Summary
Ett protokoll presenteras för att upptäcka cirkulerande äggstocks tumörceller med hjälp av en skräddarsydd Fotoakustisk flöde system och riktade folsyra-täckta koppar sulfid nanopartiklar.
Abstract
Många studier tyder på att uppräkning av cirkulerande tumörceller (CTCs) kan visa löfte som ett prognostiskt verktyg för äggstockscancer. Aktuella strategier för detektion av ctcs inkluderar flödescytometri, mikroflödessystem enheter, och realtid polymeras kedjereaktion (RT-PCR). Trots de senaste framstegen, metoder för detektion av tidig äggstockscancer metastaser saknar fortfarande den känslighet och specificitet som krävs för klinisk översättning. Här, en ny metod presenteras för detektion av ovariella cirkulerande tumörceller av photoacoustic Flow flödescytometrianalys (pafc) utnyttjar en anpassad tredimensionell (3D) tryckt system, inklusive en flödes kammare och spruta pump. Denna metod använder folsyra-utjämnade koppar sulfid nanopartiklar (FA-CuS NPs) att rikta SKOV-3 äggstockscancer celler av PAFC. Detta arbete visar affinitet av dessa kontrastmedel för äggstockscancer celler. Resultaten visar NP-karakterisering, PAFC-detektion och NP-upptag genom fluorescensmikroskopi, vilket visar potentialen hos detta nya system för att detektera äggstocks-CTCs vid fysiologiskt relevanta koncentrationer.
Introduction
Äggstockscancer är en av de dödligaste gynekologiska maligniteter och resulterade i uppskattningsvis 184 800 dödsfall över hela världen i 20181. Flera studier har visat sambandet mellan äggstockscancer progression (dvs., metastaser) och närvaron av ctcs2,3,4. Den vanligaste metoden för detektion och isolering av CTCs utnyttjar CELLSEARCH-systemet, som är inriktat på EpCam-receptorn5. EpCam uttryck, emellertid, är nedreglerad i epitelial till mesenkymala övergång, som har varit inblandad i cancermetastaser6. Trots framstegen lider den nuvarande kliniska tekniken fortfarande av låg noggrannhet, höga kostnader och komplexitet. På grund av dessa nackdelar har ny teknik för upptäckt och uppräkning av äggstocks-CTCs blivit ett viktigt forskningsområde.
Nyligen framträdde pafc som en effektiv metod för noninvasiv detektion av cancerceller, analys av nanomaterial, och identifiering av bakterier7,8,9. PAFC skiljer sig från traditionell fluorescensflödescytometri genom att detektera analyter i flödet genom att använda fotoakustik. Den fotoakustiska effekten genereras när laserljus absorberas av ett material som orsakar termoelastisk expansion, som producerar en akustisk våg som kan detekteras av en ultraljudsgivare10,11. Fördelarna med pafc över traditionella flödescytometri metoder inkluderar enkelhet, enkel översättning till kliniska inställningar, och detektion av ctcs på exempellösa djup i patientprover12,13. Nyligen genomförda studier har utnyttjat pafc-system för detektion av celler med endogena och EXOGEN kontrast14,15. Nära infraröd (NIR) ljus-absorberande kontrastmedel såsom indocyaningrönt grön färg, och metall NPS (t. ex., guld och CUS) har använts för selektiv märkning av celler och vävnader i kombination med Fotoakustisk avbildning16,17,18. På grund av det förbättrade penetrationsdjupet av NIR-ljus inom biologiska vävnader kan Fotoakustisk detektering av absorbenter utföras på större djup för kliniska tillämpningar. På grund av sin stora potential för användning på kliniken, har kombinationen av riktade NIR kontrastmedel med PAFC genererat stort intresse för detektion av CTCs.
PAFC i kombination med riktade kontrastmedel ger en förbättrad metod för högt genomflöde analys av patientprover med förbättrad noggrannhet och riktad detektion av CTCs. En av de viktigaste detektions strategierna för CTCs är den specifika inriktningen av membranproteiner som finns på cellen av intresse. Ett anmärkningsvärt kännetecken för äggstockarna CTCs är överuttryck av folat receptorer ligger på deras yttre membran19. Folat receptor inriktning är en idealisk strategi för identifiering av äggstockarna CTCs i blodet eftersom endogena celler, som har högre uttryck av folsyra receptorer, är i allmänhet luminala och har begränsad exponering för blodomloppet20. Koppar sulfid NPs (CuS NPs) har nyligen erkänts för deras förmåga att rikta folat receptorer uttryckt på cancerceller21. Kombinerat med deras biokompatibilitet, enkel syntes, och absorption djupt i NIR, dessa NP kontrastmedel gör en idealisk inriktning strategi för detektion av äggstockscancer CTCs utnyttjar PAFC.
Detta arbete beskriver utarbetandet av FA-CuS NPs och deras användning för detektion av äggstockscancer celler i ett foto akustiskt flöde system. CuS NPs modifieras med folsyra för att specifikt rikta äggstocks-CTCs och avge en Fotoakustisk signal när den stimuleras med en 1 053 nm-Laser. Resultaten visar att den framgångsrika upptäckten av äggstockscancer celler inkuberas med dessa foto akustiska kontrastmedel inom PAFC-systemet. Dessa resultat visar detektion av äggstockscancer celler ner till koncentrationer av 1 cell/μL, och fluorescens mikroskopi bekräftar framgångsrikt upptag av dessa partiklar av SKOV-3 äggstockscancer celler22. Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av FA-CuS NPs syntes, beredning av prover för fluorescens mikroskopi, konstruktion av photoacoustic Flow system, och Fotoakustisk detektering av äggstockscancer celler. Den presenterade metoden visar framgångsrik identifiering av äggstocks-CTCs i flödet med hjälp av FA-CuS NPs. framtida arbete kommer att inriktas på den kliniska tillämpningen av denna teknik mot tidig upptäckt av äggstockscancer metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nanopartikelsyntes och funktionalisering
Anmärkning: syntes av FA-CuS NPs uppnås med hjälp av en en Pot syntesmetod som anpassats från en tidigare publicerad protokoll21.
Varning: all syntes ska ske i en ventilerad kemisk draghuv.
- Före syntesen, filtrera cirka 300 mL avjoniserat (DI) vatten om ett 0,2 μm sterilt filter.
- Rengör en 250 mL glas rund botten flaska med en rengöringsmedelslösning och skölj med DI-vatten. Tillsätt 0,0134 g CuCl2 i 100 ml di-vatten för att skapa en 1 mm lösning.
- Tillsätt 0,015 g folsyra (FA) till CuCl2 lösningen och rör om ~ 5 min med hjälp av en magnetisk rör bar.
- Tillsätt na2s · 9h2O (0,024 g i 100 μl di vatten) över cirka 10 s till reaktionsblandningen som utnyttjar en 200 μl pipett.
Anmärkning: vid tillsättning av na2S · 9h2O, lösningen kommer att ändra färg från en ljusgul till en mörkbrun. - Locket reaktionen och placera i ett oljebad, inställd på 90 ° c, och fortsätt omrörning med en magnetisk rör bar. Efter ca 15 min, eller när oljebadet har nått 85 − 90 ° c, låt reaktionen fortsätta ytterligare en timme. Din blandning bör gradvis övergå till en mörkgrön färg.
Obs: se till att ventilera systemet under upphettning reaktionsblandningen för att undvika tryck uppbyggd. - Ta bort reaktionskärlet från oljebadet och kort kyla i rumstemperatur i ca 10 till 15 min innan du överför till ett isbad.
- När reaktionsblandningen har svalnat under 20 ° c, justera pH till 10 utnyttjar 1M NaOH att lösa upp den återstående folsyra i lösning.
- Rengör FA-CuS reaktionsblandning med hjälp av en 30 kDa centrifugering kolonn. Tillsätt lösning i 15 mL partier till kolonnen och centrifugera vid 3 082 x g i 15 min.
- När alla reaktionsblandningen har koncentrerats, återförena koncentrerade fraktioner och tvätta 4x med 15 mL pH 10 NaOH i 30 kDa centrifugering kolumn.
- För Mass mätningar, ta 1/3 av lösningen (~ 66 μL) och uppdelad i tre injektionsflaskor av glas. Torka i en vakuumugn över natten vid 40 ° c under ett vakuum på ~ 27 mmHg.
- Lös upp den andra 2/3 av koncentrerad lösning i 250 μL PBS och förvara den vid 4 ° c tills den används ytterligare.
- Innan du använder FA-CUS NPS, Sonikera dem för 30 min i ett bad någon sonikator på en hög inställning.
2. NP-karaktärisering
- Utför dynamisk ljusspridning (DLS) tillsätt 10 μL koncentrerad FA-CuS NPS i PBS-lösning från steg 1.1.14 till 2 mL DI-vatten. Före karakterisering av DLS, Sonikera partiklarna för 30 min i ett bad någon sonikator på en hög inställning och filtrera genom ett 0,2 μm sterilt filter för att ta bort kvarvarande damm.
- Utför transmissionselektronmikroskopi (TEM): tillsätt 10 μL koncentrerad FA-CuS NPS i PBS-lösning till en bit vax papper. Invertera en formvar belagd koppar rutnät på toppen av dropp och låt sitta i 2 min. Vidrör kanten på det formvar-belagda rutnätet till en bit filtrerpapper för att avlägsna överflödig vätska. Låt lufttorka. Bild kopparnätet använder ett elektronmikroskop vid en accelererande spänning på 80 kV.
Anmärkning: typiska resultat från FA-CuS NPS karaktärisering presenteras i figur 1.
3. cell odling
- Detta protokoll utnyttjar SKOV-3 celler. Om inte annat anges, kultur SKOV-3 celler i McCoy ' s 5A medium kompletteras med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, och 100 μg/mL streptomycin, och underhålla vid 37 ° c i en fuktad 5% CO2 inkubator.
4. fluorescerande märkning av FA-CuS NPS för mikroskopi
- Lägg till Texas-Red-X succinimidyl Ester (0,2 mg upplöst i DMSO vid en koncentration av 10 mg/mL) till en lösning som innehåller 2 mg FA-CuS NPs i 1 mL 0,1 M NaHCO3 (pH ~ 9) buffert.
- Rör reaktionsblandningen med hjälp av en magnetisk röra bar för 1 h, bort från ljus vid rumstemperatur.
- Koncentrera reaktionsblandningen i en 4 mL 30 kDa MWCO centrifugering kolumn genom att snurra på 4 000 x g i 10 min.
- Tvätta den koncentrerade lösningen 3x med 4 mL 0,1 M NaHCO3 buffert (pH ~ 9) i en centrifugeringskolonn. Tvätta därefter den koncentrerade lösningen med 4 mL DI-vatten 3x eller tills endast en spår mängd fluorescens är synlig i flödet genom UV-VIS.
5. FA-CuS NPS upptag av äggstocks cancer celler
- Före inkubering med FA-CuS NPs, inkubera SKOV-3-celler i en T75 kolv med 8 − 15 mL folsyra-fri RPMI-1640-media med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin i minst 24 timmar.
- Frö celler i 0,5 mL folsyra-fri RPMI-1640 kompletta tillväxtmedia med en densitet av 0,1 x 106 celler/ml i en 24 brunn tallrik.
- Följande dag, inkubera celler med 400 μg/mL FA-CuS NPS i 0,5 mL folsyra-fri RPMI-1640 kompletta tillväxtmedia för 2 h.
- Efter denna inkubering, trypsinize cellerna med 0,5 mL av 0,25% trypsin med EDTA. Tillsätt minst 1 mL folsyra-fri RPMI-1640 komplett tillväxtmedia för att neutralisera trypsin, och centrifugera cellerna vid 123 x g för 6 min.
- Ta bort supernatanten, Omsuspendera cellerna i 2 mL PBS och centrifugera vid 123 x g under 6 min. utför detta tvättsteg 2x för att ta bort alla obundna NPS.
- Omsuspendera cellerna i 1 − 2 mL PBS med 2% Tween-lösning.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern och trypan blå. Späda ut celler om cell antalet är för högt. Späd ut celler i PBS med 2% Tween till den valda koncentrationen för detektion.
- Cellerna är nu redo att analyseras av PAFC-systemet.
6. fluorescens mikroskopi av FA-CuS NPS upptag
- Upprepa steg som anges i steg 5,1 och fortsätt med protokoll nedan för mikroskopi.
- Frö celler med en densitet av 0,1 x 106 celler/ml i 0,5 ml folsyra-fri rpmi-1640 komplett tillväxt media på glas täckband i en 24 väl tallrik.
- Följande dag, inkubera cellerna med Fluorescent taggade FA-CuS NPs i tre exemplar, vid koncentrationer av 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, och 400 μg/mL i 0,5 mL folsyra-fri RPMI-1640 kompletta tillväxtmedia.
- Inkubera cellerna med NPs för 2 h i inkubatorn 37 ° c
- Efter denna inkubationstid, tvätta cellerna 3x med PBS.
Anmärkning: för alla tvättsteg, tillsätt försiktigt lösningen på sidan av brunnen plattan för att inte störa cellerna. Efter tillsats, försiktigt luta plattan och dra tillbaka lösningen från sidan av brunnen. - Inkubera cellerna med 0,5 mL av 3,7% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 15 min och överför glas täckplattorna till en ny 24 bra tallrik.
FÖRSIKTIGHET: PFA är en känd carcinogen. Utför all fixering i en ventilerad kemisk draghuv och Använd lämplig personlig skyddsutrustning. - Inkubera cellerna i en lösning av 3,7% PFA med 0,1% Triton-X i PBS för 5 min.
- Tvätta cellerna med 0,5 mL PBS 3x för 5 min vardera och överför täckglas till en ny tallrik.
- Inkubera cellerna med 0,5 mL av en PBS-lösning som innehåller DAPI (20 μL/mL av en 0,5 mg/mL stamlösning används för färgning) i 5 min, bort från ljus.
- Tvätta cellerna med PBS 3x.
- Efter den slutliga PBS tvätta, montera täckglas på diabilder med monteringsmedel.
- Cellerna är nu redo att avbildas med fluorescens mikroskopi. Figur 2 visar ett exempel på typisk cellkaraktärisering av fluorescensmikroskopi.
7. flödes system arkitektur
- Flöde kammare konstruktion
Obs: en SolidWorks-fil med en 3D-tryckt flödes tank finns i tilläggs materialen.- Med hjälp av den medföljande SolidWorks-filen, 3D skriva ut flödes tanken med ABS termoplast eller PLA plast. Dimensioner anges nedan om SolidWorks inte är tillgänglig. Figur 3a visar en representation av denna modell. Flödes tankens kropp är 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De bortre ändarna av flödes tanken inkluderar hål ca 5 mm i diameter för att möjliggöra inmatning av slangar som innehåller kapillärröret.
Anmärkning: flödes tanken har en 1 cm hål, vinkelrätt mot orientering av kapillärröret, för placering av ultraljud givaren. En cylindrisk extrudering med samma innerdiameter som hålet sträcker sig 6 mm in i tanken. För bildtagning i realtid har flödes tanken en 1 mm x 3 mm-kortplats direkt under kapillärröret. - Efter utskrift av 3D-flödestanken, rengör och montera systemet för användning.
- Placera glas täckband över 1 mm x 3 mm springan och 1 cm hålet i flödes systemet.
- Täta försiktigt med silikon för att förhindra läckage.
- Montera kapillärröret i de silikonhärdade rören. För in rören i flödes kammaren även om sidan av flödes tanken så att glaset kapillärröret är direkt ovanför och framför 3 mm facket och 1 cm hål.
- Täta slangen med silikon för att förhindra läckage.
- Med hjälp av den medföljande SolidWorks-filen, 3D skriva ut flödes tanken med ABS termoplast eller PLA plast. Dimensioner anges nedan om SolidWorks inte är tillgänglig. Figur 3a visar en representation av denna modell. Flödes tankens kropp är 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. De bortre ändarna av flödes tanken inkluderar hål ca 5 mm i diameter för att möjliggöra inmatning av slangar som innehåller kapillärröret.
- Inställning av fotoakustiskt flödessystem
Anm.: figur 3B och figur 3C visar ett exempel på flödessystem arkitekturen.- Anslut givaren till en ultraljudspulser/mottagare. Amplifiera signalen med en 59 dB förstärkning.
- Anslut utgången av filtret till en mångsidig omkonfigurerbart oscilloskop utrustad med en inbyggd fält programmerbar grind array.
- Anslut en av rören som kommer från flödes kammaren till en T-korsning, ansluten till två sprutpumpar på varje gren.
- Fyll en av sprutpumparna med luft och den andra pumpen med provet som ska analyseras. Ställ in pumpen som innehåller luft till en flödeshastighet av 40 μL/min och den pump som innehåller provet till en flödeshastighet av 20 μL/min. Det resulterande tvåfasflödet kommer att producera provvolymer på 1 μL. Vid denna flödeshastighet kommer systemet att testa cirka 6,4 prover per minut.
Obs: för att bibehålla en jämn fördelning av celler, skaka försiktigt varje prov omedelbart innan det testas. Rotera dessutom sprutan med några minuters mellanrum för att förhindra att cellerna sedimentera i lösningen. - Anslut den återstående röret lämnar flödet systemet till en behållare med 10% blekmedel, att avyttra celler efter att de lämnar flödet systemet.
Obs: innan du använder flödes systemet, kontrollera om läckor, eftersom dessa kan påverka flödet. Celler måste ingå i ett slutet system för att bibehålla biologisk säkerhet under förfarandet. - Utformningen av 3D-tryckta tanken möjliggör konsekvent och upprepningsbar justering mellan givaren och laserljus med minimal kalibrering. När den placeras korrekt i den anpassade tanken, kvarts kapillärröret säkerställer att givaren och lasern är direkt inriktade.
- Placera avsnittet av kvarts kapillärröret i direkt linje med givaren, inom synfältet av mikroskopet, vilket möjliggör noggrann placering av den optiska fiber ovanför provet så att det lyser upp hela bredden av röret.
- Bestråla provet med hjälp av en optisk fiber kanalisera en diodpumpad Solid State laser som fungerar på en våglängd av 1 053 nm. Laserljus incidenten på provet och givaren som används för att mäta den fotoakustiska effekten är båda ofokuserad.
- Energin i laser incidenten på provet är ungefär 8 mJ och den 10 Hz laser hastigheten är tillräcklig för att belysa varje prov flera gånger när den passerar genom systemet.
- Placera flödes systemet ovanpå ett inverterat Mikroskop och se till att både laserpulsen och provets Stig syns när provet passerar genom flödes systemet. Rekord flöde med hjälp av en Mikroskop monterad kamera.
- Registrera ultraljud förvärv utnyttjar datainsamling programvara (se tabell över material). Utlösa ultraljud och pulsad laser med hjälp av FPGA. Använda PBS med 2% Tween, och FA-CuS NPs vid en koncentration av 100 μg/mL i PBS 2% Tween, som negativa och positiva kontroller, respektive.
- Använda ett Mikroskop monterade kamera, spela in både bränning av lasern och passage av prover om flödet systemet. Dessa inspelningar kommer att utnyttjas för att korrelera den akustiska signalen registreras av givaren med bränning av lasern. Eftersom proverna passerar framför bränningen av lasern, kan signalen sedan korreleras till den resulterande foto akustiska signalen för analys. Vid en samplingsfrekvens på 10 Hz kommer lasern att lysa upp varje plugg flera gånger.
8. efter behandling
- För varje signalera förvärvet, s (t), beräkna Hilbert omformningen, H [s (t)], för att skapa ett analytic signalerar.
- Skapa ett komplext kuvert, se(t), genom att beräkna omfattningen av den analytiska signalen, så att
och integrera kuvertet för att mäta den totala signalen till följd av varje förvärv. Jämför signalerna från varje testgrupp (dvs. PBS, taggade celler, FA-CuS NPs, enbart celler) med hjälp av ett t-test i R statistisk programvara. RAW foto akustiska signaler och deras Hilbert transformer presenteras i figur 4. - För bild rekonstruktion, normalisera det komplexa kuvertet baserat på maximal topp över hela körningen. Om du jämför en serie körningar, normalisera komplexa kuvert med maximal topp över hela serien. Efter normalisering konverterar du varje anskaffning till en serie pixelvärden. Representera varje serie av pixelvärden som en kolumn i bild rekonstruktion. Representativa rekonstruktioner av PBS och FA-CuS NPs-signalerna visas i figur 5, där båda bilderna normaliserades med maximal höjd över båda körningarna.
och integrera kuvertet för att mäta den totala signalen till följd av varje förvärv. Jämför signalerna från varje testgrupp (dvs. PBS, taggade celler, FA-CuS NPs, enbart celler) med hjälp av ett t-test i R statistisk programvara. RAW foto akustiska signaler och deras Hilbert transformer presenteras i figur 4.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a visar en typisk tem-bild av de syntetiserade nanopartiklarna. Den genomsnittliga storleken på den typiska nanopartikeln är ca 8,6 Nm ± 2,5 nm. Nanopartikelmätning utfördes i ImageJ. Gräns-och vattendelningsfunktioner tillämpades för att separera partiklarna för mätning. De horisontella och vertikala diametrarna av varje partikel mättes vinkelräta mot varandra och ytterligare i genomsnitt. För DLS visas en representativ mätning i figur 1B. Den genomsnittliga hydrodynamiska diametern för dessa partiklar är 73,6 Nm. Koppar svavelväte nanopartiklar har en karakteristisk absorbanskurva som sträcker sig in i NIR, som visas i figur 1C. Det finns en liten artefakt runt 850 nm som orsakades av byte av lasrar av spektrofotometer.
Fluorescens-mikroskopi bilder av celler som inkuberas med Fluorescent taggade nanopartiklar kan ses i figur 2. Nanopartikelupptag kan visualiseras genom närvaron av fluorescens över cellen. Celler som inte inkuberas med nanopartiklar visar ingen fluorescenssignal. Närvaron av denna fluorescenssignal indikerar ett lyckat upptag av partiklarna och deras förmåga att upptäckas i flödes systemet.
Figur 3 visar den generella inställningen av det foto akustiska flödes systemet. Figur 3a visar en detaljerad modell av 3D-flödeskammaren. Denna kammare kan skrivas ut med hjälp av. stl-filen som medföljer detta protokoll. Bild 3B visar en översikt över inställning av flödes tanken. Figur 3C visar en allmän inställning av flödes tanken och datainsamlingssystemet.
Typiska datainsamlings signaler visas i figur 4. Rådata indikerar skillnaderna i signal mellan nanopartiklar-märkta celler, PBS och FA-CUS NPS. Ett förvärv är den resulterande foto akustiska signalen som genereras från en enda laserpuls. På grund av den snabba bränning hastighet av lasern, varje prov analyseras genererar flera förvärv. Ett kuvert för varje enskilt förvärv genererades med hjälp av Hilbert Transform. Detta kuvert integrerades för att mäta den totala mängden signal som genereras från laserpulsen. I en tidigare studie analyserades dessa data med hjälp av R statistisk programvara, där antalet förvärv som analyserades för t-testet var 203, 150, 160 och 131, för celler med NPs, enbart celler, PBS och NPs ensamt, respektive22. Uppgifterna normaliserades genom log transformation och jämfördes med ett Welch t-test i R. Signalerna från FA-CuS NPs ensamt vid en koncentration av 100 μg/mL visade en mycket högre signal än den negativa kontrollen. Skillnaden i signalerna mellan den negativa kontrollen och de taggade äggstockarna CTCs var mer subtila än den positiva kontrollen, men kunde upptäckas genom analys av deras medel genom ett t-test22.
Använda anpassade LabView och MATLAB programvara, bild rekonstruktioner gjordes av positiva och negativa kontroller i realtid och efter förvärvet, respektive. För att generera foto akustiska rekonstruktioner, var ett kuvert av varje förvärv beräknas med hjälp av Hilbert Transform. Enskilda kuvert omvandlades därefter till pixelvärden och visades som oberoende kolumner. Tydliga skillnader i Fotoakustisk signal förekommer mellan FA-CuS NPs vid en koncentration av 100 μg/mL och PBS-provet (figur 5). Kontroller för systemet är viktiga att köra för att säkerställa att systemet är tillräckligt producerar Fotoakustisk signal som kan detekteras av givaren.
Figur 1: representativ NP-karakterisering. (A) tem bild av SYNTETISERADE FA-CUS NPS. Scale bar = 50 nm. Brepresentativ fördelning av DLS-intensitet av SYNTETISERADE FA-CUS NPS.Crepresentativ absorbanskurva för FA-CUS NPS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa fluorescensmikroskopi bilder av SKOV-3 celler. Cellerna inkuberades med och utan 400 μg/mL fluorescently-taggade NPs. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa bilder av fotoakustiskt flödescytometrisystem och flödes kammare. (A) detaljerad bild av 3D-tryckta flödes kammaren. B) diagram över pafc-systemet. (C) flödessystem arkitektur: SP = sprutpump; DAQ/FPGA = datainsamling/fält programmerbar grind array; OB = objektiv med objektiv; AV = optisk fiber; FC = fiber kopplare; UT = ultraljud givare; FT = flödes tank. Denna siffra är anpassad från Lusk et al.22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativ rådata signal och Hilbert-transformationer av prov som testats i flödes systemet. (A) representativ rådata signal från PBS och celler som inkuberas med NPS och (D) Hilberts transformering av data. B) representativ rådata signal från cellerna ensamma och de celler som inkuberas med FA-CUS NPS och (E) Hilberts transformering av data. Crepresentativ rådata signal från PBS och 100 μg/ml FA-CUS NPS ochFHilberts transformering av data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa foto akustiska bild rekonstruktioner av foto akustiska data. (A) bild rekonstruktion av 100 μg/ml FA-CUS NPS och (B) PBS testad inom flödes systemet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: flödes kammare stl. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är en enkel metod för detektion av äggstocks-CTCs använder PAFC och en riktad CuS kontrastmedel. Många metoder har utforskats för detektion av äggstocks-ctcs, inklusive mikroflödessystem enheter, RT-PCR, och fluorescens flödescytometri23,24,25. Dessa intervall i komplexitet, kostnad och noggrannhet, begränsa deras effektivitet i kliniska inställningar. PAFC introducerar flera fördelar jämfört med dessa traditionella metoder för detektion av CTCs, inklusive möjligheten att detektera CTCs inom patientprover, och dess enkla översättning till in vivo-applikationer. Pafc har också visats att exakt detektera ctcs in vitro och in vivo i kombination med riktade kontrastmedel26,27.
I detta arbete utvärderades FA-CuS NP-kontrastmedel för deras förmåga att förbättra noggrannheten för CTC-detektion vid fysiologiskt relevanta koncentrationer. Studier utfördes med isolerade SKOV-3-celler som återsuspenderas i PBS. Analys av fluorescensmikroskopi indikerade ett lyckat upptag av dessa partiklar. Resultaten upptäcktes SKOV-3 celler ner till en koncentration av 1 cell/μL22. Viktiga steg i detta protokoll involverar nanopartikelsyntesen och anpassningen av den foto akustiska flödesinställningen. Under nanopartikel syntes är det viktigt att se till att lösningen har vänt en mörkgrön färg innan du tar bort blandningen från oljebadet. För flödes systemet, kör en negativ och positiv kontroll även om systemet före prov testning är nödvändigt för att säkerställa att systemet producerar tillräcklig Fotoakustisk signal för efterföljande detektering av märkta celler. Medan du kör flödes systemet, är det viktigt att se till att infallande ljus från fiberoptik är helt lysande kapillärröret, och att givaren är tätt mot sidan av flödet kammaren. Slutligen krävs noggranna tester av systemet för läckage för att säkerställa systemets biologiska säkerhet och för ett jämnt flöde genom kammaren.
För det nuvarande PAFC-systemet bekräftade preliminära studier Fotoakustisk detektering med hjälp av givaren och förstärknings systemet. Majoriteten av dessa signaler bestod av lägre frekvenssignaler (< 20 MHz). Ytterligare studier behövs för att bekräfta om detta beror på den faktiska frekvensen av de genererade foto akustiska signalerna eller 35 MHz bandbredd av förstärkaren. Framtida studier kommer att undersöka frekvens komponenterna i de upptäckta signalerna för att optimera givarens centrala frekvens samt bandbredden för förstärknings systemet. Det nuvarande systemet lämpar sig särskilt för ex vivo-detektion av CTCs. Denna metod identifierar dock potentialen för framtida tillämpning av FA-CuS NPs in vivo.
Framtidsstudier syftar till att detektera äggstockscancer celler inom blandade kulturer, humana kliniska prover, och in vivo modeller28,29,30. Vidare kommer framtida studier att undersöka specificiteten hos dessa nanopartiklar kontra icke-riktade kontroller. Framtida validering av denna metod kommer att omfatta testa detta verktyg med humana kliniska prover, implementering av hög genomströmning testning och analys, och översättning till kliniska inställningar. Denna foto akustiska teknik visar potential för framtida översättning till en mängd olika kliniska tillämpningar och sjukdomar över en rad kontrastmedel och analyter. Fotoakustisk detektion av analyter som utnyttjar PAFC har potential att göra Point-of-Care detektion av CTCs och andra patogener snabbare och billigare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna Madeleine Howell för hennes hjälp med syntes, Matthew Chest för hans hjälp med att designa Flow system, och Ethan Marschall för hjälp med SolidWorks.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
