Vi præsenterer tre enkle in vitro-analyser-den lange afstande migration assay, co-kultur migration assay, og kemo-attraktion assay-at kollektivt evaluere funktionerne i menneskelige stamceller afledt periventtrikulære endotelceller og deres interaktion med GABAergic interneuroner.
Hjernens vaskulaturs rolle i udviklingen af nervesystemet og ætiologi en hjernesygdom får i stigende grad opmærksomhed. Vores seneste undersøgelser har identificeret en særlig population af vaskulære celler, de periventrikulære endotelceller, der spiller en afgørende rolle i migration og distribution af forhjernen GABAergic interneuroner under embryonaludvikling. Dette, kombineret med deres celle-autonome funktioner, hentyder til nye roller periventrikulære endotelceller i patologi af neuropsykiatriske lidelser som skizofreni, epilepsi, og autisme. Her har vi beskrevet tre forskellige in vitro-analyser, der tilsammen evaluerer periventrikelendotelcellers funktioner og deres interaktion med GABAergic interneuroner. Brug af disse analyser, især i en menneskelig sammenhæng, vil give os mulighed for at identificere forbindelsen mellem periventrikulære endotelceller og hjernesygdomme. Disse analyser er enkle, lave omkostninger, og reproducerbare, og kan nemt tilpasses til enhver tilhænger celletype.
Endotelceller danner foring af blodkar og mægle vigtige funktioner, der omfatter vedligeholdelse af fartøjets væg permeabilitet, regulering af blodgennemstrømningen, blodplade sammenlægning, og dannelse af nye blodkar. I hjernen, endotelceller udgør en del af en kritisk blod – hjerne-barriere, der stramt styrer udveksling af materialer mellem hjernen og blodbanen1. Vores undersøgelser i det seneste årti har identificeret nye neurogene roller hjerne endotelceller, der har betydelige konsekvenser for hjernens udvikling og adfærd2,3,4,5. Vi har vist, at musen embryonale forhjernen er vaskulariseret af to forskellige undertyper af fartøjer, pial fartøjer og periventrikulære fartøjer, der adskiller sig i anatomi, oprindelse, og udviklingsmæssige profil2. Endotelceller foring disse to fartøjsundertyper viser tydelige forskelle i deres genekspressionsprofiler. Mens pial endotelceller meste udtrykke gener relateret til betændelse og immunrespons, periventrikel endotelceller er unikt beriget i udtryk for gener, der almindeligvis er forbundet med neurogenese, neuronal migration, kemotaxis, og axon vejledning3. Periventtricular endotelceller også hus en roman GABA signalering vej, der adskiller sig fra den traditionelle neuronale GABA signalering vej5. Samtidig med sit genudtryk, periventrikulære endotelceller blev fundet at regulere migration og distribution af GABAergic interneuroner i udviklingslandene neocortex. Under embryonale udvikling, periventrikulære endotelceller gennemgå langdistance migration langs en ventral-dorsale gradient at etablere den periventrikulære vaskulære netværk2,3. Denne migrationsrute afspejles en dag senere af interneuroner. Migrerende interneuroner interagerer fysisk med det præformede periventrikulære vaskulære netværk og bruger det som en guiderail for at nå deres endelige destination i neocortex. Ud over at fungere som et fysisk substrat, periventrikulære endotelceller tjene som kilde til navigationssignaler til migrerende neuroner. Periventrikulære endotelcelleudskillede GABA guider interneuronmigration og regulerer deres endelige distributionsmønstre4. Defekter i interneuron migration og distribution er forbundet med neuropsykiatriske lidelser såsom autisme, epilepsi, skizofreni og depression6,7,8,9,10. Derfor, undersøgelse af periventrikulære endotelcelle funktioner og deres indflydelse på interneuron migration i menneskelig sammenhæng bliver afgørende for at løse patogenesen af disse lidelser.
Vi har genereret humane periventrikulære-lignende endotelceller fra menneskelige embryonale stamceller i vores laboratorium11,ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller (iPSC) teknologi12,13. For at validere, om humane periventrikulære endotelceller trofast efterligner museperiventrikulære endotelceller, og for kvantitativt at vurdere deres indflydelse på interneuronmigration, udviklede vi tre in vitro-analyser: en langdistance-migrationsanalyse, en co-kultur migration assay og en kemo-attraktionsanalyse. Her beskriver vi protokoller for disse analyser i detaljer. Alle tre analyser er baseret på brugen af silikone kultur skær til at skabe en lille rektangulær patch af celler (af faste dimensioner) omgivet af celle-fri rum. Migrationsafstanden evalueres ved at måle afstanden mellem cellernes endelige positioner fra kanten af den rektangulære patch, der er skitseret på dag 0. I den lange afstande migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er seedet som et plaster i midten af en 35 mm fad, og de afstande, der rejses af cellerne over en lang række tid beregnes. I co-kultur migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seedede med menneskelige interneuroner som en patch i en 35 mm parabol. Denne opsætning gør det muligt at undersøge effekten af direkte fysiske interaktioner af disse to celletyper på hastigheden af migration af interneuroner. Den kemo-attraktion assay måler migration af interneuroner som reaktion på kemo-attraktive signaler udskilles af menneskelige periventtricular endotelceller. Interneuroner er seedet som en rektangulær plet, med menneskelige periventrikulære endotelceller og kontrol ikke-periventtricular endotelceller seedet som lignende størrelse patches på begge sider. Hver af celleplastrene er adskilt af et cellefrit hul på 500 μm. Reaktion af interneuroner vurderes ved at kvantificere antallet af celler, der er migreret mod periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontrol af ikke-periventrikulære endotelceller.
Disse analyser giver en robust vurdering af humane periventrikulære endotelcellefunktioner og deres indflydelse på interneuronmigration. Den nye opsætning af langdistance-analyse og co-kultur migration assay giver celle-fri plads i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) for at tillade påvisning af langdistance migration. En oversigt over funktionerne i vores analyser i forhold til andre populære analyser er præsenteret i tabel 1. Kollektivt, de analyser, der er beskrevet her vil tjene som en platform for vurdering af “syge” periventrikulære endotelceller og interneuroner genereret fra iPSCs af hjernesygdomme som skizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analyser kan også bruges til at bestemme, hvordan forskellige tilstande (f.eks. hæmmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrationen. Endelig kan disse analyser optimeres til andre celletyper til måling af langdistancemigrering, kemo-tiltrækning eller cellebaseret medieret migrering.
Her beskrev vi tre in vitro-analyser, der tilsammen giver en kvantitativ vurdering af humane periventrikulære endotelcellespecifikke egenskaber. Disse analyser vil være værdifulde i at få mekanistisk indsigt i samspillet mellem menneskelige periventrikel endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter, der anvender ligander, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller overekspression, vil identificere eller validere molekylære afspillere, der formidler endotelcellestyret interneuronmigration…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af priser fra National Institute of Mental Health (R01MH110438) og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) til AV.
Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
35 mm dish | Corning | 430165 | |
15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |