocidos recientemente por su capacidad para atacar los receptores de folato expresados en células cancerosas21. Combinados con su biocompatibilidad, facilidad de síntesis y absorción profunda en el NIR, estos agentes de contraste NP hacen una estrategia de apuntamiento ideal para la detección de CtCovás que utilizan PAFC.
Este trabajo describe la preparación de los NP FA-CuS y su uso para la detección de células cancerosas de ovario en un sistema de flujo fotoacústico. Los NP de CuS se modifican con ácido fólico para apuntar específicamente a los CTC ováricos y emiten una señal fotoacústica cuando se estimulan con un láser de 1.053 nm. Los resultados indican la detección exitosa de células cancerosas ováricas incubadas con estos agentes de contraste fotoacústicos dentro del sistema PAFC. Estos resultados muestran la detección de células cancerosas de ovario hasta concentraciones de 1 célula/L, y la microscopía de fluorescencia confirma la aceptación exitosa de estas partículas por las células cancerosas de ovario SKOV-322. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la síntesis de LOS NP FA-CuS, la preparación de muestras para la microscopía de fluorescencia, la construcción del sistema de flujo fotoacústico y la detección fotoacústica de células cancerosas ováricas. El método presentado muestra una identificación exitosa de los CTC ováricos en el flujo utilizando NP FA-CuS.
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Protocol
1. Síntesis y funcionalización de nanopartículas
NOTA: La síntesis de los NP FA-CuS se logra utilizando un método de síntesis de un pozo adaptado de un protocolo publicado previamente21.
ADVERTENCIA: Toda la síntesis debe ocurrir en una campana de humo súcto sordo químico ventilada.
- Antes de la síntesis, filtre aproximadamente 300 ml de agua desionizada (DI) a través de un filtro estéril de 0,2 m.
- Limpie un matraz de fondo redondo de vidrio de 250 ml con una solución de detergente y enjuague con agua DI. Añadir 0.0134 g de CuCl2 en 100 mL de agua DI para crear una solución de 1 mM.
- Añadir 0,015 g de ácido fólico (FA) a la solución de CuCl2 y remover durante 5 minutos con una barra de agitación magnética.
- Añadir Na2S-9H2O (0,024 g en agua DI de 100 ml) sobre aproximadamente 10 s a la mezcla de reacción utilizando una pipeta de 200 ml.
NOTA: Tras la adición de la Na2S-9H2O, la solución cambiará de color de un amarillo claro a un marrón oscuro. - Tapar la reacción y colocar en un baño de aceite, ajustado a 90 oC, y continuar revolviendo con una barra de agitación magnética. Después de aproximadamente 15 minutos, o cuando el baño de aceite haya alcanzado los 85 o 90 oC, permita que la reacción continúe durante una hora adicional. Su mezcla debe convertirse gradualmente en un color verde oscuro.
NOTA: Asegúrese de ventilar el sistema mientras calienta la mezcla de reacción para evitar la acumulación de presión. - Retire el recipiente de reacción del baño de aceite y enfríe brevemente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos antes de transferirlo a un baño de hielo.
- Una vez que la mezcla de reacción se haya enfriado por debajo de 20 oC, ajuste el pH a 10 utilizando 1M NaOH para disolver el ácido fólico restante en solución.
- Purificar la mezcla de reacción FA-CuS utilizando una columna de centrifugación de 30 kDa. Agregue la solución en lotes de 15 ml a la columna y centrífuga a 3.082 x g durante 15 min.
- Una vez que toda la mezcla de reacción se ha concentrado, recombine las fracciones concentradas y lave 4 veces con 15 ml de pH 10 NaOH en la columna de centrifugación de 30 kDa.
- Para las mediciones de masa, tome 1/3 de la solución (66 l) y se divida en tres viales de vidrio. Secar en un horno al vacío durante la noche a 40 oC bajo un vacío de 27 mmHg.
- Disolver los otros 2/3 de solución concentrada en 250 ml de PBS y conservara a 4 oC hasta su uso posterior.
- Antes de utilizar los NP FA-CuS, sonicarlos durante 30 minutos en un sonicador de baño en un ajuste alto.
2. Caracterización NP
- Realizar la dispersión de luz dinámica (DLS) Añadir 10 l de NPS FA-CuS concentrado en la solución PBS desde el paso 1.1.14 a 2 mL de agua DI. Antes de la caracterización por DLS, sonicar las partículas durante 30 minutos en un sonicador de baño en un ajuste alto y filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 m para eliminar el polvo residual.
- Realizar microscopía electrónica de transmisión (TEM) : Añadir 10 s de NPS FA-CuS concentrado en solución DE PBS a un pedazo de papel de cera. Invierta una rejilla de cobre recubierta de formvar en la parte superior de la gota y deje sentarse durante 2 minutos. Deje que el aire se seque. Imagen de la red de cobre utilizando un microscopio electrónico a una tensión de aceleración de 80 kV.
NOTA: Los resultados típicos de la caracterización DE FA-CuS NPS se presentan en la Figura 1.
3. Cultivo celular
- Este protocolo utiliza las células SKOV-3. A menos que se indique lo contrario, el cultivo de células SKOV-3 en el medio 5A de McCoy suplementada con 10% FBS, 100 U/ml de penicilina, y 100 g/ml de estreptomicina, y mantener a 37 oC en una incubadora humidificada de 5% CO2.
4. Etiquetado fluorescente de FA-CuS NPS para microscopía
- Añadir éster de succinimidilo De Texas-Red-X (0,2 mg disueltoen en DMSO a una concentración de 10 mg/ml) a una solución que contenga 2 mg de NP FA-CuS en 1 ml de 0,1 M de NaHCO3 (pH n.o 9).
- Revuelva la mezcla de reacción utilizando una barra de agitación magnética durante 1 h, lejos de la luz a temperatura ambiente.
- Concentre la mezcla de reacción en una columna centrifugadora MWCO de 4 ml 30 kDa girando a 4.000 x g durante 10 min.
- Lave la solución concentrada 3x con 4 ml de tampón NaHCO3 de 0,1 M (pH n.o 9) en una columna de centrifugación. Posteriormente, lavar la solución concentrada con 4 ml de agua DI 3x o hasta que sólo una cantidad traza de fluorescencia permanezca visible en el flujo a través de UV-VIS.
5. La aceptación de FA-CuS NPS por células cancerosas de ovario
- Antes de la incubación con NP FA-CuS, incubar células SKOV-3 en un matraz T75 con 8 x 15 ml de medios RPMI-1640 libres de ácido fólico con 10% DE FBS y 1% de penicilina/estreptomicina durante al menos 24 horas.
- Las células de semillas en 0,5 ml de RPMI-1640 libres de ácido fólico completan medios de crecimiento a una densidad de 0,1 x 106 células/ml en una placa de 24 pocillos.
- Al día siguiente, incubar células con 400 g/ml de NPS FA-CuS en 0,5 ml de RPMI-1640 sin ácido fólico medios de crecimiento completos durante 2 h.
- Después de esta incubación, intente que las células con 0,5 ml de 0,25% de trippsina con EDTA. Añadir al menos 1 ml de RPMI-1640 sin ácido fólico medios de crecimiento completos para neutralizar la trippsina, y centrifugar las células a 123 x g durante 6 min.
- Retire el sobrenadante, resuspenda las células en 2 ml de PBS y centrífuga a 123 x g durante 6 min. Realice este paso de lavado 2x para eliminar cualquier NP no enlazado.
- Resuspenda las células en 1 a 2 ml de PBS con una solución de tween del 2%.
- Cuente las células usando un hemocitómetro y un trypan azul. Más células diluidas si el recuento de células es demasiado alto. Diluir las células en PBS con 2% de Tween a la concentración elegida para la detección.
- Las células están ahora listas para ser analizadas por el sistema PAFC.
6. Microscopía de fluorescencia de la aceptación de FA-CuS NPS
- Repita los pasos enumerados en el paso 5.1 y proceda con el protocolo siguiente para la microscopía.
- Células de semilla a una densidad de 0,1 x 106 células/ml en 0,5 ml de RPMI-1640 sin ácido fólico, medios de crecimiento completos en tapas de vidrio en una placa de 24 pocillos.
- Al día siguiente, incubar las células con NP FA-CuS etiquetados fluorescentes en triplicado, a concentraciones de 100 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml y 400 g/ml en 0,5 ml de medios de crecimiento completos RPMI-1640 libres de ácido fólico.
- Incubar las células con los NP durante 2 h en la incubadora de 37oC
- Después de este período de incubación, lave las células 3 veces con PBS.
NOTA: Para todos los pasos de lavado, agregue cuidadosamente la solución en el lado de la placa de pozo para no molestar a las células. Después de la adición, incline cuidadosamente la placa y retire la solución del lado del pozo. - Incubar las células con 0,5 ml de 3,7% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 15 min y transferir los cubreobjetos de vidrio a una nueva placa de 24 pocillos.
ADVERTENCIA: La PFA es un carcinógeno conocido. Haga toda la fijación en una campana de humo sordo químico ventilada y use el equipo de protección personal adecuado. - Incubar las células en una solución de 3.7% PFA con 0.1% Triton-X en PBS durante 5 min.
- Lavar las células con 0,5 ml de PBS 3x durante 5 min cada una y transferir los cubreobjetos a una placa nueva.
- Incubar las células con 0,5 ml de una solución de PBS que contiene DAPI (20 l/ml de una solución de stock de 0,5 mg/ml se utiliza para la tinción) durante 5 minutos, lejos de la luz.
- Lave las células con PBS 3x.
- Después del lavado PBS final, monte los cubreobjetos en los portaobjetos con medio de montaje.
- Las células están listas para ser imágenes mediante microscopía de fluorescencia. La Figura 2 muestra un ejemplo de caracterización celular típica por microscopía de fluorescencia.
7. Arquitectura del sistema de flujo
- Construcción de cámara de flujo
NOTA:Un archivo de SolidWorks de un tanque de flujo impreso en 3D se puede encontrar en Materiales Suplementarios.- Utilizando el archivo SolidWorks proporcionado, imprima en 3D el tanque de flujo utilizando abs termoplástico o plástico PLA. Las cotas se proporcionan a continuación si SolidWorks no está disponible. La figura 3A muestra una representación de este modelo. El cuerpo del tanque de flujo es de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Los extremos lejanos del tanque de flujo incluyen agujeros de aproximadamente 5 mm de diámetro para permitir la entrada de tubos que contienen el tubo capilar.
NOTA: El tanque de flujo tiene un orificio de 1 cm, perpendicular a la orientación del tubo capilar, para la colocación del transductor de ultrasonido. Una extrusión cilíndrica con el mismo diámetro interior que el agujero se extiende 6 mm en el tanque. Para obtener imágenes en tiempo real, el tanque de flujo tiene una ranura de 1 mm x 3 mm directamente debajo del tubo capilar. - Después de imprimir el tanque de flujo 3D, limpie y monte el sistema para su uso.
- Coloque los cubreobjetos de vidrio sobre la ranura de 1 mm x 3 mm y el orificio de 1 cm en el sistema de flujo.
- Selle con cuidado con silicona para evitar fugas.
- Coloque el tubo capilar en los tubos curados con silicona. Inserte los tubos en la cámara de flujo a través del lado del tanque de flujo de tal manera que el tubo capilar de vidrio esté directamente por encima y delante de la ranura de 3 mm y el agujero de 1 cm.
- Selle el tubo con silicona para evitar fugas.
- Utilizando el archivo SolidWorks proporcionado, imprima en 3D el tanque de flujo utilizando abs termoplástico o plástico PLA. Las cotas se proporcionan a continuación si SolidWorks no está disponible. La figura 3A muestra una representación de este modelo. El cuerpo del tanque de flujo es de 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Los extremos lejanos del tanque de flujo incluyen agujeros de aproximadamente 5 mm de diámetro para permitir la entrada de tubos que contienen el tubo capilar.
- Configuración del sistema de flujo fotoacústico
NOTA: La Figura 3B y la Figura 3C muestran un ejemplo de la arquitectura del sistema de flujo.- Conecte el transductor a un pulsador/receptor de ultrasonido. Amplifique la señal con una ganancia de 59 dB.
- Conecte la salida del filtro a un osciloscopio reconfigurable multipropósito equipado con una matriz de compuertas programables de campo integrada.
- Conecte uno de los tubos procedentes de la cámara de flujo a una unión en T, conectada a dos bombas de jeringa en cada rama.
- Llene una de las bombas de jeringa con aire y la otra bomba con la muestra a analizar. Ajuste la bomba que contiene aire a un caudal de 40 l/min y la bomba que contiene la muestra a un caudal de 20 l/min. El flujo bifásico resultante producirá volúmenes de muestra de 1 L. A este caudal, el sistema probará aproximadamente 6,4 muestras por minuto.
NOTA: Para mantener una distribución uniforme de las células, vórtice ligeramente cada muestra inmediatamente antes de ser probada. Además, gire la jeringa cada pocos minutos para evitar que las células se asienten en la solución. - Conecte el tubo restante que sale del sistema de flujo a un recipiente con 10% de lejía, para eliminar las células después de que salgan del sistema de flujo.
NOTA: Antes de utilizar el sistema de flujo, compruebe si hay fugas, ya que pueden afectar al flujo. Las células deben estar contenidas dentro de un sistema cerrado para mantener la seguridad biológica durante el procedimiento. - El diseño del tanque impreso en 3D permite una alineación constante y repetible entre el transductor y la luz láser con una calibración mínima. Cuando se coloca correctamente dentro del tanque personalizado, el tubo capilar de cuarzo garantiza que el transductor y el láser estén alineados directamente.
- Colocar la sección del tubo capilar de cuarzo en alineación directa con el transductor, en el campo de visión del microscopio, permitiendo una colocación cuidadosa de la fibra óptica por encima de la muestra de forma que ilumine toda la anchura del tubo.
- Irradiar la muestra utilizando una fibra óptica que canaliza un láser de estado sólido bombeado por diodos que opera a una longitud de onda de 1.053 nm. El incidente de luz láser en la muestra y el transductor utilizado para medir el efecto fotoacústico están desenfocados.
- La energía del incidente láser en la muestra es de aproximadamente 8 mJ y la velocidad láser de 10 Hz es suficiente para iluminar cada muestra varias veces a medida que pasa a través del sistema.
- Coloque el sistema de flujo encima de un microscopio invertido y asegúrese de que tanto el pulso láser como la trayectoria de la muestra sean visibles a medida que la muestra pasa a través del sistema de flujo. Grabe el flujo con una cámara montada en el microscopio.
- Registre las adquisiciones de ultrasonidos utilizando software de adquisición de datos (ver Tabla de Materiales). Desencadene ultrasonidos y láser pulsado con la FPGA. Utilice PBS con 2% De tween, y NP FA-CuS a una concentración de 100 g/ml en PBS 2% Tween, como controles negativos y positivos, respectivamente.
- Utilizando una cámara montada en el microscopio, grabe tanto la cocción del láser como el paso de muestras a través del sistema de flujo. Estas grabaciones se utilizarán para correlacionar la señal acústica grabada por el transductor con la cocción del láser. A medida que las muestras pasan delante de la cocción del láser, la señal puede ser correlacionada con la señal fotoacústica resultante para su análisis. A una frecuencia de muestreo de 10 Hz, el láser iluminará cada enchufe varias veces.
8. Postprocesamiento
- Para cada adquisición de señal, s(t), calcule la transformación Hilbert, H[s(t)], para crear una señal analítica.
- Crear una envolvente compleja, se(t), calculando la magnitud de
la señal analítica, de modo que e integre la envolvente para medir la señal total resultante de cada adquisición. Compare las señales de cada grupo de prueba (es decir, PBS, células etiquetadas, NP FA-CuS, células solas) utilizando una prueba t en el software estadístico R. Las señales fotoacústicas crudas y sus transformaciones Hilbert se presentan en la Figura 4. - Para la reconstrucción de la imagen, normalice el envolvente complejo en función del pico máximo a lo largo de toda la ejecución. Si compara una serie de corridas, normalice el envolvente complejo utilizando el pico máximo en toda la serie. Después de la normalización, convierta cada adquisición en una serie de valores de píxel. Representar cada serie de valores de píxel como una columna en la reconstrucción de la imagen. Las reconstrucciones representativas de PBS y las señales DE FA-CuS se muestran en la Figura 5,donde ambas imágenes se normalizaron utilizando el pico máximo en ambas corridas.
la señal analítica, de modo que e integre la envolvente para medir la señal total resultante de cada adquisición. Compare las señales de cada grupo de prueba (es decir, PBS, células etiquetadas, NP FA-CuS, células solas) utilizando una prueba t en el software estadístico R. Las señales fotoacústicas crudas y sus transformaciones Hilbert se presentan en la Figura 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1A muestra una imagen TEM típica de las nanopartículas sintetizadas. El tamaño medio de la nanopartícula típica es de aproximadamente 8,6 nm a 2,5 nm. La medición de nanopartículas se realizó en ImageJ. Se aplicaron funciones de umbral y cuenca hidrográfica para separar las partículas para la medición. Los diámetros horizontales y verticales de cada partícula se midieron perpendiculares entre sí y se promediaron aún más. Para el DLS, se muestra una medida representativa en la Figura 1B. El diámetro hidrodinámico promedio de estas partículas es de 73,6 nm. Las nanopartículas de sulfuro de cobre tienen una curva de absorción característica que se extiende en el NIR, como se muestra en la Figura 1C. Hay un ligero artefacto alrededor de 850 nm que fue causado por la conmutación de láseres por el espectrofotómetro.
En la Figura 2se pueden ver imágenes de microscopía de fluorescencia de células incubadas con nanopartículas etiquetadas fluorescentes. La acumulación de nanopartículas se puede visualizar mediante la presencia de fluorescencia en toda la célula. Las células no incubadas con nanopartículas no muestran señal de fluorescencia. La presencia de esta señal de fluorescencia indica la correcta aceptación de las partículas y su capacidad para ser detectadas en el sistema de flujo.
La Figura 3 muestra la configuración general del sistema de flujo fotoacústico. La Figura 3A muestra un modelo detallado de la cámara de flujo 3D. Esta cámara se puede imprimir utilizando el archivo .stl proporcionado con este protocolo. La Figura 3B muestra una visión general de la configuración del tanque de flujo. La Figura 3C muestra una configuración general del tanque de flujo y del sistema de adquisición de datos.
Las señales de adquisición de datos típicas se muestran en la Figura 4. Los datos sin procesar indican las diferencias de señal entre las células etiquetadas con nanopartículas, PBS y NP FA-CuS. Una adquisición es la señal fotoacústica resultante generada a partir de un solo pulso láser. Debido a la rápida velocidad de disparo del láser, cada muestra analizada genera múltiples adquisiciones. Se generó un sobre para cada adquisición individual utilizando la transformación Hilbert. Este sobre se integró para medir la cantidad total de señal generada a partir del pulso láser. En un estudio anterior, estos datos se analizaron utilizando el software estadístico R, donde el número de adquisiciones analizadas para la prueba t fue 203, 150, 160 y 131, para las células con NP, células solas, PBS, y NP solamente,respectivamente 22. Los datos se normalizaron mediante la transformación del registro y se compararon utilizando la prueba t de un Welch en R. Las señales resultantes de los NP FA-CuS solo a una concentración de 100 g/ml mostraron una señal mucho más alta que el control negativo. La diferencia en las señales entre el control negativo y los CTC ováricos etiquetados era más sutil que el control positivo, pero podía detectarse mediante el análisis de sus medios mediante una prueba t22.
Utilizando el software personalizado LabView y MATLAB, se hicieron reconstrucciones de imágenes de los controles positivos y negativos en tiempo real y después de la adquisición, respectivamente. Para generar las reconstrucciones fotoacústicas, se calculó un sobre de cada adquisición utilizando la transformación Hilbert. Los sobres individuales se convirtieron posteriormente en valores de píxel y se mostraron como columnas independientes. Se producen claras diferencias en la señal fotoacústica entre los NP FA-CuS a una concentración de 100 g/ml y la muestra de PBS(Figura 5). Los controles del sistema son importantes de ejecutar para garantizar que el sistema está produciendo adecuadamente una señal fotoacústica que puede ser detectada por el transductor.
Figura 1: Caracterización NP representativa. (A) imagen TEM de los NP SINTETIZAdos FA-CuS. (B) Distribución representativa de la intensidad de DLS de los NP DE FA-CuS sintetizados. (C) Curva de absorción de los NP representativos de FA-CuS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de la microscopía de fluorescencia de las células SKOV-3. Las celdas fueron incubadas con y sin 400 g/ml con etiquetas fluorescentes NPs. Escala de la barra de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas del sistema de citometría de flujo fotoacústico y la cámara de flujo. (A) Vista detallada de la cámara de flujo impresa en 3D. (B) Diagrama del sistema PAFC. (C) Arquitectura del sistema de flujo: SP - bomba de jeringa; DAQ/FPGA - matriz de compuertas programables de adquisición de datos/campo; Ob - lente objetivo; OF - fibra óptica; FC - acoplador de fibra; UT - transductor de ultrasonido; FT - tanque de flujo. Esta figura está adaptada de Lusk et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Señal de datos sin procesar representativa y transformaciones Hilbert de muestras probadas en el sistema de flujo. (A) Señal de datos sin procesar representativa de PBS y células incubadas con NP y la transformación (D) Hilbert de los datos. (B) Señal de datos sin procesar representativa de las células solamente y las células incubadas con NP FA-CuS y (E) la transformación Hilbert de los datos. (C) Señal de datos sin procesar representativa de PBS y 100 g/mL DEP FA-CuS y (F) la transformación Hilbert de los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Reconstrucciones representativas de la imagen fotoacústica de los datos fotoacústicos. (A) Reconstrucción de imágenes de 100 nPs FA-CuS de g/mL y (B) PBS probados dentro del sistema de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 1: STL de Cámara de Flujo. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Este protocolo es un método sencillo para la detección de CtC ováricos utilizando PAFC y un agente de contraste CuS objetivo. Se han explorado muchos métodos para la detección de CTCová, incluidos dispositivos microfluídicos, RT-PCR y citometría de flujo de fluorescencia23,24,25. Estos varían en complejidad, costo y precisión, limitando su eficacia en entornos clínicos. PAFC introduce varias ventajas sobre estos métodos tradicionales para la detección de CTCs, incluyendo la capacidad de detectar CTCs dentro de muestras de pacientes, y su facilidad de traducción a aplicaciones in vivo. También se ha demostrado que el PAFC detecta con precisión los CTC in vitro e in vivo cuando se combina con agentes de contraste dirigidos26,27.
En este trabajo, los agentes de contraste FA-CuS NP fueron evaluados por su capacidad para mejorar la precisión de la detección de CTC en concentraciones fisiológicamente relevantes. Los estudios se realizaron utilizando células aisladas de SKOV-3 resuspendidas en PBS. El análisis por microscopía de fluorescencia indicó la correcta aceptación de estas partículas. Los resultados detectaron células SKOV-3 hasta una concentración de 1 celda/ L22. Los pasos cruciales en este protocolo implican la síntesis de nanopartículas y la alineación de la configuración del flujo fotoacústico. Durante la síntesis de nanopartículas, es importante asegurarse de que la solución ha cambiado un color verde oscuro antes de eliminar la mezcla del baño de aceite. Para el sistema de flujo, es necesario ejecutar un control negativo y positivo, aunque el sistema antes de las pruebas de muestras es necesario para garantizar que el sistema está produciendo una señal fotoacústica adecuada para la detección posterior de células etiquetadas. Durante el funcionamiento del sistema de flujo, es importante asegurarse de que la luz incidente de la fibra óptica está iluminando completamente el tubo capilar, y que el transductor está ajustado contra el lado de la cámara de flujo. Por último, es necesario realizar pruebas rigurosas del sistema en busca de fugas para garantizar la seguridad biológica del sistema y para un flujo constante a través de la cámara.
Para el sistema PAFC actual, los estudios preliminares confirmaron la detección fotoacústica utilizando el transductor y el sistema de amplificación. La mayoría de estas señales estaban compuestas de señales de menor frecuencia (<20 MHz). Se necesitan más estudios para confirmar si esto se debe a la frecuencia real de las señales fotoacústicas generadas o al ancho de banda de 35 MHz del amplificador. Estudios futuros investigarán los componentes de frecuencia de las señales detectadas con el fin de optimizar la frecuencia central del transductor, así como el ancho de banda del sistema de amplificación. El sistema actual es específicamente adecuado para la detección ex vivo de CTCs. Sin embargo, este método identifica el potencial para la aplicación futura de los NP FA-CuS in vivo.
Estudios futuros tienen como objetivo detectar células cancerosas de ovario dentro de cultivos mixtos, muestras clínicas humanas y modelos in vivo28,29,30. Además, estudios futuros examinarán la especificidad de estas nanopartículas frente a los controles no dirigidos. La validación futura de este método incluirá la prueba de esta herramienta con muestras clínicas humanas, la implementación de pruebas y análisis de alto rendimiento y la traducción a entornos clínicos. Esta técnica fotoacústica muestra el potencial de futura traducción a una amplia variedad de aplicaciones clínicas y enfermedades en una amplia gama de agentes de contraste y analitos. La detección fotoacústica de analitos que utilizan PAFC tiene el potencial de hacer que la detección en el punto de atención de los CTC y otros patógenos sea más rápida y económica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
A los autores les gustaría reconocer a Madeleine Howell por su ayuda con la síntesis, Matthew Chest por su ayuda para diseñar el sistema de flujo, y Ethan Marschall para ayudar con SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
