Summary
Özel yapım fotoakustik akış sistemi ve hedeflenen folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri kullanarak dolaşan yumurtalık tümör hücrelerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Birçok çalışma, dolaşımdaki tümör hücrelerinin numaralandırma öneririz (CtCs) yumurtalık kanseri için prognostik bir araç olarak umut gösterebilir. CtCs tespiti için mevcut stratejiler akış sitometrisi, mikroakışkan cihazlar ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) içerir. Son gelişmelere rağmen, erken yumurtalık kanseri metastazı tespiti için yöntemler hala klinik çeviri için gerekli duyarlılık ve özgüllük eksikliği. Burada, bir akış odası ve şırınga pompası da dahil olmak üzere özel bir üç boyutlu (3D) baskılı sistem kullanarak fotoakustik akış sitometri (PAFC) ile yumurtalık dolaşan tümör hücrelerinin tespiti için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem PAFC tarafından SKOV-3 yumurtalık kanseri hücrelerini hedeflemek için folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri (FA-CuS NPs) kullanır. Bu çalışma yumurtalık kanseri hücreleri için bu kontrast ajanların yakınlık göstermektedir. Sonuçlar, floresan mikroskobu ile NP karakterizasyonu, PAFC saptama ve NP alımını göstererek, bu yeni sistemin yumurtalık CtC'lerini fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda tespit etme potansiyelini göstermektedir.
Introduction
Yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik malignitelerden biridir ve 2018 yılında dünya çapında tahmini 184.800 ölümle sonuçlanmıştır1. Birden fazla çalışma yumurtalık kanseri ilerlemesi arasındaki korelasyon göstermiştir (yani, metastaz) ve CTCs varlığı2,3,4. CtCs algılama ve izolasyon için en yaygın yöntem EpCam reseptörüreseptör 5hedefleyen Cellsearch sistemi kullanır. EpCam ekspresyonu, ancak, mezenkimal geçiş epitelyal indirgenmiş, hangi kanser metastazı karıştığı olmuştur6. Gelişmelere rağmen, mevcut klinik teknolojiler hala düşük doğruluk, yüksek maliyet ve karmaşıklık muzdarip. Bu sakıncalar nedeniyle, yumurtalık CtCs keşfi ve numaralandırma için yeni teknolojiler araştırma için önemli bir alan haline gelmiştir.
Son zamanlarda, PAFC kanser hücrelerinin noninvaziv tespiti için etkili bir yöntem olarak ortaya çıktı, nanomalzemelerin analizi, ve bakterilerin belirlenmesi7,8,9. PAFC fotoakustik kullanarak akış analitleri algılayarak geleneksel floresan akış sitometrisinden farklıdır. Fotoakustik etki lazer ışığı termoelastik genişlemeye neden olan bir malzeme tarafından emildiğinde oluşturulur, bir ultrason transdüser tarafından tespit edilebilir bir akustik dalga üreten10,11. PAFC'nin geleneksel akış sitometri yöntemlerine göre avantajları arasında basitlik, klinik ayarlara çeviri kolaylığı ve hasta örneklerinde daha önce görülmemiş derinliklerde CTC'lerin saptanması12,13. Son çalışmalar da endojen ve eksojen kontrast14,15kullanarak hücrelerin tespiti için PAFC sistemleri kullanılmıştır. Yakın kızılötesi (NIR) indocyanine yeşil boya gibi ışık emici kontrast ajanlar, ve metal NPs (örneğin, altın ve CuS) fotoakustik görüntüleme ile birlikte hücre ve dokuların seçici etiketleme için kullanılmıştır16,17,18. Biyolojik dokularda NIR ışığının penetrasyon derinliğinin artması sayesinde, emicilerin fotoakustik tespiti klinik uygulamalar için daha büyük derinliklerde yapılabilir. Klinikte kullanım için büyük potansiyeli nedeniyle, PAFC ile hedeflenen NIR kontrast ajanların kombinasyonu CTCs tespiti için önemli bir ilgi yarattı.
PAFC, hedeflenen kontrast ajanlarla birlikte hasta numunelerinin yüksek iş lenme analizi için geliştirilmiş bir yaklaşım sağlar ve CTC'lerin hedefli tespiti ile hasta numunelerinin hedefli saptanması sağlar. CtC'ler için temel algılama stratejilerinden biri, ilgi hücresinde bulunan membran proteinlerinin özel hedeflemesidir. Yumurtalık CtCs bir önemli özelliği kendi dış membran üzerinde bulunan folat reseptörlerinin aşırı ekspresyonu19. Fotrik reseptör hedefleme kanda yumurtalık CtCs belirlenmesi için ideal bir stratejidir çünkü endojen hücreler, folik asit reseptörlerinin yüksek ekspresyonu var, genellikle luminal ve kan dolaşımına sınırlı maruz kalma var20. Bakır sülfür NPs (CuS NPs) son zamanlarda kanserli hücreler üzerinde ifade folat reseptörleri hedef yetenekleri için kabul edilmiştir21. Biyouyumluluk, sentez kolaylığı ve NIR'nin derinliklerinde ki emilimi ile birlikte, bu NP kontrast maddeler PAFC kullanan yumurtalık CTC'lerinin tespiti için ideal bir hedefleme stratejisi dir.
Bu çalışma, FA-CuS NPs hazırlanması ve bir fotoakustik akış sisteminde yumurtalık kanseri hücrelerinin tespiti için bunların kullanımı açıklar. CuS NPs özellikle yumurtalık CTCs hedef ve 1.053 nm lazer ile uyarıldığında bir fotoakustik sinyal yontmak folik asit ile modifiye edilir. Sonuçlar, PAFC sistemi içinde bu fotoakustik kontrast ajanlar ile kuluçkaya yatan yumurtalık kanseri hücrelerinin başarılı bir şekilde saptandığını göstermektedir. Bu sonuçlar yumurtalık kanseri hücrelerinin 1 hücre/μL konsantrasyonlarına kadar saptanmasını göstermektedir ve floresan mikroskopi bu parçacıkların SKOV-3 yumurtalık kanseri hücreleri tarafından başarılı alımını doğrular22. Bu çalışma, FA-CuS NPs sentezinin ayrıntılı bir açıklamasını, floresan mikroskopisi için numunelerin hazırlanmasını, fotoakustik akış sisteminin yapımını ve yumurtalık kanseri hücrelerinin fotoakustik saptanmasını sağlar. Sunulan yöntem FA-CuS NPs kullanarak akış yumurtalık CTCs başarılı bir şekilde belirlenmesi gösterir. Gelecek çalışma yumurtalık kanseri metastazı erken teşhisi doğru bu teknolojinin klinik uygulama üzerinde durulacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nanopartikül Sentezi ve İşlevselleştirme
NOT: FA-CuS NPs sentezi daha önce yayınlanmış bir protokol21uyarlanmış bir pot sentez yöntemi kullanılarak elde edilir.
DİkKAT: Tüm sentezler havalandırılan kimyasal duman kaputunda yapılmalıdır.
- Sentezden önce, yaklaşık 300 mL deiyonize (DI) su filtreleme, 0,2 μm steril filtre olsa.
- 250 mL cam yuvarlak alt şişeyi deterjan çözeltisi ile temizleyin ve DI suyla durulayın. 1 mM çözelti oluşturmak için 100 mL DI suya 0,0134 g CuCl2 ekleyin.
- CuCl2 çözeltisine 0,015 g folik asit (FA) ekleyin ve manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak ~5 dk karıştırın.
- 200 μL l l'lik bir pipet kullanarak reaksiyon karışımına yaklaşık 10 s'den fazla Na2S·9H2O (100°L DI suda 0,024 g) ekleyin.
NOT: Na2S·9H2O eklendikten sonra, çözelti açık sarıdan koyu kahverengiye renk değiştirir. - 90 °C'ye ayarlanmış bir yağ banyosunda reaksiyon uyguluyor ve manyetik bir karıştırma çubuğuyla karıştırmaya devam edin. Yaklaşık 15 dakika sonra veya yağ banyosu 85−90 °C'ye ulaştığında reaksiyonun bir saat daha devam etmesini bekleyin. Karışımınız yavaş yavaş koyu yeşil bir renge dönüşmelidir.
NOT: Basınç birikmesini önlemek için reaksiyon karışımını ısıtırken sistemi boşalttığından emin olun. - Reaksiyon kabını yağ banyosundan çıkarın ve buz banyosuna geçmeden önce yaklaşık 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında kısa bir süre soğutun.
- Reaksiyon karışımı 20 °C'nin altına soğuduktan sonra, kalan folik asidi çözeltiye dönüştürmek için pH'ı 1M NaOH kullanarak 10'a ayarlayın.
- 30 kDa santrifüj sütunu kullanarak FA-CuS reaksiyon karışımını arındırın. 15 dk için 3.082 x g'de kolona 15 mL toplu olarak çözelti ekleyin.
- Reaksiyon karışımının tamamı yoğunlaştıktan sonra konsantre kesirleri yeniden birleştirin ve 30 kDa santrifüj sütununda 15 mL pH 10 NaOH ile 4x yıkayın.
- Kütle ölçümleri için çözeltinin 1/3'ünü (~66 μL) alın ve üç cam şişeye bölün. ~ 27 mmHg bir vakum altında 40 °C'de bir vakum fırında bir gecede kuru.
- Konsantre çözeltinin diğer 2/3'ü 250 μL PBS'ye eritin ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- ÖNCE FA-CuS NPs kullanarak, yüksek bir ortamda bir banyo sonicator 30 dakika boyunca sonicate.
2. NP Karakterizasyonu
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) 1.1.14 ile 2 mL DI su adımından PBS çözeltisine 10 μL konsantre FA-CuS NPS ekleyin. DLS ile karakterizasyonu önce, yüksek bir ayarda bir banyo sonicator 30 dakika için parçacıkları sonicate ve kalan toz kaldırmak için 0,2 μm steril filtre ile filtre.
- İletim elektron mikroskobu (TEM) gerçekleştirin : Bir balmumu kağıt parçasına PBS çözeltisine 10 μL konsantre FA-CuS NPS ekleyin. Damlacık üstüne bir formvar kaplı bakır ızgara ters ve 2 dakika boyunca oturup izin verin. Fazla sıvı kaldırmak için filtre kağıdı bir parça formvar kaplı ızgara kenarına dokunun. Havanın kurumasına izin verin. 80 kV'luk hızlanan voltajda elektron mikroskobu kullanan bakır ızgarayı görüntüleyin.
NOT: FA-CuS NPS karakterizasyonundan tipik sonuçlar Şekil 1'desunulmuştur.
3. Hücre Kültürü
- Bu protokolde SKOV-3 hücreleri kullanılmaktadır. Aksi belirtilmedikçe, McCoy'un 5A orta bölgesinde %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenen kültür SKOV-3 hücreleri ve nemlendirilmiş %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de kalır.
4. Fa-Cus NPS'nin Mikroskopi için Floresan Etiketlemesi
- Texas-Red-X succinimidyl ester (0.2 mg DMSO içinde 10 mg /mL konsantrasyonda çözünmüş) 0.1 M NaHCO3 (pH ~ 9) tampon 1 mL FA-CuS NPs 2 mg içeren bir çözelti ekleyin.
- Oda sıcaklığında ışıktan uzakta, 1 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak reaksiyon karışımını karıştırın.
- Reaksiyon karışımını 4 mL 30 kDa MWCO santrifüj sütununa 10 dk boyunca 4.000 x g'da dönerek yoğunlaştırın.
- Konsantre çözeltiyi 3x 4 mL 0,1 M NaHCO3 tampon (pH ~9) ile bir santrifüj sütununda yıkayın. Daha sonra, konsantre çözeltiyi 4 mL DI su 3x ile yıkayın veya UV-VIS ile akışta sadece bir miktar floresan görülene kadar.
5. Fa-CuS NPS Uptake Yumurtalık Kanseri Hücreleri tarafından
- FA-CuS NPs ile kuluçkadan önce, SKOV-3 hücrelerini T75 şişesinde 8−15 mL folik-asitiçermeyen RPMI-1640 ortama % 10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile en az 24 saat kuluçkaya yatırın.
- 0,5 mL folik-asitsiz RPMI-1640 tam büyüme ortamındaki tohum hücreleri 0,1 x 106 hücre/mL'lik bir yoğunlukta 24 kuyu plakasına dönüşür.
- Ertesi gün, 400 μg/mL FA-CuS NPS'li hücreler 0,5 mL folik-asitsiz RPMI-1640 tam büyüme ortamı ile 2 saat boyunca inküler.
- Bu inkübasyonu takiben hücreleri 0.5 mL ve EDTA ile %0.25 tripsin ile deneyin. Tripsini nötralize etmek için en az 1 mL folik asitsiz RPMI-1640 tam büyüme ortamı ekleyin ve 6 dk için 123 x g'de hücreleri santrifüj edin.
- Supernatant çıkarın, PBS 2 mL hücreleri yeniden askıya ve 6 dakika için 123 x g santrifüj. Herhangi bir bağlı NPs kaldırmak için bu yıkama adımı 2x gerçekleştirin.
- PBS'nin 1−2 mL'indeki hücreleri %2 Ara çözeltisi ile yeniden askıya alın.
- Hücreleri hemositometre ve trippan mavisi kullanarak sayın. Hücre sayısı çok yüksekse hücreleri daha da seyreltin. PBS'deki hücreleri %2 Ile seyreltin ve algılama için seçilen konsantrasyona ulaştırın.
- Hücreler artık PAFC sistemi tarafından analiz edilmeye hazır.
6. FA-CuS NPS Alımıfloresan Mikroskobu
- Adım 5.1'de listelenen adımları tekrarlayın ve mikroskopi için aşağıdaki protokole devam edin.
- 0,5 mL folik-asitiçermeyen RPMI-1640 tam büyüme ortamı 24 kuyu plakalı cam kapaklar üzerinde 0.1 x 106 hücre/mL yoğunlukta tohum hücreleri.
- Ertesi gün, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL ve 0,5 mL folik-asitsiz RPMI-1640 tam büyüme mediasında 400 μg/mL konsantrasyonlarda floresan etiketli FA-CuS NPs'leri triplicate olarak kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 37 °C inkübatörde 2 saat nps ile kuluçkaya yatırın
- Bu kuluçka dönemini takiben hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
NOT: Tüm yıkama adımları için, hücreleri rahatsız etmemek için kuyu plakasının yan tarafına çözeltiyi dikkatlice ekleyin. İlaveden sonra, plakayı dikkatlice yatırın ve çözeltiyi kuyunun kenarından çekin. - PBS'de 0,5 mL 3,7(% 3,7 paraformaldehit (PFA) ile hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın ve cam kapakları yeni bir 24 kuyu plakasına aktarın.
DİkKAT: PFA bilinen bir karsinojendir. Havalandırılan kimyasal duman kaputunda tüm fiksasyon yapın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. - Hücreleri %3.7'lik bir çözeltide, PBS'de %0.1 Triton-X ile 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 0,5 mL PBS 3x ile 5 dakika boyunca yıkayın ve kapakları yeni bir tabağa aktarın.
- 5 dakika boyunca, ışıktan uzakta, DAPI içeren bir PBS çözeltisinin 0,5 mL'lik (boyama için 0,5 mg/mL stok çözeltisinin 20 μL/mL'si kullanılır) hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri PBS 3x ile yıkayın.
- Son PBS yıkamadan sonra, kapakları montaj ortamına sahip slaytlara monte edin.
- Hücreler floresan mikroskobu ile görüntülenmeye hazır. Şekil 2 floresan mikroskopi ile tipik hücre karakterizasyonu bir örnek gösterir.
7. Akış Sistemi Mimarisi
- Akış odası inşaatı
NOT: 3D baskılı akış tankısolidworks dosyası Ek Malzemelerbulunabilir.- Sağlanan SolidWorks dosyasını kullanarak, 3D akış tankını ABS termoplastik veya PLA plastik kullanarak yazdırın. SolidWorks kullanılamıyorsa boyutlar aşağıda verilmiştir. Şekil 3A bu modelin bir temsilini gösterir. Akış tankının gövdesi 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm'dir. Akış tankının uzak uçları, kılcal tüpü içeren tüpün girişine izin vermek için yaklaşık 5 mm çapında delikler içerir.
NOT: Akış tankı, ultrason transdüserinin yerleştirilmesi için kapiller tüpün yönünü dik olarak 1 cm'lik bir deliğe sahiptir. Delik le aynı iç çapa sahip silindirik bir ekstrüzyon tanka 6 mm kadar uzanır. Gerçek zamanlı görüntüleme için akış tankı, kılcal tüpün hemen altında 1 mm x 3 mm'lik bir yuvaya sahiptir. - 3B akış tankı yazdırıldıktan sonra, sistemi temizleyin ve kullanmak üzere monte edin.
- Cam kapakları 1 mm x 3 mm'lik yuvaya ve akış sistemine 1 cm delik yerleştirin.
- Sızıntıyı önlemek için silikon ile dikkatlice kapatın.
- Kılcal tüpü silikon kürlenmiş tüplere yerleştirin. Akış tankının yan tarafı cam kılcal borunun 3 mm'lik yuvanın ve 1 cm'lik deliğin hemen üstünde ve önünde olmasına rağmen tüpleri akış odasına takın.
- Sızıntıyı önlemek için boruyu silikon kullanarak kapatın.
- Sağlanan SolidWorks dosyasını kullanarak, 3D akış tankını ABS termoplastik veya PLA plastik kullanarak yazdırın. SolidWorks kullanılamıyorsa boyutlar aşağıda verilmiştir. Şekil 3A bu modelin bir temsilini gösterir. Akış tankının gövdesi 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm'dir. Akış tankının uzak uçları, kılcal tüpü içeren tüpün girişine izin vermek için yaklaşık 5 mm çapında delikler içerir.
- Fotoakustik akış sistemi kurulumu
NOT: Şekil 3B ve Şekil 3C akış sistemi mimarisinin bir örneğini göstermektedir.- Transdüseri ultrason darbecisine/alıcıya bağlayın. 59 dB kazanç ile sinyali yükseltin.
- Filtrenin çıktısını, dahili alan programlanabilir geçit dizisiyle donatılmış çok amaçlı yeniden yapılandırılabilir bir osiloskopa bağlayın.
- Akış odasından gelen tüplerden birini, her daldaki iki şırınga pompasına bağlı bir T kavşağına bağlayın.
- Şırınga pompalarından birini havayla, diğer pompayı da analiz edilecek numuneyle doldurun. Hava içeren pompayı 40 μL/dk akış hızına, numuneyi içeren pompayı ise 20 μL/dk akış hızına ayarlayın. Elde edilen iki fazlı akış 1 μL numune hacimleri üretecektir. Bu akış hızında, sistem dakikada yaklaşık 6,4 örnek test edecektir.
NOT: Hücrelerin tutarlı bir dağılımını korumak için, test edilmeden hemen önce her numuneyi hafifçe girdaplayın. Buna ek olarak, hücrelerin çözeltiye yerleşmesini önlemek için şırıngayı birkaç dakikada bir döndürün. - Akış sisteminden çıkan kalan tüpü %10 çamaşır suyu ile bir kap kabına bağlayın ve akış sisteminden çıktıktan sonra hücreleri atın.
NOT: Akış sistemini kullanmadan önce sızıntıları kontrol edin, çünkü bunlar akışı etkileyebilir. İşlem sırasında biyolojik güvenliği sağlamak için hücreler kapalı bir sistem içinde tutulmalıdır. - 3D baskılı tankın tasarımı, transdüser ve lazer ışığı arasında en az kalibrasyonla tutarlı ve tekrarlanabilir hizalama sağlar. Kuvars kılcal tüp, özel tankın içine doğru yerleştirildiğinde transdüser ve lazerin doğrudan hizalanmış olmasını sağlar.
- Kuvars kılcal borunun bölümünü transdüserle doğrudan hizaya yerleştirin, mikroskopun görüş alanına, böylece optik fiberin tüpün tüm genişliğini aydınlatır gibi numunenin üzerine dikkatli bir şekilde yerleştirilmesine olanak tanıyın.
- 1.053 nm dalga boyunda çalışan diyot pompalı katı hal lazer kanalize bir optik fiber kullanarak örnek ışınlamak. Numunedeki lazer ışığı olayı ve fotoakustik etkiyi ölçmek için kullanılan dönüştürücü nün her ikisi de odaklanmamış durumda.
- Numuneüzerindeki lazer olayının enerjisi yaklaşık 8 mJ'dir ve 10 Hz lazer hızı, sistemden geçerken her numuneyi birden fazla kez aydınlatmak için yeterlidir.
- Akış sistemini ters bir mikroskobun üzerine yerleştirin ve hem lazer darbesinin hem de numunenin yolunun akış sistemi geçerken görünür olmasını sağlayın. Mikroskopa monte edilmiş bir kamera kullanarak kayıt akışı.
- Veri toplama yazılımını kullanarak ultrason satın almalarını kaydedin (bkz. Malzeme Tablosu). Tetik ultrason ve FPGA kullanarak darbeli lazer. PBS'yi %2'lik Tween ile ve FA-CuS NPs'i PBS%2'lik tween'de 100 μg/mL konsantrasyonda negatif ve pozitif kontroller olarak kullanır.
- Mikroskopla monte edilmiş bir kamera kullanarak, hem lazerin ateşini hem de akış sistemi olmasına rağmen örneklerin geçişini kaydedin. Bu kayıtlar, transdüser tarafından kaydedilen akustik sinyali lazerin ateşlemesiyle ilişkilendirmek için kullanılacaktır. Örnekler lazerin ateşinin önünden geçerken, sinyal analiz için ortaya çıkan fotoakustik sinyalle ilişkilendirilebilir. 10 Hz örnekleme hızında, lazer her fişi birkaç kez aydınlatır.
8. Post İşleme
- Her sinyal edinimi için, s(t), analitik bir sinyal oluşturmak için Hilbert dönüşümü, H[s(t)]' yi hesaplayın.
- Analitik sinyalin büyüklüğünü hesaplayarak karmaşık bir zarf, se(t) oluşturun
ve her satın almadan kaynaklanan toplam sinyali ölçmek için zarfı entegre edin. R istatistik yazılımında t-testi kullanan her test grubundan (yani PBS, etiketli hücreler, FA-CuS NPs, tek başına hücreler) gelen sinyalleri karşılaştırın. Ham fotoakustik sinyaller ve Hilbert dönüşümleri Şekil 4'tesunulmuştur. - Görüntü yeniden yapılandırmaiçin, karmaşık zarfı tüm çalıştırma boyunca maksimum tepeye göre normalleştirin. Bir dizi çalıştırmayı karşılaştırıyorsanız, tüm serideki maksimum tepe yi kullanarak karmaşık zarfı normalleştirin. Normalleştirmeden sonra, her ediyi bir dizi piksel değerine dönüştürün. Görüntü yapılandırmasında ki her piksel değerleri serisini bir sütun olarak temsil edin. PBS ve FA-CuS NPs sinyallerinin temsili yeniden yapılandırılması Şekil 5'tegösterilmiştir ve her iki görüntü de her iki çalıştırmada da maksimum tepe noktası kullanılarak normalleştirilmiştir.
ve her satın almadan kaynaklanan toplam sinyali ölçmek için zarfı entegre edin. R istatistik yazılımında t-testi kullanan her test grubundan (yani PBS, etiketli hücreler, FA-CuS NPs, tek başına hücreler) gelen sinyalleri karşılaştırın. Ham fotoakustik sinyaller ve Hilbert dönüşümleri Şekil 4'tesunulmuştur.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A sentezlenen nano taneciklerin tipik bir TEM görüntüsünü gösterir. Tipik nanopartikülün ortalama boyutu yaklaşık 8,6 nm ± 2,5 nm'dir. Nanopartikül ölçümü ImageJ'de gerçekleştirildi. Parçacıkların ölçülmesi için ayrı ayrımak için eşik ve havza fonksiyonları uygulandı. Her parçacığın yatay ve dikey çapları birbirine dik olarak ölçüldü ve daha da ortalamaya ulaştı. DLS için şekil 1B'detemsili bir ölçüm gösterilir. Bu partiküller için ortalama hidrodinamik çapı 73.6 nm'dir. Bakır sülfür nano tanecikleri Şekil 1C'degösterildiği gibi NIR'ye kadar uzanan karakteristik bir emici eğriye sahiptir. Spektrofotometre ile lazerlerin değiştirilmesinden kaynaklanan yaklaşık 850 nm'lik hafif bir obje vardır.
Floresan etiketli nano tanecikleri ile kuluçkaya yatan hücrelerin floresan mikroskopi görüntüleri Şekil 2'degörülebilir. Nanopartikül alımı hücre genelinde floresan varlığı ile görselleştirilmiş olabilir. Nano partiküllerle kuluçkaya yatırılamayan hücreler floresan sinyali göstermez. Bu floresan sinyalinin varlığı, parçacıkların başarılı alımını ve akış sisteminde tespit edilme yeteneklerini gösterir.
Şekil 3, fotoakustik akış sisteminin genel kurulumlarını göstermektedir. Şekil 3A, 3B akış odasının ayrıntılı bir modelini gösterir. Bu oda, bu protokol ile sağlanan .stl dosyası kullanılarak basılabilir. Şekil 3B akış tankı kurulumuna genel bir bakış gösterir. Şekil 3C akış tankı ve veri toplama sisteminin genel kurulumgösterir.
Tipik veri toplama sinyalleri Şekil 4'tegösterilmiştir. Ham veriler, nanopartikül etiketli hücreler, PBS ve FA-CuS NPs arasındaki sinyal farklarını gösterir. Bir kazanım, tek bir lazer darbesinden elde edilen fotoakustik sinyaldir. Lazerin hızlı ateşleme hızı nedeniyle, analiz edilen her örnek birden fazla satın alma üretir. Hilbert dönüşümü kullanılarak her bir kazanım için bir zarf oluşturuldu. Bu zarf lazer darbesinden üretilen toplam sinyal miktarını ölçmek için entegre edildi. Bir önceki çalışmada, bu veriler, t-testi için analiz edilen kazanım sayısının 203, 150, 160 ve 131 olduğu, yalnızca NPs' li hücreler, tek başına, PBS ve NPs'li hücreler için sırasıyla22olan R istatistiksel yazılım kullanılarak analiz edilmiştir. Veriler günlük dönüşümü ile normalleştirildi ve R'deki Welch'in t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. 100 μg/mL konsantrasyonda tek başına FA-CuS NPs'den kaynaklanan sinyaller negatif kontrolden çok daha yüksek bir sinyal gösterdi. Negatif kontrol ve etiketli yumurtalık CTCs arasındaki sinyalleri arasındaki fark pozitif kontrol daha ince ama bir t-test22ile kendi araçlarının analizi ile tespit edilebilir .
Özel LabView ve MATLAB yazılımları kullanılarak, görüntü rekonstrüksiyonları sırasıyla gerçek zamanlı ve satın alma sonrası olarak olumlu ve olumsuz kontrollerden yapılmıştır. Fotoakustik rekonstrüksiyonları oluşturmak için Hilbert dönüşümü kullanılarak her kazanımın bir zarfı hesaplandı. Tek tek zarflar daha sonra piksel değerlerine dönüştürüldü ve bağımsız sütunlar olarak görüntülendi. 100 μg/mL konsantrasyonda FA-CuS NPs ile PBS numunesi arasında fotoakustik sinyalde net farklar meydana gelir(Şekil 5). Sistemin transdüser tarafından tespit edilebilen fotoakustik sinyal üretmesini sağlamak için sistem için kontrollerin çalıştırılması önemlidir.
Şekil 1: Temsili NP karakterizasyonu. (A) SENTEZLENMIS FA-CuS NPs. Ölçek çubuğu = 50 nm TEM görüntüsü. (B) Sentezlenmiş FA-CuS NPs. (C) Temsilci FA-CuS NPs absorbans eğrisinin temsili DLS yoğunluk dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SKOV-3 hücrelerinin temsili floresan mikroskopi görüntüleri. Hücreler 400 μg/mL floresan içermeyen nps. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fotoakustik akış sitometri sistemi ve akış odasının temsili görüntüleri. (A) 3B baskılı akış odasının ayrıntılı görünümü. (B) PAFC sisteminin diyagramı. (C) Akış sistemi mimarisi: SP = şırınga pompası; DAQ/FPGA = veri toplama/alan programlanabilir kapı dizisi; Ob = objektif lens; OF = optik fiber; FC = fiber çifter; UT = ultrason transdüser; FT = akış tankı. Bu rakam Lusk ve ark.22'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili ham veri sinyali ve Hilbert akış sisteminde test edilen numunelerin dönüşümleri. (A) PBS ve HÜCRELERDEN gelen temsili ham veri sinyali NP'ler ve(D) Hilbert ile kuluçkaya yatan veriler. (B) Temsili ham veri sinyali yalnızca hücrelerden ve FA-CuS NPs ile kuluçkaya yatan hücrelerden ve (E) hilbert veri dönüşümü. (C) PBS ve 100 μg/mL FA-CuS NPs ve (F)verilerin Hilbert dönüşümünden gelen temsili ham veri sinyali. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fotoakustik verilerin temsili fotoakustik görüntü rekonstrüksiyonları. (A) Akış sistemi içinde 100 μg/mL FA-CuS NPs ve (B) PBS görüntü rekonstrüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Akış Odası STL. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, PAFC ve hedeflenen CuS kontrast maddesi kullanan yumurtalık CTC'lerinin tespiti için basit bir yöntemdir. Birçok yöntem yumurtalık CTCs tespiti için araştırılmıştır, mikroakışkan cihazlar da dahil olmak üzere, RT-PCR, ve floresan akış sitometri23,24,25. Bu karmaşıklık, maliyet ve doğruluk aralığı, klinik ortamlarda etkinliğini sınırlayan. PAFC, hasta örneklerindeki CTC'leri algılama yeteneği ve in vivo uygulamalarına çeviri kolaylığı da dahil olmak üzere, CTC'lerin saptanması için bu geleneksel yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. PAFC da doğru hedeflenen kontrast ajanlar26,27ile kombine edildiğinde in vitro ve in vivo CTCs tespit gösterilmiştir.
Bu çalışmada, FA-CuS NP kontrast ajanlar fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda CTC saptanmasının doğruluğunu artırmak için yeteneklerini değerlendirildi. Çalışmalar PBS'de resuspended izole SKOV-3 hücreleri kullanılarak yapılmıştır. Floresan mikroskopi ile yapılan analizler bu parçacıkların başarılı alımını göstermiştir. Sonuçlar, SKOV-3 hücrelerinin 1 hücre/μL22konsantrasyonuna kadar inebolduğunu tespit etti. Bu protokoldeki önemli adımlar nanopartikül sentezini ve fotoakustik akış kurulumunun hizalanmasını içerir. Nanopartikül sentezi sırasında, çözelti yağ banyosu karışımı çıkarmadan önce koyu yeşil bir renk döndü emin olmak önemlidir. Akış sistemi için, sistemin etiketlenmiş hücrelerin sonraki tespiti için yeterli fotoakustik sinyal üretmesini sağlamak için, örnek testten önce sistem gerekli olsa da negatif ve pozitif bir kontrol çalıştırın. Akış sistemi çalıştırırken, fiber optik olay ışığı tamamen kılcal tüp aydınlatAn olduğundan emin olmak önemlidir, ve transdüser akış odasının yan karşı rahat olduğunu. Son olarak, sistemin sızıntılar için sıkı bir şekilde test edilmesi, sistemin biyolojik güvenliğini sağlamak ve oda nın içinden tutarlı bir akış için gereklidir.
Mevcut PAFC sistemi için, ön çalışmalar transdüser ve amplifikasyon sistemi kullanılarak fotoakustik algılama doğruladı. Bu sinyallerin çoğu daha düşük frekanslı sinyallerden (<20 MHz) oluşuyordu. Bunun üretilen fotoakustik sinyallerin gerçek frekansı mı yoksa amplifikatörün 35 MHz bant genişliğinden mi kaynaklandığını doğrulamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Gelecekteki çalışmalar, transdüserin merkezi frekansının yanı sıra amplifikasyon sisteminin bant genişliğini optimize etmek için algılanan sinyallerin frekans bileşenlerini araştıracaktır. Mevcut sistem özellikle CTCs ex vivo algılama için uygundur. Ancak, bu yöntem in vivo FA-CuS NPs gelecekteki uygulama potansiyelini tanımlar.
Gelecekteki çalışmalar karışık kültürler, insan klinik örnekleri içinde yumurtalık kanseri hücrelerini tespit etmek amacı ve in vivo modelleri28,29,30. Ayrıca, gelecekteki çalışmalar hedeflenmemiş kontrollere karşı bu nano taneciklerin özgüllüğünü inceleyecektir. Bu yöntemin gelecekteki doğrulaması, bu aracın insan klinik örnekleri ile test edilmesi, yüksek iş elde testi ve analizinin uygulanması ve klinik ortamlara çevrilmesi içerecektir. Bu fotoakustik teknik, çeşitli kontrast maddeler ve analitler arasında çok çeşitli klinik uygulamalara ve hastalıklara gelecekteki çeviri potansiyelini göstermektedir. PAFC kullanan analitlerin fotoakustik tespiti, CtC'lerin ve diğer patojenlerin bakım noktası tespitini daha hızlı ve ucuz hale getirme potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar madeleine Howell sentezi ile yardım için kabul etmek istiyorum, Matthew Chest onun yardım akış sistemi tasarımı için, ve Ethan Marschall SolidWorks ile yardım için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1,000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1x) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
References
- Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
- Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
- Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).
- Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
- Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
- Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).
- Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
- Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
- Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S.
- Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
- Galanzha, E. I., Zharov, V. P.
- O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).
- Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
- Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).
- Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
- Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
- Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).
- Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
- Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
- Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
- Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
- Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
- Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).
- Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).
- Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).
