Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Published: January 23, 2020 doi: 10.3791/60295
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

Summary

Vi præsenterer tre enkle in vitro-analyser-den lange afstande migration assay, co-kultur migration assay, og kemo-attraktion assay-at kollektivt evaluere funktionerne i menneskelige stamceller afledt periventtrikulære endotelceller og deres interaktion med GABAergic interneuroner.

Abstract

Hjernens vaskulaturs rolle i udviklingen af nervesystemet og ætiologi en hjernesygdom får i stigende grad opmærksomhed. Vores seneste undersøgelser har identificeret en særlig population af vaskulære celler, de periventrikulære endotelceller, der spiller en afgørende rolle i migration og distribution af forhjernen GABAergic interneuroner under embryonaludvikling. Dette, kombineret med deres celle-autonome funktioner, hentyder til nye roller periventrikulære endotelceller i patologi af neuropsykiatriske lidelser som skizofreni, epilepsi, og autisme. Her har vi beskrevet tre forskellige in vitro-analyser, der tilsammen evaluerer periventrikelendotelcellers funktioner og deres interaktion med GABAergic interneuroner. Brug af disse analyser, især i en menneskelig sammenhæng, vil give os mulighed for at identificere forbindelsen mellem periventrikulære endotelceller og hjernesygdomme. Disse analyser er enkle, lave omkostninger, og reproducerbare, og kan nemt tilpasses til enhver tilhænger celletype.

Introduction

Endotelceller danner foring af blodkar og mægle vigtige funktioner, der omfatter vedligeholdelse af fartøjets væg permeabilitet, regulering af blodgennemstrømningen, blodplade sammenlægning, og dannelse af nye blodkar. I hjernen, endotelceller udgør en del af en kritisk blod - hjerne-barriere, der stramt styrer udveksling af materialer mellem hjernen og blodbanen1. Vores undersøgelser i det seneste årti har identificeret nye neurogene roller hjerne endotelceller, der har betydelige konsekvenser for hjernens udvikling og adfærd2,3,4,5. Vi har vist, at musen embryonale forhjernen er vaskulariseret af to forskellige undertyper af fartøjer, pial fartøjer og periventrikulære fartøjer, der adskiller sig i anatomi, oprindelse, og udviklingsmæssige profil2. Endotelceller foring disse to fartøjsundertyper viser tydelige forskelle i deres genekspressionsprofiler. Mens pial endotelceller meste udtrykke gener relateret til betændelse og immunrespons, periventrikel endotelceller er unikt beriget i udtryk for gener, der almindeligvis er forbundet med neurogenese, neuronal migration, kemotaxis, og axon vejledning3. Periventtricular endotelceller også hus en roman GABA signalering vej, der adskiller sig fra den traditionelle neuronale GABA signalering vej5. Samtidig med sit genudtryk, periventrikulære endotelceller blev fundet at regulere migration og distribution af GABAergic interneuroner i udviklingslandene neocortex. Under embryonale udvikling, periventrikulære endotelceller gennemgå langdistance migration langs en ventral-dorsale gradient at etablere den periventrikulære vaskulære netværk2,3. Denne migrationsrute afspejles en dag senere af interneuroner. Migrerende interneuroner interagerer fysisk med det præformede periventrikulære vaskulære netværk og bruger det som en guiderail for at nå deres endelige destination i neocortex. Ud over at fungere som et fysisk substrat, periventrikulære endotelceller tjene som kilde til navigationssignaler til migrerende neuroner. Periventrikulære endotelcelleudskillede GABA guider interneuronmigration og regulerer deres endelige distributionsmønstre4. Defekter i interneuron migration og distribution er forbundet med neuropsykiatriske lidelser såsom autisme, epilepsi, skizofreni og depression6,7,8,9,10. Derfor, undersøgelse af periventrikulære endotelcelle funktioner og deres indflydelse på interneuron migration i menneskelig sammenhæng bliver afgørende for at løse patogenesen af disse lidelser.

Vi har genereret humane periventrikulære-lignende endotelceller fra menneskelige embryonale stamceller i vores laboratorium11,ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller (iPSC) teknologi12,13. For at validere, om humane periventrikulære endotelceller trofast efterligner museperiventrikulære endotelceller, og for kvantitativt at vurdere deres indflydelse på interneuronmigration, udviklede vi tre in vitro-analyser: en langdistance-migrationsanalyse, en co-kultur migration assay og en kemo-attraktionsanalyse. Her beskriver vi protokoller for disse analyser i detaljer. Alle tre analyser er baseret på brugen af silikone kultur skær til at skabe en lille rektangulær patch af celler (af faste dimensioner) omgivet af celle-fri rum. Migrationsafstanden evalueres ved at måle afstanden mellem cellernes endelige positioner fra kanten af den rektangulære patch, der er skitseret på dag 0. I den lange afstande migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er seedet som et plaster i midten af en 35 mm fad, og de afstande, der rejses af cellerne over en lang række tid beregnes. I co-kultur migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seedede med menneskelige interneuroner som en patch i en 35 mm parabol. Denne opsætning gør det muligt at undersøge effekten af direkte fysiske interaktioner af disse to celletyper på hastigheden af migration af interneuroner. Den kemo-attraktion assay måler migration af interneuroner som reaktion på kemo-attraktive signaler udskilles af menneskelige periventtricular endotelceller. Interneuroner er seedet som en rektangulær plet, med menneskelige periventrikulære endotelceller og kontrol ikke-periventtricular endotelceller seedet som lignende størrelse patches på begge sider. Hver af celleplastrene er adskilt af et cellefrit hul på 500 μm. Reaktion af interneuroner vurderes ved at kvantificere antallet af celler, der er migreret mod periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontrol af ikke-periventrikulære endotelceller.

Disse analyser giver en robust vurdering af humane periventrikulære endotelcellefunktioner og deres indflydelse på interneuronmigration. Den nye opsætning af langdistance-analyse og co-kultur migration assay giver celle-fri plads i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) for at tillade påvisning af langdistance migration. En oversigt over funktionerne i vores analyser i forhold til andre populære analyser er præsenteret i tabel 1. Kollektivt, de analyser, der er beskrevet her vil tjene som en platform for vurdering af "syge" periventrikulære endotelceller og interneuroner genereret fra iPSCs af hjernesygdomme som skizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analyser kan også bruges til at bestemme, hvordan forskellige tilstande (f.eks. hæmmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrationen. Endelig kan disse analyser optimeres til andre celletyper til måling af langdistancemigrering, kemo-tiltrækning eller cellebaseret medieret migrering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur og opbevaring af humane periventrikulære endotelceller

  1. Vedligehold humane periventrikulære endotelceller på kældermembranmatrixbelagte (se Tabel over materialer) 6-brøndspladeri periventrikelendotelcellemedium (E6-medium, der indeholder 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 og 5 μM GABA) ved 37 °C og 5% CO2. Skift medium hver alternativ dag.
  2. Tø kældermembranmatrix i 4 °C, og lav en 1:100 opløsning ved at fortynde den i koldt DMEM/F12-medium. Coat hver brønd af en 6-brøndplade med 1 ml matrix opløsning. Inkuberplader ved 37 °C i mindst 1 time før brug.
  3. Tillad humane periventrikulære endotelceller for at nå et sammenløb på 80%-90%. Aspirate medium fra brønden. Vask brøndene én gang med 1 ml steril1x PBS pr. brønd.
  4. Fjern celler ved at tilføje 1 ml celledissociation opløsning (se Tabel over materialer)pr. brønd. Inkuber ved 37 °C i 5 min. Efter 5 min, tilsættes 1 ml periventrikulær endotelcellemedium. Celleopløsningen overføres til et 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Vi bruger Accutase til celledissociation her, i modsætning til TrypLE i afsnit 3 og 4.
  5. Centrifugeceller ved 500 x g i 5 min ved stuetemperatur, aspirere supernatantet og resuspendere cellepelletiet i 1 ml periventrikulær endotelcellemedium.
  6. Tæl levende celler ved hjælp af metoden med blå trypan. Frøceller i friske matrixbelagte plader ved en tæthed på 1,2 x 105 celler/cm2. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2.
  7. Opbevar humane periventrikulære endotelceller ved kryokonservering i frysemedium (90% periventrikulær endotelcellemedium og 10% DMSO).
    1. Dissociat og indsamle celler efter trin 1.3 og 1.4 ovenfor. Tæl celler i opløsningen ved hjælp af metoden med blå trypan.
    2. Centrifuger celler ved 500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Aspirere supernatantog resuspendercellepellet på 5 x 106 celler / ml af frysemiddel.
    3. Dispenser 1 ml frysemiddel plus celler pr. kryovial. Hætteglassene anbringes i isopropanolfyldt kammer, og afkøles natten over i -80 °C ved 1 °C/min. Overfør hætteglas til en flydende nitrogenbeholder den næste dag til langtidsopbevaring.

2. Forberedelse af humane periventrikulære endotelceller til analyse

  1. Tillad menneskelige periventrikulære endotelceller at nå 70% -80% samtidighed.
  2. Dissociatceller efter trin 1.3 til 1.5 som beskrevet ovenfor. Tæl celler ved hjælp af metoden med blå trypanekskludering.

3. Forberedelse af humane GABAergic Interneurons til analyse

BEMÆRK: Human induceret pluripotent stamcelle (iPSC)-afledte GABAergic interneuroner og neuronal medium blev kommercielt købt (se Tabel over materialer). Neuronerne genereres ved at differentiere en menneskelig fibroblast-afledt iPSC linje efter en protokol udviklet af producenten. Cellerne blev optøet og dyrket i henhold til producentens protokol.

  1. Tø menneskelige GABAergic interneuroner og kultur dem i 12-brønd plade i to uger til et sammenløb på 70%-80%.
  2. På analysedagen, varm celle dissociation opløsning (se Tabel over materialer)og en aliquot af neuronal medium ved 37 °C i 10 min før brug.
  3. Aspirate medium fra hver brønd, der indeholder cellerne. Vask celler med 1 ml steril1x PBS pr. brønd.
  4. Detach celler ved at tilføje 0,5 ml af forvarmet dissociation opløsning per brønd og inkubere ved 37 °C i 5 min. Tilsæt 1 ml neuronal medium per brønd. Overfør celleopløsning en 15 ml konisk rør. Forsigtigt triturate at adskille celle klumper.
  5. Centrifugeceller ved 380 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, aspirere supernatantet og resuspendercellepellet i 1 ml neuronal medium. Tæl levende celler ved hjælp af metoden med blå trypan.

4. Forberedelse af kontrol humane endotelceller til analyse

BEMÆRK: Kontrol menneskelige iPSC-afledte endotelceller og endotelcellemedium blev kommercielt købt (Materialetabel). Disse endotelceller genereres ved at differentiere en menneskelig fibroblast-afledt iPSC linje til endotel skæbne efter en protokol udviklet af producenten. Cellerne blev optøet og dyrket på Fibronectin substrat i henhold til producentens protokol. Fibronectin-belagte plader blev udarbejdet efter producentens protokol.

  1. Tø bekæmpelse menneskelige endotelceller og kultur dem i 6-brønd plade til et sammenløb på 80%-90%.
  2. På analysedagen skal der anvendes varm celledissociation (se Materialetabel)og en aliquot af endotelmedium ved 37 °C i 10 minutter før brug.
  3. Aspirere mediet fra hver brønd, der indeholder cellerne. Vask celler med 1 ml steril1x PBS pr. brønd.
  4. Løsrive celler ved at tilføje 0,5 ml af forvarmet dissociation opløsning per brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Tilsæt 1 ml endotelcellemedium pr. brønd for at neutralisere dissociationsopløsningen. Overfør celleopløsning en 15 ml konisk rør.
  5. Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 min ved stuetemperatur. Aspirate supernatant og resuspendercellepellet i 1 ml endotelcellemedium. Tæl levende celler ved hjælp af metoden med blå trypan.

5. Forberedelse af one-well kulturindsatser

  1. Tø 1 mg/ml lamininopløsning ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
  2. Coat et passende antal 35 mm retter med 0,01% poly-L-ornithin opløsning (1 ml pr fad). Inkuber opvaskien i stuetemperatur i mindst 1 time.
  3. Opløsning på 1 mg/ml laminin opløsning 1:300 i sterilt vand til en endelig koncentration på 3,3 μg/ml umiddelbart før brug.
  4. Fuldstændig aspirate poly-L-ornithin fra hver skål. Skyl hver skål grundigt 3x med sterilt vand og aspirere helt for at undgå poly-L-ornithin-induceret celletoksicitet.
  5. Der tilsættes 1 ml 3,3 μg/ml lamininopløsning til hver skål og inkuberes ved 37 °C natten over eller mindst 1 time. Fjern lamininopløsning en op- og udtages fra skålen umiddelbart før brug.
    BEMÆRK: Alternativt opbevares lamininholdige retter i 4 °C. Opjævn skålene i en 37 °C cellekulturkuvøse før brug.
  6. Skær tre sider af en brønd af en to-brønd silikone kultur indsætte(Figur 1A)ved hjælp af en steril klinge til at generere en one-well indsætte(Figur 1B).
    BEMÆRK: Hold tobrønden fast fastgjort til den originale emballages overflade, mens du skærer for at sikre et jævnt snit og beskytter skærets klæbeevne.
  7. Aspirate laminin opløsning fra retterne.
    BEMÆRK: Vask ikke opvasken med steril PBS eller vand efter laminininkubation. Våde overflader vil forhindre tæt vedhæftning af kulturindsatsen.
  8. Fjern en brønd indsætte med sterile pincet og læg den i midten af poly-L-ornithin/ laminin belagt fad. Tryk langs skærts kanter for at fastgøre den til skålens overflade.
  9. Vend forsigtigt skålen på hovedet for at kontrollere, at indsatsen er fast fastgjort.
  10. Hold skålen på hovedet, og marker indsætningsrummets grænse ved hjælp af en permanent sort markør med en ultrafin spids (Figur 1C).

6. Langdistance migration assay

  1. Suspendere humane GABAergic interneuroner med en koncentration på 3 x 104 celler/70 μL neuronal medium. Frø 70 μL celleopløsning inde i hver et-brønd kultur indsats.
    BEMÆRK: Interneuronernes seedningstæthed er i henhold til producentens anbefaling.
  2. Suspendere humane periventrikulære endotelceller med en koncentration på 3 x 104 celler/70 μL periventrikulær endotelcellemedium. Frø 70 μL celleopløsning inde i hver et-brønd kultur indsats.
    BEMÆRK: Antallet af humane periventrikulære endotelceller, der er seedet ved et 1:1-forhold med antallet af seedede neuroner.
  3. Tilføj 1 ml neuronal medium i neuron skål til at fylde området omkring indsatsen og forhindre belægningen i at tørre. Tilsvarende tilsættes 1 ml periventrikulær endotelcellemedium i periventrikulær endotelcelleskål.
    BEMÆRK: Tilsæt mediet langsomt langs skålens kant, så indsatsen ikke forstyrres.
  4. Kontroller under et mikroskop for at kontrollere, at celler ikke lækker fra skærrummet.
  5. Inkuberceller i 24 timer ved 37 °C og 5% CO2. Efter 24 timer inkubation skal du kontrollere under mikroskop for at kontrollere, at cellerne er fastgjort korrekt, og at der ikke er nogen lækage natten over.
  6. Efter 48 timers såning fjernes indsatsen forsigtigt med en steril pincet. Kontroller under mikroskopet for at kontrollere, at cellelaget forbliver uforstyrret (dag 0).
  7. Fjern medium fra neuron parabol og tilsæt 1 ml af frisk neuronal medium. På samme måde fjernes mediet fra den periventrikulære endotelcelleskål, og der tilsættes 1 ml frisk periventrikulær endotelcellemedium.
    BEMÆRK: Sæt et nødvendigt antal retter til side og fastgør med 4% PFA til dag 0 billeder.
  8. Inkuberceller i 5 dage ved 37 °C og 5% CO2. Efter 5 dage skal du fjerne mellemstore, fastgøre celler med 4% PFA i 10 min og vaske 3x med 1 x PBS.
  9. Pletneuroner med anti-human β-Tubulin eller anti-humanMAP2 antistof, og endotelceller med anti-menneskelige CD31 antistof. Ved afslutningen af immunfarvning tilsættes 1 ml antifademonteringsmedium til hver skål.

7. Co-kultur Migration Assay

  1. Co-suspendere 3 x 104 GABAergic interneuroner og 3 x 104 humane periventrikel endotelceller i 70 μL af co-kultur medium (50% periventtrikel vedligeholdelse medium uden GABA og 50% neuronal medium). Frø denne celleopløsning inde i enkeltbrøndsrummet. Forbered et passende antal sådanne analyseretter.
    BEMÆRK: GABA blev ikke tilføjet i co-kultur mediet for at udelukke virkningen af udefrakommende GABA på migration.
  2. Kontroller under et mikroskop for at kontrollere, at celler ikke lækker fra skærrummet.
  3. Tilsæt langsomt 1 ml co-kultur medium langs siden af skålen for at forhindre belægningen i at tørre.
    BEMÆRK: Tilsæt mediet langsomt langs skålens kant, så indsatsen ikke forstyrres.
  4. Som en første kontrol, frø 3 x 104 menneskelige GABAergic interneuroner kun i 70 μL af co-kultur medium pr one-well indsætte. Forbered et passende antal sådanne retter.
  5. Som en anden kontrol, co-frø 3 x 104 GABAergic menneskelige interneuroner med 3 x 104 kontrol humane endotelceller i 70 μL af co-kultur medium pr en-brønd indsætte. Forbered et passende antal retter.
  6. Opkuber skålene i 24 timer ved 37 °C og 5% CO2. Efter 24 timers inkubation skal du kontrollere under et mikroskop for at kontrollere, at cellerne er fastgjort korrekt, og at der ikke er nogen lækage.
  7. Efter 48 timers såning fjernes indsatsen forsigtigt med en steril pincet. Kontroller under mikroskopet for at kontrollere, at cellelaget ikke forstyrres (dag 0).
  8. Fjern medium og tilsæt 1 ml frisk co-kultur medium.
    BEMÆRK: Der er afsat et passende antal retter til erhvervelse af dag 0 billeder.
  9. Inkuberceller i 5 dage ved 37 °C og 5% CO2.
  10. Efter 5 dage skal du fjerne mellemstore, fastgøre celler med 4% PFA i 10 min og vaske 3x med 1 x PBS.
  11. Plet med anti-human β-Tubulin eller anti-menneskelige MAP2 antistof til at mærke neuroner. Ved afslutningen af immunfarvning tilsættes 1 ml antifademonteringsmedium til hver skål.

8. Chemo-attraktion Assay

  1. Placer en tre-brønd kultur indsats i midten af en poly-L-ornithin /laminin belagt 35 mm fad ved hjælp af sterile pincet.
  2. Vend skålen på hovedet. Marker grænsen omkring indsætningsrummets midterste rum med en permanent sort markør med ultrafint spids.
  3. Frø 3 x 104 humane GABAergic interneuroner i det midterste rum i 70 μL neuronal medium (Figur 3A).
  4. Frø 104 humane periventrikulære endotelceller i 70 μL periventrikulære endotelcellemedium og 104 kontrolendotelceller i 70 μL kontrolendotelcellemedium i de to ydre rum (figur 3A).
  5. Tilføj 1 ml co-kultur medium (50% periventrikulær vedligeholdelse medium uden GABA og 50% neuronal medium) langs siden af fadet for at forhindre belægningen på skålen fra tørring.
  6. Kontroller under mikroskop for at kontrollere, at cellerne ikke lækker fra skærrummet.
  7. Inkuberceller i 24 timer ved 37 °C og 5% CO2. Efter 24 timers inkubation skal du kontrollere under et mikroskop for at kontrollere, at cellerne er fastgjort korrekt, og at der ikke er nogen lækage.
  8. Efter 48 timers såning fjernes indsatsen forsigtigt med en steril pincet. Kontroller under mikroskopet for at kontrollere, at cellelaget ikke forstyrres (dag 0).
  9. Fjern medium og tilsæt 1 ml frisk co-kultur medium.
    BEMÆRK: Sæt det nødvendige antal retter til dag 0-billeder til side.
  10. Inkuberceller i 36 timer ved 37 °C og 5% CO2. Efter 36 timer, aspirate medium, fastgør celler med 4% PFA i 10 min og vaskes 3x med 1x PBS.
  11. Plethumane GABAergic interneuroner med anti-human β-Tubulin eller anti-humanMAP2 antistof. Ved afslutningen af farvningsproceduren tilsættes 1 ml antifademonteringsmedium i hver skål.

9. Billeddannelse og dataanalyse

  1. Anbring den immunplettede analyseskål under mikroskop ved 4X forstørrelse.
  2. Hold en lang kant af den rektangulære grænse (lavet i trin 5.10 ovenfor) i synsfeltet. Tag billeder af celler i det cellefrie rum ved siden af denne grænse. Anskaf billeder langs højre lange kant og den venstre lange kant af den rektangulære grænse (Figur 2B).
    BEMÆRK: Celler, der er placeret diagonalt i forhold til rektanglet, tages ikke i betragtning på grund af tvetydighed ved valget af det korte eller lange kant som startmærke. Også antallet af celler, der migrerer over den korte kant er ofte betydeligt færre (muligvis på grund af mindre antal startceller langs kort kant) og er ikke taget i betragtning.
  3. Åbn billederne i ImageJ. Beregn afstanden mellem hver celle og grænsemærket (figur 2D) ved hjælp af ImageJ.
  4. Hvis du vil vurdere overflytning i form af celletal, skal du angive en bestemt afstand fra grænsen i det erhvervede billede i ImageJ. Tæl antallet af celler, der er til stede inden for denne afstand. Beregn gennemsnitligt tal, standardafvigelse og statistisk signifikans ved hjælp af passende software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trinene til opsætning af et etgodt kulturskær inde i en 35 mm skål er vist i figur 1. Langdistance migration assay og co-kultur migration assay brugt en one-well indsætte til frø det ønskede antal celler i midten af en poly-L-ornithin /laminin belagt 35 mm fad. På dag 0 var cellerne til stede som et rektangulært plaster (figur 2A,C). I dag 0 billeder, dag 0 linje kunne nemt identificeres ved den skarpe kant af cellelaget (hvid stiplet linje i figur 2C). Ved 48 h var cellerne migreret ud i det cellefrie rum(figur 2B,D). I post-dag 0 billeder, den sorte kant trukket omkring indsætte (på bagsiden af fadet) kunne tydeligt observeres som et sort hul. Kanten af hullet blev tildelt som dag 0-linjen (hvid stiplet linje i figur 2D). Som nævnt i trin 9.2 blev kun de celler, der faldt i området ved siden af cellelagets højre og venstre lange kanter (gult område i figur 2B),taget i betragtning til dataanalyse. Den afstand, der blev tilbagelagt af en celle, blev målt ved beregning af afstanden mellem cellen (hvid pil i figur 2D) og dag 0-linjen. Immuncytokemisk farvning med antiaktivt Caspase 3 antistof, en markør for apoptose, viste ingen apoptotisk signal i de seedede celler (Figur 2E). I co-kultur migration assay, når interneuroner var co-seedede med menneskelige periventrikel endotelceller, neuroner rejste længere afstande i forhold til når interneuroner var seedet alene, eller når co-seedet med kontrol endotelceller (Figur 2F). Også for samme afstand sinterval, et højere antal interneuroner migreret ud, når co-seedet med periventrikulære endotelceller i forhold til interneuroner i de to andre grupper. Dette viser, at ligesom mus periventrikulære endotelceller, menneskelige periventrikel endotelceller fremme menneskelige interneuron migration.

I kemo-attraktion assay, ved hjælp af tre-brønd kultur skær, menneskelige interneuroner blev seedet som en lille rektangulær patch i en 35 mm poly-L-ornithin/laminin belagt kultur parabol. Periventrikulære endotelceller og kontrol ikke-periventrikulære endotelceller blev seedet som pletter på hver side af neuronal patch, med kløften mellem hver patch er 500 μm(Figur 3A). Antallet af interneuroner, der migrerede mod periventrikulære endotelceller versus kontrol endotelceller blev kvantificeret efter 36 timer. Et betydeligt højere antal interneuroner, der migreres mod periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontrol endotelceller(figur 3B,C), hvilket bekræfter, at GABAergic interneuroner reagerer selektivt på kemo-attraktive signaler udskilles af humane periventrikulære endotelceller.

Figure 1
Figur 1: Forberedelse af kulturindsatsen. (A) En to-brønd kultur indsætte. (B) En one-well indsætte fastgjort i midten af en 35 mm fad. C) Omridset af det rektangulære plaster som observeret efter fjernelse af indsatsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skema og repræsentativt resultat af migrationsanalyse. (A) Skema af cellelag (rødt rektangel) på dag 0. (B) Skema af celler, der migrerer ud i det cellefrie rum. Røde prikker angiver migrerende celler. Det gule område markerer det område, der er afbildet til dataindsamling. Den stiplede boks i A og B svarer til det område, der vises i punkt C og D. (C,D) Repræsentative fluorescerende billeder af anti-β-Tubulin antistof mærket interneuroner på dag 0 (C) og dag 2 (D)af migration assay. Den hvide stiplede linje markerer dag 0. Den gule linje i D angiver den afstand, der tilbageføres af en celle (markeret med hvid pil) i 48 h. (E)Neuroner (på dag 0) er co-mærket med anti-β-Tubulin antistoffer (rød) og anti-aktive Caspase 3 antistoffer (grøn), som markerer apoptotiske celler. Nuclei er plettet med DAPI (blå). Apoptotiske celler blev ikke opdaget i seedede celler. (F) Graf fra dag 5 i co-kultur analyse, hvor antallet af interneuroner, der har migreret er plottet mod tilbagelagt afstand. Sammenlignet med interneuroner, der var seedet alene eller co-seedede med kontrol endotelceller, interneuroner co-seedede med periventricular endotelceller migreret ud i højere antal, og også rejste længere afstand. Data repræsenterer middelværdi ± S.D (n = 5; **p<0.01, ***p< 0,001, Student's t test). Skalastænger = 100 μm. IN = interneuroner; PV EC = periventrikulære endotelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Chemo-attraktion assay. (A) Skema af kemo-attraktion assay. Ved hjælp af en tre-brøndkultur indsætte, interneuroner (IN) blev seedet i midten (grøn prikket rektangel), mens periventricular endotelceller (PV ECs; orange prikket rektangel) og kontrol endotelceller (ECs; gult punkteret rektangel) blev seedet på begge sider. (B) Billeder af β-Tubulin mærket interneuroner, der udviser robust migration mod periventrikulære endotelceller, men ikke mod kontrol endotelceller. C) Kvantificering af interneuronernes kemo-attraktive reaktion. Et betydeligt højere antal neuroner migreret mod periventrikulære endotelceller end mod kontrol endotelceller. Data repræsenterer gennemsnitlige ± S.D (n = 5; *p < 0.05, Student's t test). Skalastænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

A Fordele Begrænsninger
Boyden kammer assay16,17 · Teknisk ikke-krævende
· Velegnet til klæbende og ikke-klæbende celler
· Kan ændres for at undersøge effekten af paracrinsignalering eller kemo-tiltrækker på cellemigration		 · Endpoint-analyse. Ikke egnet til realtidsbilleddannelse.
· Ikke egnet til undersøgelse af effekten af direkte cellecelleinteraktion på migration
Scratch assay18 · Slutpunkt eller kinetisk
· Teknisk ikke-krævende		 · Analyser er migration længde på et par hundrede mikrometer. Ikke egnet til undersøgelse af langdistancemigration i intervallet 1-2 cm.
· Ikke egnet til suspension celler
· Variationer i arbejdsområde
Langdistanceoverflytningassay · Slutpunkt eller kinetisk
· Giver mulighed for undersøgelse af langdistancemigration mellem 1,5 og 2 cm
· Teknisk ikke-krævende		 · Ikke egnet til suspension celler
Co-kultur migration assay · Slutpunkt eller kinetisk
· Giver mulighed for undersøgelse af effekten af direkte cellecellekontakt på migration
· Tillader overflytningslængde på op til 1,5 til 2 cm
· Teknisk ikke-krævende		 · Ikke egnet til suspension celler
B Fordele Begrænsninger
Boyden kammer assay · Teknisk ikke-krævende
· Velegnet til klæbende og ikke-klæbende celler		 · Endpoint-analyse. Ikke egnet til live-billedbehandling.
· Stejl koncentrationsgradient
Under-agarose assay19 · Teknisk ikke-krævende
· To eller flere kemo-attraktive signaler kan assayed i en oprettet		 · Ikke egnet til klæbende celler. Begrænset mest til blodlegemer.
· Vanskelig visualisering af celler i agarose
Kapillær kammer migration analyse20,21 · Slutpunkt eller kinetisk
· Velegnet til klæbende eller suspensionceller		 · Har brug for særlige kamre
Mikroflydende enhed22 · Genererer kontrollerbar og stabil koncentrationsgradient
· Tillader opløsning på et enkelt celleniveau		 · Har brug for avancerede enheder og værktøjer
· Teknisk krævende og stejl indlæringskurve
· Kompleks billedbehandling og dataanalyse
Chemo-attraktion assay · Slutpunkt eller kinetisk
· Gradvis koncentrationsgradient
· Velegnet til realtids- eller fluorescerende billeddannelse
· Teknisk ikke-krævende		 · Ikke egnet til suspension celler

Tabel 1: Sammenligning af analysemetoder. (A) Sammenligning af almindelige in vitro migration analyser med langdistance migration assay og co-kultur assay. (B) Sammenligning af fælles kemotaxis analyser med kemo-attraktion assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi tre in vitro-analyser, der tilsammen giver en kvantitativ vurdering af humane periventrikulære endotelcellespecifikke egenskaber. Disse analyser vil være værdifulde i at få mekanistisk indsigt i samspillet mellem menneskelige periventrikel endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter, der anvender ligander, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller overekspression, vil identificere eller validere molekylære afspillere, der formidler endotelcellestyret interneuronmigration eller langdistancetrækegenskaber for periventrikulære endotelceller. Disse analyser kan også ændres til at udføre live-celle time-lapse migration undersøgelser. Desuden er der tegn på interaktion mellem endotelceller med andre celler end interneuroner. Undersøgelser fra vores gruppe og andre har hentydet til indflydelse naf periventrikulære endotelceller på mønstre af projektion neuroner og spredning af neurale prækursor celler5,14,15. Det ville være af interesse at teste disse mulige interaktioner ved hjælp af vores analyseindstillinger. Endelig vil disse analyser tjene som en platform for vurdering af syge periventrikulære endotelceller. Vores arbejde har etableret nye autonome forbindelser mellem den periventrikulære vaskulære netværk og oprindelsen af neuropsykiatriske lidelser som skizofreni, epilepsi, autisme, og svær depression3,5. Disse analyser vil være uvurderlige i at identificere potentielle fejl i langdistance migration, kemo-attraktion, eller sammengrebsignalering af syge-periventtricular endotelceller i disse neuropsykiatriske lidelse betingelser.

Disse analyser er enkle, reproducerbare og lave omkostninger, og de kan ændres for at måle cellemigration og effekter af co-kultur eller kemo-attraktive signaler om migration i forskellige celletyper, bortset fra ikke-klæbende celler. Der er nogle kritiske skridt, der skal følges for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater. For det første er det afgørende at optimere såning cellenummer for hver analyse. Antallet af celler, der skal seedet i et enkelt rum, bør afhænge af celletype, det ønskede niveau af sammenløb og analysespecifikke faktorer som co-kultur-forhold. For det andet er det nødvendigt at optimere cellekulturmediet for hver analyse. I co-kultur migration assay og kemo-attraktion assay, hvor mere end én celle type er seedet i en enkelt skål, bør analysen medium være befordrende for alle celletyper. I pilotforsøg undersøgte vi co-kulturmediets indvirkning på levedygtigheden (ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode) og morfologi (ved hjælp af immuncytokemi) af hver celletype. Vi dyrkede menneskelige GABAergic neuroner med co-kultur medium i en uge og observerede ingen væsentlig forskel i levedygtighed og morfologi af neuroner i co-kultur medium i forhold til neuroner dyrket i neuronal medium. På samme måde viste periventrikulære endotelceller og kontrol endotelceller, dyrket i co-kultur medium for to passager, ikke nogen væsentlig variation i celle overlevelse og morfologi. For det tredje, da overførselshastigheden varierer mellem forskellige celletyper, er det vigtigt at bestemme tidsrammen for hver analyse for den eller de celletyper, der undersøges. For det fjerde er det afgørende at håndtere kulturindsatserne omhyggeligt. Skær skal fastgøres solidt på skålen ved forsigtigt at trykke med fingerspids. Skålen skal vendes på hovedet for at kontrollere, at indsatsen ikke bevæger sig. Der skal også udvises forsigtighed, mens du fjerner indsatsen for ikke at forstyrre cellelaget. Endelig anbefales det at øge stikprøvestørrelsen for at reducere forsøgsvariationen.

Afslutningsvis vil disse analyser i væsentlig grad udvide vores forståelse af menneskets periventrikulære endotelcellebiologi og dens rolle i hjernens udvikling under normale og syge forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af priser fra National Institute of Mental Health (R01MH110438) og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) til AV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase dissociation solution Millipore Sigma SCR005 Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody Biolegend 802001
Anti-human CD31 antibody Millipore Sigma CBL468
Anti- MAP2 antibody Neuromics CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody Millipore Sigma AB3623
Control human endothelial cells Cellular Dynamics R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement Cellular Dynamics M1019
Cryogenic vials Fisher Scientific 03-337-7Y
DMEMF/12 medium Thermofisher Scientific 11320033
DMSO Sigma-Aldrich D2650
E6 medium Thermofisher Scientific A1516401
FGF2 Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectin Thermofisher Scientific 33016-015
Freezing Container Thermofisher Scientific 5100
GABA Sigma-Aldrich A2129
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Human GABAergic neurons Cellular Dynamics R1013
Human GABAergic neurons base medium Cellular Dynamics M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement Cellular Dynamics M1032
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
Mounting Medium Vector laboratories H-1200
poly-L-ornithin Sigma p4957
PBS Thermofisher Scientific 14190
Trypan blue Thermofisher Scientific 15250061
TrypLE Thermofisher Scientific 12563011 Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A Peprotech 100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit Lifeline Cell Technologies LL-0003 Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert ibidi 80209
3-well silicone culture-Insert ibidi 80369
35 mm dish Corning 430165
15-ml conical tube Fisher Scientific 07-200-886
4% PFA solution Fisher Scientific AAJ19943K2
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 14-832-11
Inverted phase contrast microscope Zeiss Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope Olympus FSX-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).

Tags

Neurovidenskab endotelceller interneuroner cellemigration neurovaskulære interaktioner co-kultur kemo-tiltrækning
Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Datta, D., Vasudevan, A. Migration,… More

Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter