Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

doi: 10.3791/60295 Published: January 23, 2020

Summary

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Abstract

Rol van hersenvasculatuur in de ontwikkeling van het zenuwstelsel en etiologie van hersenaandoeningen krijgt steeds meer aandacht. Onze recente studies hebben een speciale populatie van vasculaire cellen geïdentificeerd, de periventrtriculaire endotheelcellen, die een cruciale rol spelen bij de migratie en distributie van voorhersenen GABAergic interneuronen tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit, in combinatie met hun cel-autonome functies, zinspeelt op nieuwe rollen van periventricular endotheliale cellen in de pathologie van neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie, epilepsie en autisme. Hier hebben we drie verschillende in vitro tests beschreven die gezamenlijk de functies van periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen evalueren. Het gebruik van deze tests, met name in een menselijke context, zal ons in staat stellen om het verband tussen periventricular endotheliale cellen en hersenaandoeningen te identificeren. Deze tests zijn eenvoudig, lage kosten, en reproduceerbaar, en kan gemakkelijk worden aangepast aan elk aanhangend celtype.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endotheelcellen vormen het slijmvlies van bloedvaten en bemiddelen belangrijke functies zoals het onderhoud van de doorlaatbaarheid van de vaatwand, regulering van de bloedstroom, bloedplaatjesaggregatie en vorming van nieuwe bloedvaten. In de hersenen maken endotheelcellen deel uit van een kritische bloed-hersenbarrière die de uitwisseling van materialen tussen de hersenen en de bloedbaan strak controleert1. Onze studies in het afgelopen decennium hebben nieuwe neurogene rollen van hersenendotheliale cellen geïdentificeerd die aanzienlijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van de hersenen en gedrag2,3,4,5. We hebben aangetoond dat de embryonale voorhersenen van de muis gevasculariseerd is door twee verschillende subtypen vaten, de pialvaten en de periventrculaire vaten, die verschillen in anatomie, oorsprong en ontwikkelingsprofiel2. Endotheelcellen langs deze twee soorten vaartuigen vertonen duidelijke verschillen in hun genexpressieprofielen. Terwijl piale endotheelcellen meestal genen met betrekking tot ontsteking en immuunrespons uitdrukken, zijn periventrtriculaire endotheelcellen uniek verrijkt in expressie van genen die vaak geassocieerd worden met neurogenese, neuronale migratie, chemotaxis en axonbegeleiding3. Periventricular endotheliale cellen ook huis een nieuwe GABA signalering pad dat is onderscheiden van de traditionele neuronale GABA signalering pad5. Gelijktijdig met zijn genexpressie bleken periventrtriculaire endotheelcellen de migratie en distributie van GABAergic interneuronen in de zich ontwikkelende neocortex te reguleren. Tijdens de embryonale ontwikkeling ondergaan periventricular endotheliale cellen langdurige migratie langs een ventrale ruggradiënt om het periventrtriculaire vasculaire netwerk vast te stellen2,3. Deze migratieroute wordt een dag later gespiegeld door interneuronen. Migrerende interneuronen interageren fysiek met het vooraf gevormde periventrtriculaire vasculaire netwerk en gebruiken het als een geleiderail om hun eindbestemming in de neocortex te bereiken. Naast het fungeren als een fysiek substraat, periventricular endotheliale cellen dienen als de bron van navigatie signalen voor migrerende neuronen. Periventricular endotheliale cel-uitgescheiden GABA gidsen interneuron migratie en reguleert hun uiteindelijke distributie patronen4. Defecten in interneuron migratie en distributie worden geassocieerd met neuropsychiatrische stoornissen zoals autisme, epilepsie, schizofrenie en depressie6,7,8,9,10. Daarom wordt studie van periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuronmigratie in menselijke context van cruciaal belang voor het aanpakken van de pathogenese van deze aandoeningen.

We hebben menselijke periventrtriculaire-achtige endotheelcellen gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen in ons laboratorium11, met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie12,13. Om te valideren of menselijke periventricular endotheelcellen getrouw muisperiventricular endotheliale cellen nabootsen, en om hun invloed op interneuronmigratie kwantitatief te beoordelen, ontwikkelden we drie in vitro tests: een lange afstandsmigratietest, een co-cultuurmigratietest en een chemo-aantrekkelijkheidstest. Hier beschrijven we protocollen voor deze testen in detail. Alle drie de tests zijn gebaseerd op het gebruik van siliconen cultuur inserts om een kleine rechthoekige patch van cellen (van vaste afmetingen) omgeven door celvrije ruimte te creëren. Migratieafstand wordt geëvalueerd door de afstand tussen de eindposities van cellen te meten vanaf de rand van de rechthoekige patch die op dag 0 is beschreven. In de lange afstand migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen worden gezaaid als een patch in het midden van een 35 mm schotel, en de afstanden afgelegd door de cellen over een lange reeks van tijd worden berekend. In de co-cultuur migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen zijn co-gezaaid met menselijke interneuronen als een patch in een 35 mm schotel. Deze opstelling maakt het mogelijk om het effect van directe fysieke interacties van deze twee celtypen op de mate van migratie van interneuronen te onderzoeken. De chemo-attractie test meet de migratie van interneuronen in reactie op chemo-aantrekkelijke signalen afgescheiden door menselijke periventricular endotheliale cellen. Interneuronen worden gezaaid als een rechthoekige patch, met menselijke periventrtriculaire endotheelcellen en controle niet-perivefntricular endotheliale cellen gezaaid als vergelijkbare grootte patches aan weerszijden. Elk van de celpleisters wordt gescheiden door een celvrije kloof van 500 μm. De respons van interneuronen wordt beoordeeld door het aantal cellen te kwantificeren dat naar periventricular endotheliale cellen is gemigreerd in vergelijking met de controle van niet-periventrtriculaire endotheelcellen.

Deze tests bieden een robuuste beoordeling van menselijke periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuron migratie. De nieuwe opzet van lange afstand test en co-cultuur migratie test biedt cel-vrije ruimte in het bereik van centimeters (~ 1-1,5 cm) om detectie van lange afstand migratie mogelijk te maken. Een samenvatting van de kenmerken van onze tests in vergelijking met andere populaire tests wordt gepresenteerd in tabel 1. Gezamenlijk, de testen hier beschreven zal dienen als een platform voor de beoordeling van "zieke" periventricular endotheliale cellen en interneuronen gegenereerd uit iPSCs van hersenaandoeningen zoals schizofrenie, autisme of epilepsie. Deze tests kunnen ook worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende aandoeningen (bijvoorbeeld remmers, liganden, RNAi) de celmigratie beïnvloeden. Ten slotte kunnen deze tests worden geoptimaliseerd voor andere celtypen om migratie over lange afstand, chemo-aantrekkingskracht of celcelgemedieerde migratie te meten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Cultuur en opslag van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen

  1. Handhaven van menselijke periventrtriculaire endotheelcellen op keldermembraan matrix-gecoate (zie Tabel van Materialen) 6-put platen in periventricular endotheliale celmedium (E6 medium met 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 en 5 μM GABA) bij 37 °C en 5% CO2. Verander elke dag van medium.
  2. Ontdooi keldermembraanmatrix in 4 °C en maak een 1:100 oplossing door deze te verdunnen in koud DMEM/F12 medium. Bestrijk elke put van een 6-put met 1 mL matrixoplossing. Incubeer platen bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
  3. Laat menselijke periventricular endotheliale cellen om een samenvloeiing van 80%-90% te bereiken. Aanzuigenmedium uit de put. Was de putten één keer met 1 mL steriele 1x PBS per put.
  4. Maak cellen los door 1 mL celdissociatieoplossing toe te voegen (zie Materiaaltabel)per put. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Voeg na 5 min 1 mL periventricular endotheliale celmedium toe. Breng de celoplossing over in een conische buis van 15 mL.
    OPMERKING: We gebruiken Accutase voor celdissociatie hier, in tegenstelling tot TrypLE in de secties 3 en 4.
  5. Centrifugecellen bij 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur, zuigen de supernatant aan en schorsen de celpellet in 1 mL periventricular endothelial cell medium.
  6. Tel levende cellen met de trypanblauwe uitsluitingsmethode. Zaadcellen in verse matrixgecoate platen met een dichtheid van 1,2 x 105 cellen/cm2. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
  7. Bewaar menselijke periventrtriculaire endotheelcellen door cryopreserving in vriesmedium (90% periventrtriculair endotheel celmedium en 10% DMSO).
    1. Los en verzamel cellen na de stappen 1.3 en 1.4 hierboven. Tel cellen in de oplossing met de trypan blauwe uitsluitingsmethode.
    2. Centrifugecellen bij 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Aanzuigen van de supernatant en opnieuw opschorten van de cel pellet op 5 x 106 cellen / mL van bevriezing medium.
    3. Doseer 1 mL vriesmedium plus cellen per cryovial. Plaats de flesjes in isopropanol gevulde kamer en koel 's nachts af in -80 °C bij 1 °C/min. Breng vials op de volgende dag over naar een vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag.

2. Voorbereiding van menselijke periventricular endotheliale cellen voor test

  1. Laat menselijke periventricular endotheliale cellen te bereiken 70%-80% samenvloeiing.
  2. Decellen scheiden naar aanleiding van de stappen 1.3 tot en met 1.5, zoals hierboven beschreven. Tel cellen met de methode trypan blauwe uitsluiting.

3. Voorbereiding van menselijke GABAergic Interneuronen voor Test

OPMERKING: Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide GABAergic interneuronen en het neuronale medium werden commercieel aangekocht (zie Tabel met materialen). De neuronen worden gegenereerd door het differentiëren van een menselijke fibroblast-afgeleide iPSC lijn na een protocol ontwikkeld door de fabrikant. De cellen werden ontdooid en gekweekt volgens het protocol van de fabrikant.

  1. Ontdooi menselijke GABAergic interneuronen en kweek ze in 12-put plaat gedurende twee weken tot een samenvloeiing van 70%-80%.
  2. Op de dag van de test, warme celdissociatieoplossing (zie Tabel met materialen) en een aliquot van neuronal medium bij 37 °C gedurende 10 minuten voor gebruik.
  3. Aanzuigenmedium uit elke put die de cellen bevat. Was cellen met 1 mL steriele 1x PBS per put.
  4. Maak cellen los door 0,5 mL voorverwarmde dissociatieoplossing per put toe te voegen en uit te broeden bij 37 °C gedurende 5 min. Voeg 1 mL neuronalmedium per put toe. Breng celoplossing over in een conische buis van 15 mL. Voorzichtig triturate om celklontjes te scheiden.
  5. Centrifugecellen bij 380 x g voor 5 min bij kamertemperatuur, zuigen de supernatant aan en schorsen de celpellet in 1 mL neuronal medium. Tel levende cellen met de trypanblauwe uitsluitingsmethode.

4. Voorbereiding van controle menselijke endotheliale cellen voor test

OPMERKING: Controle menselijke iPSC-afgeleide endotheelcellen en endotheel celmedium werden commercieel gekocht (Tabel met materialen). Deze endotheelcellen worden gegenereerd door het differentiëren van een menselijke fibroblast-afgeleide iPSC lijn endotheel lot na een protocol ontwikkeld door de fabrikant. De cellen werden ontdooid en gekweekt op Fibronectin substraat volgens het protocol van de fabrikant. Fibronectin-gecoate platen werden bereid volgens het protocol van de fabrikant.

  1. Dooi controle menselijke endotheelcellen en cultuur ze in 6-put plaat tot een samenvloeiing van 80%-90%.
  2. Op de dag van de test, warme celdissociatieoplossing (zie Tabel met materialen) en een aliquot van endotheelmedium bij 37 °C gedurende 10 minuten voor gebruik.
  3. Aanzuigen van het medium uit elke put met de cellen. Was cellen met 1 mL steriele 1x PBS per put.
  4. Maak cellen los door 0,5 mL voorverwarmde dissociatieoplossing per put toe te voegen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 1 mL endotheel celmedium per put toe om de dissociatieoplossing te neutraliseren. Breng celoplossing over in een conische buis van 15 mL.
  5. Centrifugecellen bij 200 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Aanzuigen supernatant en opnieuw opschorten van de cel pellet in 1 mL van endotheel celmedium. Tel levende cellen met de trypanblauwe uitsluitingsmethode.

5. Voorbereiding van een-goed cultuur inserts

  1. Ontdooi 1 mg/mL laminineoplossing bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
  2. Bestrijk een passend aantal 35 mm gerechten met 0,01% poly-L-ornithine oplossing (1 mL per schotel). Incubeer de gerechten in kamertemperatuur voor ten minste 1 uur.
  3. Verdun 1 mg/mL laminineoplossing 1:300 in steriel water tot een eindconcentratie van 3,3 μg/mL onmiddellijk voor gebruik.
  4. Volledig aanzuigen poly-L-ornithine van elke schotel. Spoel elke schotel grondig 3x met steriel water en aanzuigen volledig om poly-L-ornithine-geïnduceerde cel toxiciteit te voorkomen.
  5. Voeg 1 mL laminineoplossing van 3,3 μg/mL aan elke schotel toe en incubeer 's nachts bij 37 °C of ten minste 1 uur. Verwijder laminineoplossing uit de schaal vlak voor gebruik.
    LET OP: Bewaar de laminhoudende gerechten ook in 4 °C. Equilibrate de gerechten in een 37 °C cel kweek incubator voor gebruik.
  6. Snijd drie zijden van een put van een twee-goed siliconen cultuur insert(figuur 1A) met behulp van een steriel blad om een een-goed insert(figuur 1B)te genereren.
    OPMERKING: Houd de twee-goed insert stevig bevestigd aan het oppervlak van de originele verpakking tijdens het snijden om een gladde snede te garanderen en de kleefkracht van de wisselplaat te beschermen.
  7. Aanzuigen lamininoplossing van de gerechten.
    LET OP: Was de afwas niet met steriele PBS of water na de incubatievan lamine. Natte oppervlakken voorkomt een strakke hechting van de kweekinsert.
  8. Verwijder een goed insert met steriele pincet en plaats het in het midden van de poly-L-ornithine / laminin gecoate schotel. Druk langs de randen van de insert om het te bevestigen aan het oppervlak van de schotel.
  9. Draai de schotel voorzichtig ondersteboven om te controleren of de wisselplaat stevig is vastgezet.
  10. Houd de schotel ondersteboven en markeer de grens van het wisselplaatvak met behulp van een permanente zwarte markering met een ultrafijne punt(figuur 1C).

6. Lange-afstandsmigratietest

  1. Schort menselijke GABAergic interneuronen op bij een concentratie van 3 x 104 cellen/70 μL neuronalmedium. Zaad 70 μL celoplossing in elke eenputcultuurinsert.
    OPMERKING: De zaaidichtheid van interneuronen is volgens de aanbeveling van de fabrikant.
  2. Schorsen de menselijke periventricular endotheelcellen bij een concentratie van 3 x 104 cellen/70 μL periventricular endotheelcelmedium. Zaad 70 μL celoplossing in elke eenputcultuurinsert.
    OPMERKING: Het aantal menselijke periventrtriculaire endotheelcellen gezaaid op een 1:1 verhouding met het aantal gezaaide neuronen.
  3. Voeg 1 mL neuronale medium in neuron schotel om het gebied rond de insert te vullen en te voorkomen dat de coating drogen. Voeg ook 1 mL periventricular endotheliale celmedium toe in periventrtriculaire endotheelcelschotel.
    OPMERKING: Voeg medium langzaam langs de rand van de schotel, zodat de insert niet wordt verstoord.
  4. Controleer onder een microscoop om te controleren of cellen niet uit het wisselruimtecompartiment lekken.
  5. Incubeer cellen voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur incubatie onder de microscoop om te controleren of de cellen goed zijn bevestigd en er is geen nachtelijk lek.
  6. Na 48 uur zaaien, verwijder de insert voorzichtig met behulp van een steriele pincet. Controleer onder de microscoop om te controleren of de cellaag ongestoord blijft (dag 0).
  7. Verwijder medium uit het neuron schotel en voeg 1 mL van verse neuronale medium. Verwijder ook medium uit de periventricular endotheel celschotel en voeg 1 mL verse periventricular endotheliale celmedium toe.
    LET OP: Zet een verplicht aantal gerechten opzij en bevestig met 4% PFA voor dag 0-afbeeldingen.
  8. Incubeer cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Na 5 dagen, verwijder medium, bevestig cellen met 4% PFA gedurende 10 min en was 3x met 1x PBS.
  9. Vlekneuronen met anti-menselijke β-tubulin of anti-menselijk MAP2-antilichaam, en endotheliale cellen met anti-menselijk CD31-antilichaam. Voeg aan het einde van immunovlekken 1 mL antifade montagemedium toe aan elk gerecht.

7. Co-cultuur Migratie Assay

  1. Co-suspend 3 x 104 GABAergic interneuronen en 3 x 104 menselijke periventrtriculaire endotheelcellen in 70 μL co-kweekmedium (50% periventricular onderhoudsmedium zonder GABA en 50% neuronal medium). Zaai deze celoplossing in het eenputwisselvak. Bereid een passend aantal van dergelijke voorbeeldgerechten.
    OPMERKING: GABA is niet toegevoegd in het co-cultuurmedium om het effect van exogene GABA op migratie uit te sluiten.
  2. Controleer onder een microscoop om te controleren of cellen niet uit het wisselruimtecompartiment lekken.
  3. Voeg langzaam 1 mL co-kweekmedium aan de zijkant van de schotel toe om te voorkomen dat de coating droogt.
    OPMERKING: Voeg medium langzaam langs de rand van de schotel, zodat de insert niet wordt verstoord.
  4. Als eerste controle, zaad 3 x 104 menselijke GABAergic interneuronen alleen in 70 μL co-kweekmedium per eengoed wisselplaat. Bereid een passend aantal van dergelijke gerechten.
  5. Als tweede controle, co-seed 3 x 104 GABAergic menselijke interneuronen met 3 x 104 controle menselijke endotheliale cellen in 70 μL co-cultuur medium per een-goed insert. Bereid een passend aantal gerechten.
  6. Incubeer de gerechten voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur incubatie onder een microscoop of cellen goed zijn bevestigd en er is geen lek.
  7. Na 48 uur zaaien, verwijder de insert voorzichtig met behulp van een steriele pincet. Controleer onder de microscoop of de cellaag niet wordt verstoord (dag 0).
  8. Verwijder medium en voeg 1 mL verse co-cultuur medium.
    LET OP: Zet een passend aantal gerechten opzij voor het verkrijgen van dag 0 beelden.
  9. Incubeer cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
  10. Na 5 dagen, verwijder medium, bevestig cellen met 4% PFA gedurende 10 min en was 3x met 1x PBS.
  11. Vlek met anti-menselijke β-Tubulin of anti-menselijk MAP2 antilichaam om de neuronen te etiketteren. Voeg aan het einde van immunovlekken 1 mL antifade montagemedium toe aan elk gerecht.

8. Chemo-attractie Assay

  1. Plaats een drie-goed kweek insert in het midden van een poly-L-ornithine / laminin gecoate 35 mm schotel met behulp van steriele pincet.
  2. Draai de schotel ondersteboven. Markeer de grens rond het middelste compartiment van de wisselplaat met behulp van een permanente zwarte markering met ultrafijne punt.
  3. Zaad 3 x 104 menselijke GABAergic interneuronen in het middelste compartiment in 70 μL neuronalmedium (figuur 3A).
  4. Zaad 104 menselijke periventrtriculaire endotheelcellen in respectievelijk 70 μL periventricular endothelial cell medium en 104 controle-endotheliale cellen in 70 μL van controle-endotheelcelmedium in de twee buitenste compartimenten (figuur 3A).
  5. Voeg 1 mL co-kweekmedium (50% periventrtriculair onderhoudsmedium zonder GABA en 50% neuronal medium) toe aan de zijkant van de schotel om te voorkomen dat de coating op de schotel droogt.
  6. Controleer onder de microscoop om te controleren of cellen niet uit het wisselruimtecompartiment lekken.
  7. Incubeer cellen voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur incubatie onder een microscoop of cellen goed zijn bevestigd en er is geen lek.
  8. Na 48 uur zaaien, verwijder de insert voorzichtig met behulp van een steriele pincet. Controleer onder de microscoop of de cellaag niet wordt verstoord (dag 0).
  9. Verwijder medium en voeg 1 mL verse co-cultuur medium.
    LET OP: Zet het vereiste aantal gerechten opzij voor dag 0-afbeeldingen.
  10. Incubeer cellen voor 36 uur bij 37 °C en 5% CO2. Na 36 uur, aanzuigen medium, vast te stellen cellen met 4% PFA voor 10 min, en was 3x met 1x PBS.
  11. Vlek menselijke GABAergic interneuronen met anti-menselijke β-Tubulin of anti-menselijke MAP2 antilichaam. Aan het einde van de kleuringsprocedure, voeg 1 mL van antifade montage medium in elke schotel.

9. Beeldvorming en gegevensanalyse

  1. Plaats de met immuno bevlekte testschotel onder een microscoop bij 4X vergroting.
  2. Houd een lange rand van de rechthoekige grens (gemaakt in stap 5.10 hierboven) in het gezichtsveld. Maak foto's van cellen in de celvrije ruimte naast die grens. Afbeeldingen verkrijgen langs de rechter rand en de linker lange rand van de rechthoekige grens(figuur 2B).
    OPMERKING: Cellen die diagonaal zijn geplaatst ten opzichte van de rechthoek worden niet in aanmerking genomen vanwege onduidelijkheid bij het selecteren van de korte of lange rand als startmerk. Ook zijn aantallen cellen die over de korte rand migreren vaak aanzienlijk minder (mogelijk als gevolg van minder startcellen langs de korte rand) en worden ze niet overwogen.
  3. Open de afbeeldingen in ImageJ. Bereken de afstand tussen elke cel en het grensmarkeringsmerk (figuur 2D)met ImageJ.
  4. Als u migratie wilt beoordelen in termen van celnummers, stelt u een specifieke afstand in van de grens in het verkregen beeld in ImageJ. Tel het aantal cellen dat aanwezig is binnen deze afstand. Bereken het gemiddelde aantal, destandaarddeviatie en statistische significantie met behulp van geschikte software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De stappen voor het opzetten van een een-goed cultuur insert in een 35 mm schotel zijn weergegeven in figuur 1. Lange afstand migratie test en co-cultuur migratie test gebruikt een een-goed insert om het gewenste aantal cellen zaad in het midden van een poly-L-ornithine / laminin gecoate 35 mm schotel. Op dag 0 waren cellen aanwezig als rechthoekige patch(figuur 2A,C). In beelden van dag 0 kan de lijn van dag 0 gemakkelijk worden geïdentificeerd door de scherpe rand van de cellaag (witte stippellijn in figuur 2C). Rond 48 uur waren de cellen gemigreerd naar de celvrije ruimte(figuur 2B,D). In beelden na dag 0 kon de zwarte rand die rond de wisselplaat (aan de achterkant van de schotel) wordt getrokken, duidelijk worden waargenomen als een zwarte opening. De rand van de kloof werd toegewezen als de lijn dag 0 (witte stippellijn in figuur 2D). Zoals vermeld in stap 9.2, werden alleen de cellen die vielen in het gebied grenzend aan de rechter- en linkerranden van de cellaag (geel gebied in figuur 2B)in aanmerking genomen voor gegevensanalyse. De afstand die door een cel werd afgelegd, werd gemeten door de afstand tussen de cel (witte pijl in figuur 2D)en de lijn dag 0 te berekenen. Immunocytochemische kleuring met anti-actieve Caspase 3 antilichaam, een marker van apoptose, toonde geen apoptotisch signaal in de gezaaide cellen (Figuur 2E). In de co-cultuur migratie test, toen interneuronen werden mede-gezaaid met menselijke periventricular endotheliale cellen, neuronen afgelegd verder afstanden in vergelijking met toen interneuronen werden gezaaid alleen of wanneer co-gezaaid met controle endotheelcellen (Figuur 2F). Ook, voor dezelfde afstand bereik, een hoger aantal interneuronen gemigreerd wanneer co-gezaaid met periventrtriculaire endotheelcellen in vergelijking met interneuronen in de andere twee groepen. Dit toont aan dat, net als muis periventricular endotheliale cellen, menselijke periventricular endotheelcellen menselijke interneuron migratie bevorderen.

In de chemo-attractie test, met behulp van drie-goed cultuur inserts, menselijke interneuronen werden gezaaid als een kleine rechthoekige patch in een 35 mm poly-L-ornithine / laminin gecoate kweekschotel. Periventricular endotheelcellen en controle niet-periventrtriculaire endotheliale cellen werden gezaaid als pleisters aan weerszijden van de neuronale patch, met de kloof tussen elke pleister wordt 500 μm (Figuur 3A). Het aantal interneuronen dat naar periventricular endotheliale cellen versus controle endotheliale cellen migreerde werd gekwantificeerd na 36 uur. Een aanzienlijk hoger aantal interneuronen gemigreerd naar periventricular endotheliale cellen in vergelijking met controle endotheelcellen(Figuur 3B,C), bevestigend dat GABAergic interneuronen selectief reageren op chemo-aantrekkelijke signalen afgescheiden door menselijke periventrtriculaire endotheelcellen.

Figure 1
Figuur 1: Voorbereiding van de cultuurinsert. (A) Een twee-goed cultuur insert. (B) Een een-goed insert bevestigd in het midden van een 35 mm schotel. (C) De omtrek van de rechthoekige patch zoals waargenomen na het verwijderen van de insert. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schema en representatief resultaat van migratietest. (A) Schema van de cellaag (rode rechthoek) op dag 0. (B) Schema van cellen die migreren naar de celvrije ruimte. Rode stippen geven migrerende cellen aan. Het gele gebied markeert het gebied dat is weergegeven voor gegevensverwerving. De stippeldoos in A en B komt overeen met het gebied in de panelen C en D. c,d) Representatieve fluorescerende beelden van anti-β-Tubulin antilichaam gelabeld interneuronen op dag 0 (C) en dag 2 (D) van de migratie test. De witte stippellijn markeert dag 0. De gele lijn in D geeft de afstand aan die door een cel (gekenmerkt door witte pijl) in 48 h. (E) Neuronen (op dag 0) worden mede-gelabeld met anti-β-Tubulin antilichamen (rood) en anti-actieve Caspase 3 antilichamen (groen), die apoptotische cellen markeren. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Apoptotische cellen werden niet gedetecteerd in gezaaide cellen. (F) Grafiek vanaf dag 5 van de co-cultuur test, waar het aantal interneuronen die zijn gemigreerd is uitgezet tegen afgelegde afstand. In vergelijking met interneuronen die alleen werden gezaaid of mede-gezaaid met controle endotheliale cellen, interneuronen co-gezaaid met periventricular endotheliale cellen gemigreerd in hogere aantallen, en ook reisde verder afstand. Gegevens staan voor gemiddelde ± S.D (n = 5; **p<0,01, ***p< 0,001, Student's t-toets). Schaalstaven = 100 μm. IN = interneuronen; PV EC = periventricular endotheliale cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Chemo-attractie test. (A) Schema van de chemo-attractie test. Met behulp van een drie-goed cultuur insert, interneuronen (IN) werden gezaaid in het midden (groene gestippelde rechthoek), terwijl periventricular endotheliale cellen (PV ECs; oranje gestippelde rechthoek) en controle endotheelcellen (ECs; gele gestippelde rechthoek) werden gezaaid aan weerszijden. (B) Afbeeldingen van β-Tubulin gelabeldinterneuronen met een robuuste migratie naar periventricular endotheelcellen, maar niet naar controle endotheelcellen. (C) Kwantificering van de chemo-aantrekkelijke respons van interneuronen. Een aanzienlijk hoger aantal neuronen gemigreerd naar periventricular endotheliale cellen dan naar controle endotheelcellen. Gegevens staan voor gemiddelde ± S.D (n = 5; *p < 0,05, Student's t-toets). Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

A Voordelen Beperkingen
Boyden kamer test16,17 · Technisch niet-veeleisend
· Geschikt voor aanhangende en niet-aanhangende cellen
· Kan worden gewijzigd om het effect van paracrine signalering of chemo-attractants op celmigratie te bestuderen
· Endpoint test. Niet geschikt voor real-time beeldvorming.
· Niet geschikt voor studie van het effect van directe celcelinteractie op migratie
Krastest18 · Eindpunt of kinetisch
· Technisch niet-veeleisend
· Assays migratielengte van een paar honderd micrometer. Niet geschikt voor studie van lange-afstandsmigratie in het bereik van 1-2 cm.
· Niet geschikt voor ophangcellen
· Variaties in krasgebied
Lange afstand migratietest · Eindpunt of kinetisch
· Maakt studie van migratie over lange afstand tussen 1,5 tot 2 cm mogelijk
· Technisch niet-veeleisend
· Niet geschikt voor ophangcellen
Co-cultuur migratie test · Eindpunt of kinetisch
· Maakt studie van het effect van direct celcelcontact op migratie mogelijk
· Hiermee u een migratielengte van maximaal 1,5 tot 2 cm
· Technisch niet-veeleisend
· Niet geschikt voor ophangcellen
B Voordelen Beperkingen
Boyden kamer test · Technisch niet-veeleisend
· Geschikt voor aanhangende en niet-aanhangende cellen
· Endpoint test. Niet geschikt voor live beeldvorming.
· Steile concentratiegradiënt
Under-agarose test19 · Technisch niet-veeleisend
· Twee of meer chemo-aantrekkelijke signalen kunnen worden geassaid in een set-up
· Niet geschikt voor aanhangende cellen. Meestal beperkt tot bloedcellen.
· Moeilijke visualisatie van cellen in agarose
Capillaire kamermigratie test20,21 · Eindpunt of kinetisch
· Geschikt voor aanhangende of ophangcellen
· Heeft speciale kamers nodig
Microfluïdisch apparaat22 · Genereert controleerbare en stabiele concentratiegradiënt
· Hiermee u eenresolutie op één celniveau
· Heeft geavanceerde apparaten en tools nodig
· Technisch veeleisende en steile leercurve
· Complexe beeldvorming en data-analyse
Chemo-attractie test · Eindpunt of kinetisch
· Geleidelijke concentratiegradiënt
· Geschikt voor real-time of fluorescerende beeldvorming
· Technisch niet-veeleisend
· Niet geschikt voor ophangcellen

Tabel 1: Vergelijking van testmethoden. (A) Vergelijking van gangbare in vitro migratietests met de lange afstand migratietest en co-cultuurtest. (B) Vergelijking van gemeenschappelijke chemotaxis tests met de chemo-attractie test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier beschreven we drie in vitro tests die samen kwantitatieve beoordeling van menselijke periventricular endotheliale cel-specifieke eigenschappen bieden. Deze tests zullen waardevol zijn bij het verkrijgen van mechanistische inzichten in de interactie van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen met menselijke interneuronen. Experimenten met liganden, remmers of cellen met genspecifieke knockdown of overexpressie zullen moleculaire spelers identificeren of valideren die endotheliale celgestuurde interneuronmigratie of migratie-eigenschappen over lange afstand van periventrtriculaire endotheelcellen bemiddelen of valideren. Deze tests kunnen ook worden gewijzigd om live-cell time-lapse migratiestudies uit te voeren. Bovendien is er bewijs voor interactie van endotheelcellen met andere cellen dan interneuronen. Studies van onze groep en anderen hebben gezinspeeld op de invloed van periventricular endotheliale cellen op het patroon van projectieneuronen en proliferatie van neurale voorlopercellen5,14,15. Het zou van belang zijn om deze mogelijke interacties te testen met behulp van onze testinstellingen. Ten slotte zullen deze tests dienen als een platform voor de beoordeling van zieke periventrtriculaire endotheelcellen. Ons werk heeft nieuwe autonome banden gelegd tussen het periventricular vasculaire netwerk en de oorsprong van neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie, epilepsie, autisme en ernstige depressie3,5. Deze tests zullen van onschatbare waarde zijn bij het identificeren van potentiële defecten in lange afstand migratie, chemo-aantrekkingskracht, of juxtracrine signalering van zieke-perivetriculaire endotheliale cellen in deze neuropsychiatrische aandoeningen.

Deze tests zijn eenvoudig, reproduceerbaar en lage kosten, en ze kunnen worden aangepast om celmigratie en effecten van co-cultuur of chemo-aantrekkelijke signalen op migratie in verschillende celtypen te meten, behalve voor niet-aanhangende cellen. Er zijn een aantal kritische stappen die moeten worden gevolgd om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Ten eerste is het van cruciaal belang om het zaaien van celnummer voor elke test te optimaliseren. Het aantal cellen dat in één compartiment moet worden ingezaaid, moet afhangen van het celtype, het gewenste niveau van samenvloeiing en testspecifieke factoren zoals co-cultuurverhouding. Ten tweede is het noodzakelijk om het celkweekmedium voor elke test te optimaliseren. In de co-cultuur migratie test en de chemo-attractie test, waar meer dan een cel type is gezaaid in een enkele schotel, de test medium moet bevorderlijk zijn voor alle celtypes. In proefexperimenten onderzochten we het effect van co-cultuurmedium op levensvatbaarheid (met behulp van trypan blauwe uitsluitingsmethode) en morfologie (met behulp van immunocytochemie) van elk celtype. We kweekten menselijke GABAergic neuronen met co-cultuur medium voor een week en waargenomen geen significant verschil in levensvatbaarheid en morfologie van neuronen in co-cultuur medium in vergelijking met neuronen gekweekt in neuronalmedium. Op dezelfde manier toonden periventricular endotheelcellen en controle-endotheelcellen, gekweekt in co-cultuurmedium voor twee passages, geen significante variatie in celoverleving en morfologie. Ten derde, aangezien het migratiepercentage varieert tussen de verschillende celtypen, is het belangrijk om het tijdsbestek voor elke test voor het celtype(en) te bepalen dat wordt bestudeerd. Ten vierde is het van cruciaal belang om zorgvuldig om te gaan met de cultuurinserts. Wisselplaten moeten stevig op de schotel worden bevestigd door voorzichtig met een vingertop te drukken. De schotel moet ondersteboven worden gedraaid om te controleren of de insert niet beweegt. Zorg moet ook worden genomen tijdens het verwijderen van de insert om de cellaag niet te verstoren. Ten slotte wordt aanbevolen om de steekproefgrootte te vergroten om de experimentele variabiliteit te verminderen.

Tot slot, deze tests zal aanzienlijk uitbreiden ons begrip van de menselijke periventricular endotheliale celbiologie en de rol ervan op de ontwikkeling van de hersenen in normale en zieke aandoeningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door prijzen van het National Institute of Mental Health (R01MH110438) en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) aan AV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase dissociation solution Millipore Sigma SCR005 Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody Biolegend 802001
Anti-human CD31 antibody Millipore Sigma CBL468
Anti- MAP2 antibody Neuromics CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody Millipore Sigma AB3623
Control human endothelial cells Cellular Dynamics R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement Cellular Dynamics M1019
Cryogenic vials Fisher Scientific 03-337-7Y
DMEMF/12 medium Thermofisher Scientific 11320033
DMSO Sigma-Aldrich D2650
E6 medium Thermofisher Scientific A1516401
FGF2 Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectin Thermofisher Scientific 33016-015
Freezing Container Thermofisher Scientific 5100
GABA Sigma-Aldrich A2129
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Human GABAergic neurons Cellular Dynamics R1013
Human GABAergic neurons base medium Cellular Dynamics M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement Cellular Dynamics M1032
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
Mounting Medium Vector laboratories H-1200
poly-L-ornithin Sigma p4957
PBS Thermofisher Scientific 14190
Trypan blue Thermofisher Scientific 15250061
TrypLE Thermofisher Scientific 12563011 Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A Peprotech 100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit Lifeline Cell Technologies LL-0003 Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert ibidi 80209
3-well silicone culture-Insert ibidi 80369
35 mm dish Corning 430165
15-ml conical tube Fisher Scientific 07-200-886
4% PFA solution Fisher Scientific AAJ19943K2
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 14-832-11
Inverted phase contrast microscope Zeiss Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope Olympus FSX-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11, (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33, (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28, (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6, (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13, (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27, (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13, (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19, (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75, (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40, (6), 1316-1327 (2012).
Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).More

Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter