人干细胞来源的内皮细胞与GABA能神经元的迁移、趋化吸引及共培养实验

摘要

我们介绍了三种简单的体外实验方法——长距离迁移实验、共培养迁移实验和化学趋化实验，这些实验共同评估了人干细胞来源的室管膜周围内皮细胞的功能及其与GABA能中间神经元的相互作用。

摘要

脑血管系统在神经系统发育及脑部疾病病因学中的作用正日益受到关注。我们近期的研究发现了一类特殊的血管细胞——室周内皮细胞，这类细胞在胚胎发育过程中对前脑GABA能中间神经元的迁移和分布起着关键作用。这一发现，结合其细胞自主性功能，提示室周内皮细胞在精神分裂症、癫痫和自闭症等神经精神疾病病理过程中可能具有新的作用。本文描述了三种不同的体外实验方法，可综合评估室周内皮细胞的功能及其与GABA能中间神经元的相互作用。特别是在人类研究背景下应用这些实验方法，将有助于揭示室周内皮细胞与脑部疾病之间的关联。这些实验方法操作简便、成本低廉、可重复性强，且可轻松适用于任何贴壁细胞类型。

引言

内皮细胞构成血管壁的内衬，介导多种重要功能，包括维持血管壁通透性、调节血流、血小板聚集以及新生血管的形成。在大脑中，内皮细胞是关键的血脑屏障的组成部分，严格调控脑组织与血液之间物质的交换¹。我们过去十年的研究发现了脑内皮细胞具有新的促神经发生作用，这对脑发育和行为具有重要意义^2,3,4,5。我们已证明小鼠胚胎前脑由两种不同亚型的血管进行血管化，即软脑膜血管和室管膜周围血管，二者在解剖结构、起源和发展模式上均存在差异²。衬于这两类血管亚型的内皮细胞在基因表达谱上表现出明显差异。软脑膜内皮细胞主要表达与炎症和免疫反应相关的基因，而室管膜周围内皮细胞则特异性高表达与神经发生、神经元迁移、趋化性和轴突导向相关的基因³。室管膜周围内皮细胞还含有一个不同于传统神经元GABA信号通路的新型GABA信号通路⁵。与其基因表达特征一致，研究发现室管膜周围内皮细胞可调控发育中新皮层中GABA能中间神经元的迁移与分布。在胚胎发育过程中，室管膜周围内皮细胞沿腹侧-背侧梯度进行长距离迁移，从而建立室管膜周围血管网络<....

方案

1. 人脑室周围内皮细胞的培养与保存

1. 将人脑室周围内皮细胞培养于基底膜基质包被的（见材料表）6孔板中，使用脑室周围内皮细胞培养基（E6培养基，含50 ng/mL VEGF-A、100 ng/mL FGF2和5 µM GABA），在37 °C、5% CO₂条件下培养。每隔一天更换一次培养基。
2. 在4 °C条件下解冻基底膜基质，用冷的DMEM/F12培养基将其稀释成1:100的溶液。每孔加入1 mL基质溶液对6孔板各孔进行包被。使用前将培养板在37 °C孵育至少1小时。
3. 待人脑室周围内皮细胞生长至80%–90%融合度时，吸除孔内培养基。每孔加入1 mL无菌1×PBS洗涤一次。
4. 每孔加入1 mL细胞解离液（见材料表）使细胞脱离。在37 °C孵育5分钟。5分钟后，每孔加入1 mL脑室周围内皮细胞培养基。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
   注：此处使用Accutase进行细胞解离，而第3和第4部分则使用TrypLE。
5. 在室温下以500 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL脑室周围内皮细胞培养基中。
6. 采用台盼蓝排斥法计数活细胞。以1.2 × 10⁵ 个细胞/cm²的密度将细胞接种至新鲜基质包被的培养板中。在37 °C、5% CO_2....

结果

在35 mm培养皿内设置单孔培养插件的步骤如图1所示。长距离迁移实验和共培养迁移实验均采用单孔插件，将所需数量的细胞接种于经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的35 mm培养皿中央。在第0天，细胞呈矩形区域分布（图2A,C）。在第0天的图像中，可通过细胞层的清晰边缘（图2C中的白色虚线）轻松识别第0天线。48小时后，细胞已迁移至无细胞区域（图2B,D）。在第0天之后的图像中，围绕插件（位于培养皿背面）绘制的黑色边框可清晰观察为一条黑色间隙。该间隙的边缘被定义为第0天线（图2D中的白色虚线）。如步骤9.2所述，仅将位于细胞层左右长边相邻区域内的细胞.......

讨论

本文描述了三种体外实验方法，这些方法共同提供了对人脑室周围内皮细胞特异性特性的定量评估。这些实验方法将有助于深入理解人脑室周围内皮细胞与人中间神经元之间的相互作用机制。通过使用配体、抑制剂，或基因特异性敲低或过表达的细胞进行实验，可鉴定或验证介导内皮细胞引导的中间神经元迁移，或脑室周围内皮细胞长距离迁移特性的分子因子。这些实验方法还可进行改造，用于活细胞延时成像迁移研究。此外，已有证据表明内皮细胞与其他非中间神经元细胞之间也存在相互作用。我们课题组及其他团队的研究提示，脑室周围内皮细胞可能影响投射神经元的模式形成以及神经前体细胞的增殖^5,14,15。利用本实验体系检验这些潜在的相互作用将具有重要意义。最后，这些实验方法可作为评估疾病状态下脑室周围内皮细胞功能的平台。我们的研究已建立了脑室周围血管网络与精神神经疾病（如精神分裂症、癫痫、自闭症和重度抑郁症）发生之间新的自主性关联^3,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase 解离液	Millipore Sigma	SCR005	细胞解离液（用于脑室周围内皮细胞，步骤 1.4）
抗人 β-微管蛋白抗体	Biolegend	802001
抗人 CD31 抗体	Millipore Sigma	CBL468
抗 MAP2 抗体	Neuromics	CH22103
抗活化型 Caspase 3 抗体	Millipore Sigma	AB3623
对照人内皮细胞	Cellular Dynamics	R1022
对照内皮细胞培养基添加剂	Cellular Dynamics	M1019
冻存管	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 培养基	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 培养基	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
纤连蛋白	Thermofisher Scientific	33016-015
程序降温盒	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629
人 GABA 能神经元	Cellular Dynamics	R1013
人 GABA 能神经元基础培养基	Cellular Dynamics	M1010
人 GABA 能神经元神经添加剂	Cellular Dynamics	M1032
层粘连蛋白	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	基底膜基质
封片剂	Vector laboratories	H-1200
多聚-L-鸟氨酸	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
台盼蓝	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	细胞解离液（用于 GABA 能中间神经元和内皮细胞，第 3 和第 4 部分）
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF 完全培养基试剂盒	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	对照人内皮细胞培养基的组分
2 孔硅胶细胞培养插件	ibidi	80209
3 孔硅胶细胞培养插件	ibidi	80369
35 mm 培养皿	Corning	430165
15 ml 锥形离心管	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA 溶液	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6 孔组织培养板	Fisher Scientific	14-832-11
倒置相差显微镜	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
荧光显微镜	Olympus	FSX-100