Vi presenterar tre enkla in vitro analyser-långväga migration analys, co-kultur migration analys, och chemo-attraktion analys-som kollektivt utvärdera funktionerna i mänskliga stamceller härrör periventricular endotel celler och deras interaktion med GABAergic interneurons.
Roll hjärnan vaskulatur i nervsystemet utveckling och etiologi av hjärnsjukdomar blir alltmer få uppmärksamhet. Våra nyligen genomförda studier har identifierat en speciell population av vaskulära celler, periventricular endotel celler, som spelar en avgörande roll i migration och distribution av forebrain GABAergic interneurons under embryonal utveckling. Detta, tillsammans med deras cell-autonoma funktioner, anspelar på nya roller periventricular endotel celler i patologi neuropsykiatriska störningar som schizofreni, epilepsi och autism. Här har vi beskrivit tre olika in vitro-analyser som tillsammans utvärderar funktionerna i periventricular endotelceller och deras interaktion med GABAergic interneurons. Användning av dessa analyser, särskilt i ett mänskligt sammanhang, kommer att tillåta oss att identifiera sambandet mellan periventricular endotel celler och hjärnsjukdomar. Dessa analyser är enkla, billiga och reproducerbara, och kan enkelt anpassas till någon vidhäftande celltyp.
Endotelceller bildar slemhinnan i blodkärlen och förmedlar viktiga funktioner som inkluderar underhåll av kärlväggpermeabilitet, reglering av blodflödet, trombocytaggregation en och bildandet av nya blodkärl. I hjärnan, endotelceller utgör en del av en kritisk blod -hjärnbarriär som tätt kontrollerar utbyte av material mellan hjärnan och blodomloppet1. Våra studier under det senaste decenniet har identifierat nya neurogena roller hjärnan endotelceller som har betydande konsekvenser för hjärnans utveckling och beteende2,3,4,5. Vi har visat att musenembryonala framhjärnan är vascularized av två olika subtyper av fartyg, pial fartyg och periventricular fartyg, som skiljer sig åt i anatomi, ursprung och utvecklingsmässiga profil2. Endotelceller som kantar dessa två undertyper av kärl visar tydliga skillnader i deras genuttrycksprofiler. Medan pial endotelceller uttrycker mestadels gener relaterade till inflammation och immunsvar, periventricular endotel celler är unikt berikade i uttryck för gener som vanligen förknippas med neurogenes, neuronal migration, chemotaxis och axon vägledning3. Periventricular endotel celler också hus en ny GABA signalering väg som skiljer sig från den traditionella neuronala GABA signalering väg5. Samtidig t.ex. med dess genuttryck, periventricular endotel celler konstaterades reglera migration och distribution av GABAergic interneurons i utvecklings-neocortex. Under embryonal utveckling genomgår periventricular endotelceller långväga migration längs en ventral-rygglutning för att fastställa det periventricular vaskulära nätverket2,3. Denna migrationsväg speglas en dag senare av interneurons. Migrera interneurons interagerar fysiskt med det förbildade periventricular vaskulära nätverket och använda det som en guiderail för att nå sin slutdestination i neocortex. Förutom att fungera som ett fysiskt substrat, periventricular endotel celler fungera som källan till navigationssignaler för migrerande nervceller. Periventricular endotel cell-utsöndras GABA guider interneuron migration och reglerar deras slutliga distributionsmönster4. Defekter i interneuron migration och distribution är förknippade med neuropsykiatriska störningar såsom autism, epilepsi, schizofreni och depression6,7,8,9,10. Därför blir studier av periventricular endotel cell funktioner och deras inverkan på interneuron migration i mänskligt sammanhang kritisk för att ta itu med patogenesen vid dessa sjukdomar.
Vi har genererat mänskliga periventricular-liknande endotelceller från mänskliga embryonala stamceller i vårt laboratorium11,med inducerad pluripotent stamceller (iPSC) teknik12,13. För att validera om mänskliga periventricular endotel celler troget efterlikna mus periventricular endotel celler, och att kvantitativt bedöma deras inflytande på interneuron migration, utvecklade vi tre in vitro analyser: en långväga migration analys, en co-kultur migration analys, och en chemo-attraktion analys. Här beskriver vi protokoll för dessa analyser i detalj. Alla tre analyser är baserade på användningen av silikon kultur skär för att skapa en liten rektangulär fläck av celler (av fasta dimensioner) omgiven av cellfritt utrymme. Migreringsavstånd utvärderas genom att mäta avståndet mellan cellernas slutliga positioner från gränsen till den rektangulära patchsom har beskrivits dag 0. I långväga migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är sådd som en patch i mitten av en 35 mm skålen, och de avstånd som färdas av cellerna över en lång tid beräknas. I co-kultur migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är samseedade med mänskliga interneurons som en lapp i en 35 mm skålen. Denna inställning möjliggör undersökning av effekten av direkta fysiska interaktioner av dessa två celltyper på graden av migration av interneurons. Chemo-attraktion analysen mäter migration av interneurons som svar på kemo-attraktiva signaler utsöndras av mänskliga periventricular endotel celler. Interneurons är sådd som en rektangulär patch, med mänskliga periventricular endotel celler och kontroll icke-periventricular endotel celler sådd som liknande storlek fläckar på vardera sidan. Var och en av cellplåstren separeras av en cellfri lucka på 500 μm. Svar av interneurons bedöms genom att kvantifiera antalet celler som har migrerat till periventricular endotelceller jämfört med kontroll icke-periventricular endotelceller.
Dessa analyser ger robust bedömning av mänskliga periventricular endotel cell funktioner och deras inflytande på interneuron migration. Den nya installationen av långväga analys och co-kultur migration analys ger cellfritt utrymme i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) för att möjliggöra upptäckt av långväga migration. En sammanfattning av funktionerna i våra analyser jämfört med andra populära analyser presenteras i tabell 1. Kollektivt, de analyser som beskrivs här kommer att fungera som en plattform för att bedöma “sjuka” periventricular endotel celler och interneurons genereras från iPSCs av hjärnsjukdomar som schizofreni, autism eller epilepsi. Dessa analyser kan också användas för att avgöra hur olika tillstånd (t.ex. hämmare, ligander, RNAi) påverkar cellmigrationen. Slutligen kan dessa analyser optimeras för andra celltyper för att mäta långväga migration, kemo-attraktion eller cell-cell medierad migration.
Här beskrev vi tre in vitro-analyser som tillsammans ger kvantitativ bedömning av mänskliga periventricular endotel cell-specifika egenskaper. Dessa analyser kommer att vara värdefulla för att få mekanistiska insikter i samspelet mellan mänskliga periventricular endotel celler med mänskliga interneurons. Experiment med ligand, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller överuttryck kommer att identifiera eller validera molekylära aktörer som medla endotel cell-guidad interneuron migration eller l?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av utmärkelser från National Institute of Mental Health (R01MH110438) och National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) till AV.
Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
35 mm dish | Corning | 430165 | |
15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |