Summary
Мы представляем три простых in vitro-анализы миграции на расстоянии, анализ миграции совместной культуры и анализ химиотерапии-притяжения, которые коллективно оценивают функции стволовых клеток человека, полученных перивентрикулярных эндотелиальных клеток и их взаимодействия с ГАМК-интернейронов.
Abstract
Роль сосудистой системы головного мозга в развитии нервной системы и этиологии нарушений головного мозга все больше привлекает внимание. Наши недавние исследования выявили особую популяцию сосудистых клеток, перивентрикулярных эндотелиальных клеток, которые играют важную роль в миграции и распределении передних ГАМК-интернейронов во время эмбрионального развития. Это, в сочетании с их клеточной автономной функции, намекает на новые роли перивентрикулярных эндотелиальных клеток в патологии нейропсихиатрических расстройств, как шизофрения, эпилепсия, и аутизм. Здесь мы описали три различных in vitro анализы, которые коллективно оценить функции перивентрикулярных эндотелиальных клеток и их взаимодействие с ГАМК-интернейронов. Использование этих анализов, особенно в человеческом контексте, позволит нам определить связь между перивентрикулярными эндотелиальными клетками и нарушениями мозга. Эти анализы являются простыми, низкой стоимости, и воспроизводимые, и могут быть легко адаптированы к любому типу адепта клеток.
Introduction
Эндотелиальные клетки образуют слизистую оболочку кровеносных сосудов и посредничают в важных функциях, которые включают поддержание проницаемости стенки сосудов, регуляцию кровотока, агрегацию тромбоцитов и образование новых кровеносных сосудов. В головном мозге эндотелиальные клетки являются частью критического гематоэнцефалического барьера, который жестко контролирует обмен материалами между мозгом и кровотоком1. Наши исследования в последнее десятилетие определили новые нейрогенные роли эндотелиальных клеток мозга, которые имеют значительные последствия для развития мозга и поведения2,3,4,5. Мы показали, что мышь эмбрионального переднего мозга васкуляризовано двумя различными подтипами сосудов, pial сосудов и перивентрикулярных сосудов, которые отличаются по анатомии, происхождению и развития профиля2. Эндотелиальные клетки, выстилающие эти два подтипа сосуда, показывают явные различия в профилях экспрессии генов. В то время как pial эндотелиальные клетки в основном выражают гены, связанные с воспалением и иммунным ответом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки однозначно обогащены экспрессией генов, обычно связанных с нейрогенезом, нейрональной миграцией, хемотаксисом и аксоном3. Перивентрикулярные эндотелиальные клетки также дом роман ГАМК сигнальный путь, который отличается от традиционных нейрональных ГАМК сигнализации пути5. Сопутствуя экспрессии гена, перивентрикулярные эндотелиальные клетки были найдены для регулирования миграции и распределения ГАМК-интернейронов в развивающихся неокортекс. Во время эмбрионального развития, перивентрикулярные эндотелиальные клетки проходят междугородную миграцию вдоль брюшно-дорсального градиента для установления перивентрикулярной сосудистой сети2,3. Этот миграционный маршрут отражается на следующий день interneurons. Мигрирующие интернейроны физически взаимодействуют с заранее сформированной перивентрикулярной сосудистой сетью и используют ее в качестве путеводителя для достижения конечного пункта назначения в неокортексе. В дополнение к действуя в качестве физического субстрата, перивентрикулярные эндотелиальные клетки служат источником навигационных сигналов для мигрирующих нейронов. Перивентрикулярный эндотелиальной клеточной секретной ГАМК направляет интернерон миграции и регулирует их окончательное распределение моделей4. Дефекты в интернеронной миграции и распределении связаны с нейропсихиатрическими расстройствами, такими как аутизм, эпилепсия, шизофрения и депрессия6,7,8,9,10. Таким образом, изучение перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияние на межжелудочковую миграцию в человеческом контексте становится критическиважным для решения патогенеза этих расстройств.
Мы создали человека перивентрикулярных, как эндотелиальные клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток в нашей лаборатории11, используя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) технология12,13. Чтобы проверить, имитируют ли человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки, верно имитируют мышиные перивентрикулярные эндотелиальные клетки, и количественно оценить их влияние на миграцию интернеров, мы разработали три анализы in vitro: анализ миграции на расстоянии, анализ миграции между культурой и анализ хемо-притяжения. Здесь мы подробно описываем протоколы этих анализов. Все три анализы основаны на использовании силиконовой культуры вставки для создания небольшой прямоугольный участок клеток (фиксированных размеров) в окружении клеточного пространства. Расстояние миграции оценивается путем измерения расстояния между конечными позициями ячеек от границы прямоугольного пятна, которое было изложено в день 0. В ходе дальнего анализа миграции человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки засеиваются в виде пластыря в центре 35-мм тарелки, и рассчитываются расстояния, пройденные клетками в течение длительного времени. В исследовании миграции сокультуры, человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки со-сеяные с человеческими интернейронами, как один патч в 35-мм блюдо. Эта установка позволяет изучить влияние прямых физических взаимодействий этих двух типов клеток на скорость миграции интернейронов. Химио-притяжения асссеизмерия измеряет миграцию интернейронов в ответ на химио-привлекательные сигналы, выделяемые перивентрикулярными эндотелиальными клетками человека. Interneurons посеяны как прямоугольный патч, с человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток и контроля не-перивентрикулярных эндотелиальных клеток, посеянных как аналогичные размеры патчи с обеих сторон. Каждый из ячеек патчи разделены клеточной свободной разрыв 500 мкм. Реакция межнейронов оценивается путем количественной оценки числа клеток, которые мигрировали в перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контролем неперивентрикулярных эндотелиальных клеток.
Эти анализы обеспечивают надежную оценку человеческих перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияния на интернеронную миграцию. Новая установка дальнего анализа и совместной культуры миграции анализ обеспечивает ячейки свободного пространства в диапазоне сантиметров (1-1,5 см), чтобы позволить обнаружение междугородной миграции. Краткое изложение особенностей наших анализов по сравнению с другими популярными анализами представлено в таблице 1. В совокупности, анализы, описанные здесь будет служить в качестве платформы для оценки "болезненных" перивентрикулярных эндотелиальных клеток и интернейронов, порожденных iPSCs расстройств головного мозга, как шизофрения, аутизм или эпилепсия. Эти анализы также могут быть использованы для определения того, как различные условия (например, ингибиторы, лиганды, РНК) влияют на миграцию клеток. Наконец, эти анализы могут быть оптимизированы для других типов клеток для измерения междугородной миграции, химиотерапии-притяжения или опосредоченной миграции клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура и хранение перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека
- Поддержание человеческого перивентрикулярного эндотелиальных клеток на подвале мембраны матричной покрытой (см. Таблица материалов) 6-ну хорошо пластин в перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среде (E6 среды, содержащей 50 нг/мл VEGF-A, 100 нг/мл FGF2 и 5 мКМ ГАМА) на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Изменение среды каждый альтернативный день.
- Оттепель подвал мембраны матрицы в 4 кВ, и сделать 1:100 решение, разбавляя его в холодной DMEM / F12 среды. Пальто каждый колодец из 6-колодец пластины с 1 мл матричного раствора. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере 1 ч перед использованием.
- Разрешить человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток, чтобы достичь выпуклости 80%-90%. Аспирная среда из колодца. Вымойте скважины один раз с 1 мл стерильных 1x PBS на скважину.
- Отсоедините клетки, добавив 1 мл раствора диссоциации клеток (см. Таблицу Материалов)на скважину. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Через 5 минут добавьте 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды. Перенесите клеточный раствор в коническую трубку 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем Accutase для диссоциации клеток здесь, в отличие от TrypLE в разделах 3 и 4. - Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, аспирации супернатант и resuspend клетки гранулы в 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среде.
- Подсчитайте живые клетки, используя метод исключения trypan blue. Семенные клетки в свежих матричных пластинах при плотности 1,2 х 105 клеток/см2. Инкубировать при 37 градусах По кв. м и 5% CO2.
- Храните перивентрикулярные эндотелиальные клетки путем криоконсервирования в замораживающей среде (90% перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды и 10% ДМСО).
- Диссоциатив и соберите ячейки следующие шаги 1.3 и 1.4 выше. Подсчитайте клетки в растворе методом исключения trypan blue.
- Центрифуги клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и resuspend клетки гранулы на 5 х 106 клеток / мл замораживания среды.
- Распределите 1 мл замораживания средних плюс клетки на криовые. Поместите флаконы в заполненную изопропанолой камеру и охладите на ночь в -80 градусов по Цельсию при 1 кв/мин. Перенесите флаконы в резервуар с жидким азотом на следующий день для длительного хранения.
2. Подготовка перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека для ассея
- Разрешить человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток, чтобы достичь 70%-80% confluency.
- Диссоциативные ячейки следующие шаги от 1,3 до 1,5, как описано выше. Подсчитайте ячейки, используя метод исключения trypan blue.
3. Подготовка человека ГАМК-интернейронов для ассе
ПРИМЕЧАНИЕ: Человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) полученных ГАМК-интернейронов и нейронной среды были коммерчески приобретены (см. Таблица материалов). Нейроны генерируются путем дифференциирования линии iPSC, полученной из фибробластов человека, следуя протоколу, разработанному производителем. Клетки были разморожены и культивированы в соответствии с протоколом производителя.
- Оттепель человека ГАМК interneurons и культуры их в 12-хорошо пластины в течение двух недель до флюенции 70%-80%.
- В день проведения асссея, теплый раствор диссоциации клеток (см. Таблица материалов)и аликвот нейрональной среды при 37 градусах По Цельсию в течение 10 минут перед использованием.
- Аспирная среда из каждого колодца, содержащего клетки. Вымойте клетки с 1 мл стерильных 1x PBS на скважину.
- Отсоедините клетки, добавив 0,5 мл предварительно разогретого раствора диссоциации на скважину и инкубируют при 37 градусах По Цельсию в течение 5 мин. Добавить 1 мл нейрональной среды на скважину. Перенесите раствор ячейки в коническую трубку 15 мл. Аккуратно triturate диссоциировать ячейки скопления.
- Центрифуги клетки на 380 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, аспирации супернатант и resuspend клеточной гранулы в 1 мл нейрональной среды. Подсчитайте живые клетки, используя метод исключения trypan blue.
4. Подготовка контроля человека эндотелиальных клеток для ассе
ПРИМЕЧАНИЕ: Управление человека iPSC полученных эндотелиальных клеток и эндотелиальной клеточной среды были коммерчески приобретены (Таблица материалов). Эти эндотелиальные клетки генерируются путем дифференциирования линии iPSC, полученной от фибробластов, на эндотелиальную судьбу в соответствии с протоколом, разработанным производителем. Клетки были разморожены и культивированы на субстрате Фибронектина в соответствии с протоколом производителя. Пластины с покрытием фибронектина были подготовлены по протоколу производителя.
- Оттепель контролировать человека эндотелиальных клеток и культуры их в 6-хорошо пластины с течением 80%-90%.
- В день проведения асссея, теплый раствор диссоциации клеток (см. Таблица материалов)и аликвот эндотелиальной среды при 37 градусах По Цельсию в течение 10 минут перед использованием.
- Аспирируй среду от каждого колодца, содержащего клетки. Вымойте клетки с 1 мл стерильных 1x PBS на скважину.
- Отсоедините клетки, добавив 0,5 мл предварительно разогретого раствора диссоциации на скважину. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 1 мл эндотелиальной клеточной среды на скважину, чтобы нейтрализовать раствор диссоциации. Перенесите раствор ячейки в коническую трубку 15 мл.
- Центрифуги клетки при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и resuspend клеточные гранулы в 1 мл эндотелиальной клеточной среды. Подсчитайте живые клетки, используя метод исключения trypan blue.
5. Подготовка одно-хорошего культуры вставки
- Оттепель 1 мг/мл раствор ламинина при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
- Пальто соответствующее количество 35 мм блюд с 0,01% поли-L-орнитинового раствора (1 мл на блюдо). Инкубировать блюда при комнатной температуре не менее 1 ч.
- Разбавить 1 мг/мл растворла ламинина 1:300 в стерильной воде до конечной концентрации 3,3 мкг/мл непосредственно перед использованием.
- Полностью аспирировать поли-L-орнитин с каждого блюда. Промыть каждое блюдо тщательно 3x с стерильной водой и аспирировать полностью, чтобы избежать поли-L-орнитин индуцированной токсичности клеток.
- Добавить 1 мл 3,3 мкг/мл ламинина раствор каждой тарелке и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь или по крайней мере 1 ч. Удалить раствор ламинина из блюда непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, хранить ламинин содержащие блюда в 4 кв. C. Перед использованием уравновешивать блюда в инкубаторе культуры клеток 37 градусов Цельсия. - Вырезать три стороны одной скважины из двух колодцев силиконовой культуры вставки (Рисунок 1А) с помощью стерильного лезвия для создания одной хорошо вставки (Рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите двухстороннюю вставку, прочно прикрепленную к поверхности оригинальной упаковки, чтобы обеспечить плавный разрез и защитить клей вставки. - Аспирный раствор ламинина из посуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не мыть посуду стерильными PBS или водой после инкубации ламинина. Влажные поверхности предотвратят плотную приливку вставки культуры. - Удалите одну хорошую вставку с стерильными пинцетом и поместите его в центрполи-L-орнитин / ламинин покрытием блюдо. Пресс по краям вставки, чтобы зафиксировать его на поверхность блюда.
- Аккуратно переверните блюдо вверх дном, чтобы убедиться, что вставка твердо придерживается.
- Держите блюдо вверх дном и пометить границу вставки отсека с помощью постоянного черного маркера с ультра-тонкий наконечник(Рисунок 1C).
6. Миграционный анализ междугородной
- Приостановить человека ГАМК-интернейронов в концентрации 3 х 104 клетки /70 Л нейронной среды. Семя 70 злител яточного раствора внутри каждой одной хорошо культуры вставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева интернейронов в зависимости от рекомендации производителя. - Приостановить человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки в концентрации 3 х 104 клетки/70 л перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды. Семя 70 злител яточного раствора внутри каждой одной хорошо культуры вставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество человеческих перивентрикулярных эндотелиальных клеток, посеянных в соотношении 1:1 с количеством семенных нейронов. - Добавьте 1 мл нейрональной среды в нейронную тарелку, чтобы заполнить область вокруг вставки и предотвратить покрытие от сушки. Аналогичным образом, добавить 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды в перивентрикулярной эндотелиальной клеточной тарелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить среду медленно вдоль края блюда, так что вставка не нарушается. - Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не протекают из вставки отсека.
- Инкубировать клетки для 24 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 24 ч инкубации, проверить под микроскопом, чтобы проверить, что клетки прикрепили должным образом и нет ночной утечки.
- После 48 ч посева, осторожно удалить вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что слой клетки остается нетронутым (день 0).
- Удалить среду из нейрона блюдо и добавить 1 мл свежей нейронной среды. Аналогичным образом, удалить средний из перивентрикулярной эндотелиальной клеточной тарелке и добавить 1 мл свежей перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите необходимое количество блюд и исправить с 4% PFA за день 0 изображений. - Инкубировать клетки в течение 5 дней при 37 градусах По цельсии и 5% CO2. Через 5 дней, удалить средний, исправить клетки с 4% PFA в течение 10 мин, и мыть 3x с 1x PBS.
- Нейроны пятен с античеловеческими антителами MAP2 или античеловеческими антителами MAP2, а также эндотелиальные клетки с антителами CD31 античеловека. В конце иммуностоинга, добавить 1 мл антифадеймонтаж среды для каждого блюда.
7. Миграционный ассс
- Со-приостановить 3 х 104 ГАМК-интернейронов и 3 х 104 человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток в 70 Зл со-культуры среды (50% перивентрикулярного обслуживания среды без ГАМК и 50% нейрональной среды). Семя этого клеточного раствора внутри односкважинного отсека вставки. Приготовьте соответствующее количество таких assay блюд.
ПРИМЕЧАНИЕ: ГАМК не был добавлен в среде совместной культуры, чтобы исключить влияние экзогенных ГАМК на миграцию. - Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не протекают из вставки отсека.
- Медленно добавьте 1 мл среды совместной культуры вдоль стороны блюда, чтобы предотвратить сушки покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить среду медленно вдоль края блюда, так что вставка не нарушается. - В качестве первого контроля, семена 3 х 104 человека ГАМК-интернейронов только в 70 Зл со-культуры среды на один хорошо вставки. Приготовьте соответствующее количество таких блюд.
- В качестве второго контроля, совместное семя 3 х 104 ГАМК-оргических человеческих интернейронов с 3 х 104 управления человека эндотелиальных клеток в 70 Зл со-культуры среды на один хорошо вставки. Приготовьте соответствующее количество блюд.
- Инкубировать блюда для 24 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 24 ч инкубации, проверить под микроскопом, чтобы проверить, что клетки прикрепили должным образом и нет утечки.
- После 48 ч посева, осторожно удалить вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что слой клетки не нарушается (день 0).
- Удалить средний и добавить 1 мл свежей среды ко-культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите в сторону соответствующее количество блюд для приобретения изображения день 0. - Инкубировать клетки в течение 5 дней при 37 градусах По цельсии и 5% CO2.
- Через 5 дней, удалить средний, исправить клетки с 4% PFA в течение 10 мин, и мыть 3x с 1x PBS.
- Пятно с анти-человеческим к-тубулин или анти-человеческих антител MAP2 для обозначения нейронов. В конце иммуностоинга, добавить 1 мл антифадеймонтаж среды для каждого блюда.
8. Химио-аттракцион Ассай
- Поместите трехскважинную культурную вставку в центр поли-L-орнитина/ламинина с покрытием 35 мм с помощью стерильных пинцетов.
- Переверните блюдо вверх дном. Отметьте границу вокруг среднего отсека вставки, используя постоянный черный маркер с ультра-тонким наконечником.
- Семена 3 х 104 человека ГАМК-интернейронов в среднем отсеке в 70 Зл нейронной среды(рисунок 3A).
- Семя 104 человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток в 70 Зл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды и 104 контроль эндотелиальных клеток в 70 Зл управления эндотелиальной клеточной среды в двух внешних отсеков соответственно(Рисунок 3A).
- Добавить 1 мл со-культуры среды (50% перивентрикулярного обслуживания среды без ГАМК и 50% нейрональной среды) вдоль стороны блюда, чтобы предотвратить покрытие на блюдо от сушки.
- Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не протекают из вставки отсека.
- Инкубировать клетки для 24 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 24 ч инкубации, проверить под микроскопом, чтобы проверить, что клетки прикрепили должным образом и нет утечки.
- После 48 ч посева, осторожно удалить вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что слой клетки не нарушается (день 0).
- Удалить средний и добавить 1 мл свежей среды ко-культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите необходимое количество блюд для изображения дня 0. - Инкубировать клетки для 36 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 36 ч, аспир среднего, исправить клетки с 4% PFA в течение 10 мин, и мыть 3x с 1x PBS.
- Пятно человека ГАМК-интернейронов с анти-человека-тубулин или анти-человеческих антител MAP2. В конце процедуры окрашивания, добавить 1 мл антифадемонтаж монтажа среды в каждом блюде.
9. Визуализация и анализ данных
- Поместите блюдо с иммунозапятнанными анализами под микроскопом при 4X увеличении.
- Держите один длинный край прямоугольной границы (сделанный в шаге 5.10 выше) в поле зрения. Сфотографировать клетки в свободном от клеток пространстве, прилегающем к этой границе. Приобретайте изображения вдоль правого длинного края и левого длинного края прямоугольной границы(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, расположенные по диагонали по отношению к прямоугольнику, не рассматриваются из-за двусмысленности при выборе короткого или длинного края в качестве стартовой отметки. Кроме того, число клеток, мигрирующих через короткий край, часто значительно меньше (возможно, из-за меньшего числа начальных ячеек вдоль короткого края) и не учитываются. - Откройте изображения в ImageJ. Рассчитайте расстояние между каждой ячейкой и пограничной отметкой(рисунок 2D)с помощью ImageJ.
- Для оценки миграции с точки зрения числа клеток установите определенное расстояние от границы на полученном изображении в ImageJ. Подсчитайте количество ячеек, присутствующих на этом расстоянии. Рассчитать среднее число, стандартное отклонение и статистическую значимость с помощью соответствующего программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаги по настройке одной хорошо культуры вставки внутри 35 мм блюдо показано на рисунке 1. Анализ миграции на расстоянии и анализ миграции сокультуры использовали одну хорошую вставку, чтобы сеять нужное количество клеток в центре поли-L-орнитина/ламинина с покрытием 35 мм. На день 0, клетки присутствовали как прямоугольный заплата(Рисунок 2A,C). В день 0 изображений, день 0 линия может быть легко идентифицирована по резкому краю клеточного слоя (белая пунктирная линия на рисунке 2C). К 48 ч, клетки мигрировали в клеточное пространство(Рисунок 2B,D). В после-дневный 0 изображений, черная граница обращается вокруг вставки (в задней части блюда) можно четко рассматривать как черный разрыв. Край зазора был назначен в качестве линии дня 0 (белая пунктирная линия на рисунке 2D). Как упоминалось в Шаге 9.2, для анализа данных рассматривались только те ячейки, которые упали в районе, прилегающем к правому и левому длинным краям клеточного слоя (желтая область на рисунке 2B). Расстояние, пройденное ячейкой, измерялось путем расчета расстояния между ячейкой (белая стрелка на рисунке 2D)и линией дня 0. Иммуноцитохимическое окрашивание с антителом anti-active Caspase 3, маркером апоптоза, не показало апоптотический сигнал в семенных клетках(рисунок 2E). В анализе миграции сокультуры, когда интернейроны были совместно посеяны с человеческими перивентрикулярными эндотелиальными клетками, нейроны преодолевали более отдаленные расстояния по сравнению с тем, когда интернейроны были посеяны в одиночку или когда со-сеяные с контролем эндотелиальных клеток(Рисунок 2F). Кроме того, для того же диапазона расстояния, большее число interneurons мигрировали, когда совместно семенами с перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с interneurons в двух других группах. Это показывает, что, как мышь перивентрикулярных эндотелиальных клеток, человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток способствовать миграции человека интернерон.
В химио-притяжения ассссе, используя три колодца культуры вставки, человеческие interneurons были посеяны в виде небольшой прямоугольный патч в 35 мм поли-L-орнитин / ламинин покрытием культуры блюдо. Перивентрикулярные эндотелиальные клетки и контроль неперивентрикулярных эндотелиальных клеток были посеяны как патчи по обе стороны от нейронального патча, с разрывом между каждым патч составляет 500 мкм (Рисунок 3A). Число интернейронов, которые мигрировали в сторону перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контролем эндотелиальных клеток была количественно после 36 ч. Значительно большее число интернейронов мигрировали к перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контролем эндотелиальных клеток (Рисунок 3B, C), подтверждающие, что ГАМК-интернейроны отвечают избирательно химио-привлекательные сигналы, выделяемые человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток.
Рисунок 1: Подготовка культуры вставки. (A) Двух-хорошая вставка культуры. (B) Односторонней вставкой, закрепленной в центре 35-мм тарелки. (C) Контур прямоугольного пятна, как наблюдается после удаления вставки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема и репрезентативный результат миграционного результата. (A) Схема клеточного слоя (красный прямоугольник) на день 0. (B) Схема клеток, мигрирующих в пространство, свободное от клеток. Красные точки указывают на мигрирующие ячейки. В желтой области отмечена область, которая изображена для получения данных. Пунктирная коробка в A и B соответствует области, показанной в панелях C и D. (C,D) Представитель флуоресцентные изображения анти-я-Тубулин антитела помечены interneurons на день 0 (C) и день 2 (D) миграции асссее. Белая пунктирная линия отмечает день 0. В желтой линии D указывается расстояние, пройденное клеткой (отмечено белой стрелкой) в 48 ч. (Е) Нейроны (на 0-й день) обозначены совместно антителами против о-тубулина (красный) и антителами caspase 3 (зелеными), которые отмечают апоптотические клетки. Ядра окрашены DAPI (синий). Апоптотические клетки не были обнаружены в семенных клетках. (F) График с 5-го дня исследования сокультуры, где количество интернейронов, которые мигрировали, построено на расстоянии пройденного. По сравнению с интернейронами, которые были посеяны в одиночку или совместно с контролем эндотелиальных клеток, interneurons совместно семенами с перивентрикулярных эндотелиальных клеток мигрировали в более высоких количествах, а также путешествовал дальше. Данные представляют собой среднее s.D (n no 5;pqlt;0.01,pslt; 0.001, Студенческий тест). Шкала баров - 100 мкм. In - интернейроны; PV EC - перивентрикулярные эндотелиальные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Химио-притяжение асссе. (A) Схема химио-притяжения ассссе. Используя трехскважинную культурную вставку, интернейроны (IN) были посеяны в середине (зеленый пунктирный прямоугольник), в то время как перивентрикулярные эндотелиальные клетки (PV ECs; оранжевый пунктирпрямой прямоугольник) и контроль эндотелиальных клеток (ECs; желтый пунктирный прямоугольник) были посеяны по обе стороны. (B) Изображения з-Тубулин помечены interneurons показаны надежные миграции в сторону перивентрикулярных эндотелиальных клеток, но не к контролю эндотелиальных клеток. (C) Количественная оценка химио-привлекательной реакции интернейронов. Значительно большее число нейронов мигрировало в перивентрикулярные эндотелиальные клетки, чем на контроль эндотелиальных клеток. Данные представляют собой среднее S.D (n No 5;p qlt; 0,05, тест студента t). Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| A | Преимущества | Ограничения |
| Бойден камеры асссе16,17 | · Технически не требовательный · Подходит для клеток адектов и неприсоединения · Может быть изменен для изучения влияния паракринных сигнализации или химио-аттракторов на миграцию клеток |
· Конечный ассеид. Не подходит для визуализации в режиме реального времени. · Не подходит для изучения влияния прямого взаимодействия клеток на миграцию |
| Царапина асссе18 | · Конечная точка или кинетический · Технически не требовательный |
· Анализ миграции длиной в несколько сотен микрометров. Не подходит для изучения междугородной миграции в диапазоне 1-2 см. · Не подходит для подвесных клеток · Вариации в области нуля |
| Анализ миграции на большие расстояния | · Конечная точка или кинетический · Позволяет изучать миграцию на большие расстояния от 1,5 до 2 см · Технически не требовательный |
· Не подходит для подвесных клеток |
| Контроль миграции сокультуры | · Конечная точка или кинетический · Позволяет изучать влияние прямого контакта клеток на миграцию · Позволяет миграцию длиной до 1,5-2 см · Технически не требовательный |
· Не подходит для подвесных клеток |
| B | Преимущества | Ограничения |
| Бойден камеры асссе | · Технически не требовательный · Подходит для клеток адектов и неприсоединения |
· Конечный ассеид. Не подходит для живой визуализации. · Крутой градиент концентрации |
| Под-агароуз ассса19 | · Технически не требовательный · Два или более химиопривлекательных сигналов могут быть произнаны в одном наборе |
· Не подходит для клеток адептов. Ограничено в основном кровяными клетками. · Сложная визуализация клеток в агарозе |
| Капиллярная камера миграции асссе20,21 | · Конечная точка или кинетический · Подходит для клеток адепта или подвесных клеток |
· Нужны специальные камеры |
| Микрофлюидическое устройство22 | · Генерирует управляемый и стабильный градиент концентрации · Позволяет одноклеточное разрешение уровня |
· Нужны сложные устройства и инструменты · Технически требовательный и крутой кривой обучения · Комплексная визуализация и анализ данных |
| Химио-притяжение асссе | · Конечная точка или кинетический · Градиент постепенной концентрации · Подходит для визуализации в режиме реального времени или флуоресцентных изображений · Технически не требовательный |
· Не подходит для подвесных клеток |
Таблица 1: Сравнение методов асссесима. (A) Сравнение общих анализов миграции in vitro с анализом миграции на расстоянии и анализом совместной культуры. (B) Сравнение общих анализов химиотаксиса с химио-притяжения анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали три in vitro анализы, которые вместе обеспечивают количественную оценку человека перивентрикулярных эндотелиальных клеточных свойств. Эти анализы будут полезны в получении механистических понимание взаимодействия человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток с человеческими интернейронами. Эксперименты с использованием лигандов, ингибиторов или клеток с генно-специфическим нокдауном или переэкспрессией будут определять или проверять молекулярные плееры, которые посредничают эндотелиальную клеточную интерферонную миграцию или междугородние миграционные свойства перивентрикулярных эндотелиальных клеток. Эти анализы также могут быть изменены для выполнения живых клеточных исследований миграции. Кроме того, есть доказательства взаимодействия эндотелиальных клеток с клетками, не межнейронами. Исследования нашей группы и других стран ссылались на влияние перивентрикулярных эндотелиальных клеток на узорство проекционных нейронов и пролиферацию нервных клеток-предшественников5,14,15. Было бы интересно проверить эти возможные взаимодействия с помощью наших настроек анализа. Наконец, эти анализы послужат платформой для оценки больных перивентрикулярных эндотелиальных клеток. Наша работа установила новые автономные связи между перивентрикулярной сосудистой сети и происхождение нейропсихиатрических расстройств, как шизофрения, эпилепсия, аутизм, и депрессия3,5. Эти анализы будут иметь неоценимое значение в выявлении потенциальных дефектов в миграции на большие расстояния, химиотерапии-притяжения, или juxtracrine сигнализации больных-перивентрикулярных эндотелиальных клеток в этих условиях нейропсихиатрического расстройства.
Эти анализы являются простыми, воспроизводимыми и низкой стоимостью, и они могут быть изменены для измерения миграции клеток и эффектов совместной культуры или химио-привлекательных сигналов на миграцию в различных типах клеток, за исключением неприсоединения клеток. Есть несколько важных шагов, которые необходимо вынести для получения точных и воспроизводимых результатов. Во-первых, очень важно оптимизировать номер ячейки для каждого асссе. Количество клеток, которые должны быть посеяны в одном отсеке, должно зависеть от типа клеток, желаемого уровня стельности и конкретных факторов, таких как соотношение сокультуры. Во-вторых, необходимо оптимизировать среду клеточной культуры для каждого асссе. В исследовании миграции сокультуры и химио-притяжения, где более одного типа клеток посеяно в одном блюде, среда асссея должна быть благоприятной для всех типов клеток. В экспериментальных экспериментах мы изучали влияние среды совместной культуры на жизнеспособность (с использованием метода исключения трипан синего) и морфологии (с использованием иммуноцитохимии) каждого типа клеток. Мы культивировали человеческие ГАМК-нейроны с средой совместной культуры в течение одной недели и не наблюдали существенной разницы в жизнеспособности и морфологии нейронов в среде совместной культуры по сравнению с нейронами, культивированными в нейрональной среде. Аналогичным образом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки и контроль эндотелиальных клеток, культивируемых в среде совместной культуры в течение двух проходов, не показали каких-либо значительных изменений в выживании клеток и морфологии. В-третьих, поскольку скорость миграции варьируется в зависимости от различных типов клеток, важно определить временные рамки для каждого исследуемого типа ячейки (ы). В-четвертых, очень важно тщательно обрабатывать вставки культуры. Вставки должны быть закреплены твердо на блюдо, мягко нажав кончиком пальца. Блюдо должно быть перевернуто вверх дном, чтобы убедиться, что вставка не движется. Следует также принимать меры при удалении вставки, чтобы не беспокоить клеточный слой. Наконец, рекомендуется увеличить размер выборки, чтобы уменьшить экспериментальную изменчивость.
В заключение, эти анализы значительно расширят наше понимание человеческой перивентрикулярной эндотелиальной клеточной биологии и ее роли в развитии мозга в нормальных и больных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана наградами От Национального института психического здоровья (R01MH10438) и Национального института неврологических расстройств и инсульта (R01NS100808) а.В.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O.
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M.
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
