Vi presenterer tre enkle in vitro analyser-langdistanse migrasjon analyse, co-kultur migrasjon analyse, og kjemo-attraksjon analyse-som kollektivt vurdere funksjonene til menneskelige stamcelle avledet periventtrikulær endotelceller og deres interaksjon med GABAerge interneuroner.
Rollen til hjernens vaskulatur i nervesystemet utvikling og etiologi av hjernesykdommer blir stadig mer oppmerksomhet. Våre nyere studier har identifisert en spesiell populasjon av vaskulære celler, periventtrikulære endotelceller, som spiller en kritisk rolle i migrering og distribusjon av forebrain GABAergic interneurons under embryonisk utvikling. Dette, kombinert med deres celle-autonome funksjoner, hentydder til nye roller av periventtrikulære endotelceller i patologien til nevropsykiatriske lidelser som schizofreni, epilepsi og autisme. Her har vi beskrevet tre forskjellige in vitro analyser som kollektivt evaluerefunksjonene til periventtrikulære endotelceller og deres interaksjon med GABAergic interneurons. Bruk av disse analysene, spesielt i menneskelig sammenheng, vil tillate oss å identifisere sammenhengen mellom periventtrikulære endotelceller og hjernesykdommer. Disse analysene er enkle, lave kostnader og reproduserbare, og kan enkelt tilpasses enhver tilhengercelletype.
Endotelceller danner foring av blodkar og megle viktige funksjoner som inkluderer vedlikehold av fartøyets veggpermeabilitet, regulering av blodstrøm, blodplateaggregasjon og dannelse av nye blodkar. I hjernen er endotelceller en del av en kritisk blod-hjernebarriere som kontrollerer utveksling av materialer mellom hjernen og blodet1. Våre studier i det siste tiåret har identifisert nye nevrogene roller i hjernen endotelceller som har betydelige implikasjoner for hjernens utvikling og atferd2,3,4,5. Vi har vist at musen embryonale forebrain er vaskalisert av to forskjellige undertyper av fartøy, pial fartøy og periventrikulære fartøy, som varierer i anatomi, opprinnelse, og utviklingsprofil2. Endotelceller som fôrer disse to fartøyundertypene viser tydelige forskjeller i genuttrykksprofilene sine. Mens pial endotelceller for det meste uttrykker gener relatert til betennelse og immunrespons, er periventrikulære endotelceller unikt beriket i uttrykk for gener som vanligvis er forbundet med nevrogenese, nevronal migrasjon, chemotaxis og axon veiledning3. Periventtrikulære endotelceller huser også en ny GABA-signalvei som er forskjellig fra den tradisjonelle nevronale GABA-signalveien5. Samtidig med genuttrykket ble periventrikulære endotelceller funnet å regulere migrasjon og distribusjon av GABAerge interneuroner i den utviklende neocortex. Under embryonisk utvikling gjennomgår periventrikulære endotelceller langdistansemigrasjon langs en ventral-dorsal gradient for å etablere det periventrikulære vaskulære nettverket2,3. Denne trekkruten speiles en dag senere av interneuroner. Migrerende interneuroner samhandler fysisk med det forhåndsdannede periventrikulære vaskulære nettverket og bruker det som et styreskinne for å nå sitt endelige mål i neocortex. I tillegg til å fungere som et fysisk substrat, tjener periventulære endotelceller som kilden til navigasjonssignaler for migrerende nevroner. Periventtrikulær endotelcelleutskilles GABA guider interneuron migrasjon og regulerer deres endelige distribusjonsmønstre4. Defekter i interneuron migrasjon og distribusjon er forbundet med nevropsykiatriske lidelser som autisme, epilepsi, schizofreni og depresjon6,7,8,9,10. Derfor blir studie av periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon i menneskelig sammenheng avgjørende for å håndtere patogenesen av disse lidelsene.
Vi har generert humane periventrikulære-lignende endotelceller fra humane embryonale stamceller i vårt laboratorium11, ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi12,13. For å validere om menneskelige periventrikulære endotelceller trofast etterligner mus periventtrikulær endotelceller, og for å kvantitativt vurdere deres innflytelse på interneuron migrasjon, utviklet vi tre in vitro analyser: en langdistanse migrasjon analyse, en co-kultur migrasjon analyse, og en kjemo-attraksjon analyse. Her beskriver vi protokoller for disse analysene i detalj. Alle tre analysene er basert på bruk av silikonkulturinnsatser for å skape en liten rektangulær cellelapp (av faste dimensjoner) omgitt av cellefri plass. Overføringsavstanden evalueres ved å måle avstanden mellom de endelige plasseringene til cellene fra kanten av det rektangulære plasteret som er skissert på dag 0. I langdistanse migrasjonsanalysen seedes humane periventrikulære endotelceller som en i midten av en 35 mm tallerken, og avstandene som kjøres av cellene over lang tid beregnes. I co-kultur migrasjon analysen, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seeded med menneskelige interneurons som en i en 35 mm tallerken. Dette oppsettet tillater undersøkelse av effekten av direkte fysiske interaksjoner av disse to celletypene på frekvensen av migrering av interneuroner. Den kjemo-attraksjon analysen måler migrasjon av interneurons som svar på kjemo-attraktive signaler utskilt av menneskelige periventtrikulære endotelceller. Interneurons er seeded som en rektangulær patch, med menneskelige periventtrikulære endotelceller og kontroll ikke-periventtrikulær endotelceller sådd som lignende størrelse flekker på hver side. Hver av cellepatchene er adskilt av et cellefritt gap på 500 μm. Respons av interneuroner vurderes ved å kvantifisere antall celler som har migrert mot periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontroll av ikke-periventtrikulære endotelceller.
Disse analyser gir robust vurdering av menneskelige periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon. Det nye oppsettet av langdistanseanalyse og co-kultur migrasjon analyse gir cellefri plass i området centimeter (~ 1-1,5 cm) for å tillate påvisning av langdistanse migrasjon. Et sammendrag av funksjonene i våre analyser sammenlignet med andre populære analyser presenteres i tabell 1. Samlet vil analysene som er beskrevet her tjene som en plattform for å vurdere “syke” periventrikulære endotelceller og interneuroner generert fra iPSCer av hjernesykdommer som schizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analysene kan også brukes til å avgjøre hvordan ulike forhold (f.eks. hemmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrasjon. Til slutt kan disse analysene optimaliseres for andre celletyper for å måle langdistanseoverføring, kjemo-tiltrekning eller cellecellemediert migrering.
Her beskrev vi tre in vitro-analyser som sammen gir kvantitativ vurdering av humane periventtrikulære endotelcellespesifikke egenskaper. Disse analyser vil være verdifulle i å få mekanistisk innsikt i samspillet mellom menneskelige periventtrikulære endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter ved hjelp av ligander, inhibitorer eller celler med genspesifikk knockdown eller overexpression vil identifisere eller validere molekylære spillere som megler endothelial cellestyrt interneuron migrasjon eller …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av priser fra National Institute of Mental Health (R01MH110438) og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) til AV.
Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
35 mm dish | Corning | 430165 | |
15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |