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Neuroscience

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

doi: 10.3791/60299 Published: November 6, 2019

Summary

本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。

Abstract

内科における聴覚処理は、メカノ感覚毛髪細胞の完全性に依存する。生涯にわたり、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化プロセスなどの多くの病因から難聴を獲得することができます。感覚性毛細胞の喪失は、後天性難聴の品種の一般的な病理学的特徴である。さらに、内側の毛髪細胞シナプスは軽度の侮辱によって損傷を受けることがある。したがって、人工内耳上皮の表面製剤は、免疫標識技術および共焦点画像と組み合わせて、リボンシナプスおよび感覚毛髪細胞の損失を含む人工内耳病理の調査に非常に有用なツールであり、毛髪細胞および支持細胞におけるタンパク質レベルの変化、毛髪細胞再生、および報告遺伝子発現の決定(すなわち、GFP)は、正常な形質導入および形質転換細胞型の同定を検証する。内耳の骨状螺旋状構造である人工内耳は、聴覚感覚末臓器、コルティ(OC)の器官を保持する。OCの感覚的な毛細胞および周囲の支持細胞は、人工内耳管に含まれ、バジラー膜上に休息し、頂点のベースおよび低周波で発生する高周波検出とトノトピック的な方法で組織化される。分子・遺伝情報の入手可能性とノックアウトやノックイン技術による遺伝子操作能力により、マウスは聴覚科学を含む生物学的研究に広く用いられている。しかし、成体マウスの人工内耳は小さな、人工内皮は骨の迷路に封入され、微小分節が困難になる。解剖技術は多くの実験室で開発され、使用されているが、この修飾されたマイクロ解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、より簡単かつ便利である。これは、脱石後のすべてのタイプの成虫マウスのコクレオに使用することができる。

Introduction

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コクレアは音の検出に専念し、聴覚を担当します。人工内耳管は骨部迷路の螺旋状に巻き取られ、聴器感覚末器官であるコルティ(OC)の器官を保持する。OCは、成虫CBA/CaJマウス1、2で巻き取られた場合、約5.7ミリメートルの長さで、人工内皮を構成する、バシラー膜上に置かれる。OCは、ベースで検出された高周波と頂点の低周波数で音位的に組織化されているため、人工内皮は、多くの場合、低に対応するアピカル、ミドル、ベースターンの3つの部分に分かれています。それぞれ、高周波検出。支持細胞の配列に加えて、OCは内側毛細胞(IHC)の1行の内側の毛細胞(IHC)が内側に位置し、人工内耳スパイラルに対して横に位置する3列の外側の毛髪細胞(OHC)で構成されています。

正しい聴覚処理は、内髪の感覚的な毛細胞の完全性に依存する。感覚性毛細胞の損傷または喪失は、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化などの多数の病因によって引き起こされる、後天性難聴の一般的な病理学的特徴であるプロセス3.さらに、内毛細胞/聴神経シナプスの完全性および機能は軽度の侮辱によって損なわれ得る4.分子・遺伝情報の入手とノックアウト技術やノックイン技術による遺伝子の操作により、マウスは聴覚科学に広く用いられている。成体マウス人工内耳はマイナスで、人工内皮は骨カプセルに囲まれており、技術的に困難な微小切片が生じるが、上皮の表面製剤は免疫標識または免疫ヒスト化学と組み合わさってまた、リボンシナプスや毛髪細胞の喪失、感覚性毛細胞や支持細胞のタンパク質レベルの変化、毛細胞の再生など、人工内耳病理の調査に共焦点画像が広く用いられている。人工内耳表面製剤は、レポーター遺伝子(すなわち、GFP)の発現パターンを決定し、正常な伝達を確認し、形質導入された細胞型を同定するためにも使用されている。これらの技術は、これまで成人CBA/Jマウス5、6、7、8、9を用いた騒音誘発難聴の基礎となる分子機構の研究に用いられてきた。

パラフィン切片または凍結切片を用いた免疫ヒストケミストリーとは異なり、各セクションに3つの外側毛細胞(OHC)と1つの内毛細胞(IHC)を含む人工内耳の小さな断面部分を得るために、人工内皮製剤を使用すると、感覚性毛髪細胞およびリボンシナプスをカウントするためのOCの全長の可視化と、特定の機能周波数に対応する感覚性毛髪細胞の免疫標識。表1は、ミュラー1及びヴィベルグ及びキャロン1、2からの研究による成人CBA/Jマウスにおける人工内耳スパイラルの長さに沿った距離の関数としての聴覚周波数のマッピングを示す。人工内耳面製剤は、人工内耳病理4、5、6、7、8、9、10の調査に広く用いられている ,11,12,13,14,15.全体のマウント人工内耳解剖法は、もともと1966年16月にハンス・エングストロームによって編集された本に記載されていました。この技術は、その後、聴覚科学10、11、12、13の多くの科学者によって文献に記載されているように様々な種に精製され、適応された。 15,17とマサチューセッツ目と耳18のイートンピーボディ研究所によって .最近、別の人工内耳解離方法がMontgomeryら19によって報告された。人工内耳の微小解剖は、人工内耳表面製剤にとって不可欠かつ重要なステップである。しかし、マウスのコクレオを解剖することは技術的な課題であり、かなりの練習が必要です。ここで、成体マウス人工内耳に用いるための修飾人工内耳表面調製方法が提示される。この方法は、免疫標識のために人工内皮の断片を10mmラウンドカバースリップに付着させるために、細胞および組織接着剤(すなわち、Cell-Tak)の脱皮および使用を必要とする。細胞および組織接着剤は、免疫組織化学20に広く使用されている。この修飾人工内耳マイクロ分除法は、以前に報告された18、19と比較して比較的簡単である。

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Protocol

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10~12週の男性成人CBA/Jマウスと6~8週のC57BL/6Jマウスに関するすべての研究プロトコルは、サウスカロライナ医科大学(MUSC)の制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認されました。動物のケアは、MUSCの実験動物資源部門の監督下にあった。

注:以下に示す手順については、マウスを腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)で麻酔されます。マウスは、動物がつま先のピンチなどの痛みを伴う刺激に反応しなくなった後に切断されます。

1. 側頭骨の抽出

  1. 直ちに外科的ハサミ(長さ17cm)でマウスを切断し、皮膚を前頭に引っ張って頭蓋骨を露出させた後、頭蓋骨の中心線に沿って前方の後方の側面からはさみで頭蓋骨の骨を切断する。
  2. 鉗子を使用して脳組織を取り出し、生後3ヶ月以上のマウスの親指と人差し指で側頭骨を手動で取り除きます。生後3カ月未満のマウスの側頭骨を切断するには、小さな外科的はさみ(長さ11cm)を使用する。
  3. 側頭骨を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した氷冷フレッシュ4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を含むペトリ皿(直径30mm)に入れ、pH7.4に溶解した。
    注:PFA溶液の不適切なpHバランスは免疫標識の品質を低下させるので、新鮮な4%PFA溶液を準備し、側頭骨を固定する直前にpHを7.4に調整します。

2. 固定と灌流

  1. 楕円形の窓からテープを取り出し、円形の窓の膜を鉗子#5大きさで穿刺します。ステレオ解剖顕微鏡の下で、1 mLの注射器に接続された27 G針を使用して、コクレアの頂点に小さな穴を開けます。
  2. 溶液が頂点の小さな穴から洗い流されるまで、円形と楕円形の窓を介して4%PFA溶液でゆっくりとコクレアを熟読します。4%PFA溶液の10 mLを含む20 mLボリュームシンチレーションバイアルにコクリア(バイアルあたり1つまたは2つのコクレオ)を転送します。
  3. 室温(RT)でシンチレーションバイアルを2時間静かに攪拌し、ローテーターの冷蔵庫(4°C)に一晩放置します。
    注:固定の時間は、使用する抗体に応じて調整することができる。例えば、固定を1.5時間に制限すると、GluA2抗体を使用する際にシナプス後末端の免疫標識が成功する可能性があります。

3. 側頭骨の脱石

  1. PFA溶液を取り出し、新鮮なPBS 3xでコクレアをそれぞれ5分間洗浄します。
  2. シンチレーションバイアルに4%エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩(edTA)溶液(pH 7.4)の20 mLを加え、穏やかな攪拌でローテーターに48〜72時間冷蔵庫に保管します。COCHLEがデカル化されるまで、EDTA溶液を毎日変更します。コクレアが弾性を評価するために鉗子で骨前庭部分に触れてデカル化されているか、または単に前庭部の端から小さな部分を切断してデカル化するかどうかを確認します。このような切断が破砕片をもたらす場合、コクレアはデカル化されない。
    注:EDTA溶液は、溶液濃度に応じて一次抗体の免疫反応を妨げる可能性がある。PBSで4%EDTAを準備し、pHを7.4に調整します。側頭骨の一貫したデカール化のために、新鮮なEDTA溶液が使用される。
  3. デカル化が完了したら、マイクロディケイドの溶液をPBSに変更します。
    注:コクレアが十分に脱分けされていない場合、コクレアの解剖は行うことができない。

4. 人工内耳上皮の微小分泌

注:脱石が完了したら、免疫標識のための人工内皮の微小解剖をできるだけ早く行う必要があります。PBSを含むきれいな30ミリメートルのペトリ皿では、内耳は次のように配向されます:ペトリ皿の上部(蓋)と底部を参照して、人工内耳の円形と楕円形の窓は上部に面しています。離分セクターを基準にして、人工内耳部は前方(離分離れから離れる)と前庭部分を背面(離方に近い)に向けている。次に、手順について詳しく説明します。

  1. 側頭骨の前庭部分を鉗子で保持し、赤線で示すように45°の角度でメスでアピカルターンを切断する(図1a)。
  2. 赤い線 (図 1b)で示されているように、丸いウィンドウと楕円形のウィンドウの間のかすかな線に沿って垂直に切り取り、前庭部分から内耳を分離します (図1c)。
    注:この人工内耳部は、上皮の中央、基底、およびフック部分を含む。
  3. 底面旋回で人工内耳部分を下に向け、中央のターンをペトリ皿の上に向けて置き、赤い線で示すように、真ん中の骨のカプセルと側面の壁を、アピカルセクションが取り除かれた端に向かってカットします(Figu)re 1d,e)
  4. 中央の部分を基底領域とフック領域から完全に分離するために切断を続けます (図 1f,g)。
    注:人工内耳のフック領域は、マウスで48kHz以上のトーンに対する感度に対応する人工内皮の末端である。
  5. 皿の底部に向かうバジロール膜部位を有する基底部とフック部を入れ、フック領域からモディオールを垂直に切り取り、縦の赤線で示すようにモディオールを除去する(図1g)。
    注:モディオールは、海綿状の骨と人工神経と螺旋状の神経節からなる円錐形の円錐形の中心軸である。このカットははさみで行うことが好ましい場合がある。
  6. 他の赤い線が図 1gに示すように基底領域とフック領域を切り取り、フック部分を分離します (図 1h)。
    注:コクレアは、アピカル、ミドル、ベースル、フック部分に分離されました。次のステップは、中間ターンを例にして、個々のターンの最終的な解剖になります。
  7. 赤線で示すように、真ん中のターンの骨カプセルと横壁組織の比較的大きな部分を切り取る(図1i)。
    注:人工内耳管の横壁は、螺旋靭帯とストリア血管によって形成される。
  8. 骨のカプセルと側面の壁をペトリ皿の底部に合わせ、これらの組織をバシャール膜側から切断するために鉗子で側面の壁を保持します。次に、試料を平らにして、感覚性毛細胞表面側を上に向けます。骨カプセルと側面壁の残りの部分を取り除きます(図1j)。
  9. 鉗子を使用してテクトリアル膜を取り除き、中央領域を完全に分離します(図1k)。
  10. 図 1lに示すように、残りのターンまたはリージョンの最終的な解剖について、手順 4.7~4.9 を繰り返します。
  11. 感覚上皮の接着のために10mmの丸いカバースリップを準備します。ピペットを使用して、ラウンドカバースリップの中央に0.5°Lのセルとティッシュ接着剤を手で広げます。乾燥後(RTで3〜5分)、ペトリ料理にPBSにカバーリップを入れます。
  12. ペトリ皿の10mmラウンドカバースリップに感覚上皮の4枚すべてを貼り付けます。次に、カバースリップの一方の端を保持して、免疫標識または免疫ヒストケミストリー用の4ウェル皿に転写します(図1m)。
    メモ:図2は、主要なカットの位置を示しています。

5. 人工内耳シナプスの免疫標識

注:この研究に続く人工内耳シナプスの免疫標識のためのプロトコルは、以前に13について説明されている。シナプス前リボンをCtBP2抗体で標識した(マウス抗カルボキシル末端結合タンパク質2IgG1、RIBEYE足場タンパク質のBドメインを標識)。シナプス末端後は、GluA2抗体(マウス抗グルタミン酸受容体2IgG2a、AMPA受容体の標識サブユニット)で標識した。

  1. 4ウェル皿で各洗浄でPBS 3xで感覚上皮を5分間洗浄し、2%の非イオン性界面活性剤(Triton-X 100)の2mLをローテーターでRTで30分間皿に加えます。
  2. ピペットを使用して皿から非イオン性界面活性剤溶液を取り除き、RTで穏やかな攪拌を伴うローテーター上の1時間、10%の通常ヤギ血清を含むブロッキング溶液をそれぞれ100°L添加します。
  3. 各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、PBS 3xで5分間、RTで穏やかな攪拌下で洗浄します。
  4. PBSで希釈した一次抗体をそれぞれに100μL添加する:マウス抗GluA2 IgG2a(1:2,000)、マウス抗CtBP2 IgG1(1:400)。蓋で各4ウェル皿を覆い、光から保護する大きな加湿容器に入れます。24時間37°Cでインキュベートする。
    注:オプションとして、ウサギ抗ミオシンVIIa(1:400)を免疫標識用の感覚毛細胞を添加することができる。
  5. RTで穏やかな攪拌で各洗浄を5分間PBSで3x洗浄します。
  6. 二次抗体Alexa 594ヤギ抗マウスIgG1a(1:1,000)、Alexa 488ヤギ抗マウスIgG2a(1:1,000)を各ウェルにPBSで希釈して100μLを加えます。蓋で各4ウェル皿を覆い、光から保護する大きな加湿容器に入れます。37°Cで2時間インキュベートする。
    注:ミオシンVIIaを使用する場合は、Alexa 350ヤギ抗ウサギ(1:200)を追加します。
  7. PBSで3xを5分間洗います。次に、10 mm の丸いカバースリップを上部にサンプルを置いたスライドに転送します。
  8. カバースリップの中央にトリスバッファー付きのフルオロゲルを8°L慎重に加えます。次に、別の10mmラウンドカバースリップの端を、鉗子で上に取り付け、2つのカバースリップを挟みます。
  9. マニキュアを使用してスライドを密封し、段ボールのスライドフォルダに入れ、冷蔵庫に保管します。
    注:取り付け中にカバーリップの間に一部のFluoo-Gelが漏れた場合は、スライドをマニキュアでシールする前にカバーリップの端を清掃してください。共焦点画像は7日以内に撮影する必要があります。

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Representative Results

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人工内皮の表面製剤は、免疫標識および共焦点イメージングと組み合わせて、リボンシナプス、感覚毛細胞の定量などの人工内病理の調査のために聴覚科学で広く使用されており、感覚性毛細胞におけるタンパク質発現5、6、7、8.表面製剤のための成虫マウスのコクレオの解剖は簡単ではありませんが、新卒生は10〜15耳で練習した後、この修正された方法を学ぶことができます(図1図2)。この技術では、CtBP2(シナプス前リボンのマーカー)およびGluA2(シナプス後末端のマーカー)の免疫標識と組み合わせて、Z突起下の共焦点画像を用いたIHC/聴覚神経シナプスを0.25μm間隔でカウントします。マウスリボンシナプスのサイズは、21が可能です。これは、公開された結果4613と一致しています。CtBP2(赤)とGluA2(緑色)で免疫標識された10~12週齢のCBA/Jマウスの表面製剤は、シナプス前リボンとシナプス末端の両方がIHC核の下に位置し、二重化されていることを示し、図示する機能シナプス (図 3)6,13.

異なる抗体を用いた表面製剤の免疫標識により、感覚性毛細胞における分子シグナル伝達と構造の評価が可能となる。例えば、図4は、ミオシンVIIaに対する免疫標識およびファロイジンおよび4'、6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)による対染色の結果を示す。同一の溶液を用いた細胞および組織接着剤の有無にかかわらず並列免疫標識実験が行われ、使用される接着剤が免疫反応を妨げるかどうかを評価した。人工内皮製剤をミオシンVIIaで免疫標識し、ファロイジンと対染色した。共焦点画像は、レーザーゲインと光電子増倍管(PMT)ゲインに対して、同一の条件と等しいパラメータ設定で63倍倍レンズで撮影しました。細胞および組織接着剤の有無に関わらず、免疫反応や均一性に違いはなかった(図5)。異なる固定剤を使用して、表面調製物は、人工内耳立体立体9の可視化のための走査型電子顕微鏡(SEM)画像の基礎を提供している。6~8週齢のC57BL/6Jマウス(治療なし)は、3列にオークのV字型ステレオシリアを整形して示す(図6)。さらに、人工内皮製剤は、報告遺伝子(すなわち、GFP)の発現パターンを決定し、正常な伝達を確認し、形質導入された細胞タイプを同定するために使用されている。

Figure 1
図1:大人のマウス表面調製のステップの描写(a) 側頭骨の人工骨カプセルが上を向く。赤い線は、アピカルターンを分離するための最初のカットを示します。RW = 丸いウィンドウ、OW = 楕円形のウィンドウ。(b)頂点は、矢印で示すようにコクレアから分離される。丸い窓と楕円形の窓の間の赤い線は、人工内で行われた2番目のカットを示します。(c)中央、基底、およびフック領域を含む人工内耳部は、前庭部から分離される。(d) 人工内耳部は上を向いている。赤い線は、アピカルセクションが除去された端に向かう3番目のカットを示します。(e) 矢印は、3 番目のカットの完了後に残されたギャップを示します。(f) この画像は中央の領域を示しています。(g) この画像は、基礎領域とフック領域の組み合わせを示しています。縦の赤い線は、変更とフック領域の間のカットを示します。基底領域とフック領域の間のカットは、もう一方の赤い線で示されます。(h)基底領域とフック領域は、矢印で示されているように分離される。(i)骨カプセルの中央領域は、赤線で示すように切断される。(j)画像は、骨カプセルの片側が除去された後の中央領域を示す。(k) この画像は解剖完了後の中央領域を示す。(l) 4つの領域はすべて完全に解剖される。(m) コクレアは、示されているように4つの地域を持つ4ウェルペトリ皿に移された10mmラウンドカバースリップに貼り付けられています。すべての画像は、1.2x、2.5x、および0.6倍の倍率でステレオ解剖顕微鏡で撮影されました。スケール バーは、各画像に表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:主要なカットの位置人工内耳骨カプセル全体を除去した。主要なカットの場所が示されます。1)アピカルターンが切断される場所。2)中間ターンが分離されているサイト。3)モディオラスを除去するためのクリティカルカット。4)基底領域とフック領域を分割するライン。スケール バー = 0.5 mm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

Figure 3
図3:共焦点画像は、成人マウス表面製剤におけるCtBP2およびGluA2の免疫標識を明らかにする。アピカル領域、中央領域、および基底領域にはラベルが付いています。より低い倍率の共焦点画像は10倍のレンズで撮影した。赤 = CtBP2、緑 = GluA2。スケールバー = 100 μm. 5、16、および 32 kHz 領域の共焦点画像を 63x レンズで撮影しました。頂点、中央、およびベース部分の白い長方形で示される領域の拡大ビュー。スケール バー = 10 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

Figure 4
図4:共焦点画像は、32kHz領域からの表面調製物の感覚性毛細胞の免疫標識を明らかにする。すべての画像は、Zスタック投影をマージしました。ファロイジン(緑色)は、AFCの3列とIHCの1行の構造を染色した。ミオシンVIIa(赤色)は、3列のOhCとIHCの1行を免疫標識した。DAPI染色毛細胞核。結合された共焦点画像は、感覚性毛細胞の側面図のために再構成された。スケール バー = 10 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

Figure 5
図5:細胞および組織接着剤の有無にかかわらず人工内皮製剤を並行して処理し、ミオシンVII(赤色)に対して免疫標識し、同一の溶液を用いてファロイジン(緑色)で反染色した。使用される細胞および組織接着剤は、免疫反応を妨げません。共焦点画像は、同一の条件と等しいパラメータ設定の下で63倍倍の倍率レンズで撮影した。画像は32kHzの領域から撮影した。OICにおけるミオシンVIIaの免疫標識およびファロイジンの染色は、細胞および組織接着剤の有無にかかわらず同様であった。スケール バー = 10 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

Figure 6
図6:走査型電子顕微鏡は、C57BL/6Jマウス由来のOHCステレオシミリアの3列を示す。画像は中央の領域から撮影されました。(a) AFCの3行の低倍率ビュー。(b) 拡大画像は、「V」形状で表示される整形OHCステレオシリアの3列を示しています。スケール バー = 10 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

名前
頂点からの距離 (mm) 0.4 1 2.4 3.3 3.9 4.7 5.7
頂点からの距離 (%) 7.7 18 43 54 68 82 100
周波数 (kHz) 6 8 16 22 32 48

表1:ミュラー1及びビベルグ及びキャロン2に係る頂点からの距離の関数としてのCBA/Jマウス人工内波周波数感度のマッピング

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Discussion

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免疫標識と組み合わせた全実装表面製剤の人工内耳分除は、内耳病理および分子機構の調査のための基本的なツールを提供する。この改変された大人のマウス人工内耳解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、この困難な手順を簡素化する。

この修飾人工内耳表面調製方法は比較的容易でアクセスしやすいが、それでも熟練度を達成するためには練習が必要である。正しいカットを行うには、セクター間のセクター間に注意深い集中が必要です。基底ターンの人工内感毛細胞は螺旋状の四肢に非常に近いため、表面の準備が完全に平らにできるように四肢組織を完全に除去することは困難ですが、共焦点Z突起はこの問題を補うことができます。さらに、内炎のフック領域は、解剖するのが最も困難な部分である。フック領域の OHC と IHC の分離が発生する可能性があります。フック領域は、ヒトにおける大きな解剖学的変動を示し、骨伝導聴覚22、23にとって重要である。ミュラー1とVibergとCanlon2によって報告された人工内耳周波数マッピングに基づいて、フック領域は、頂点から約4.7mmから始まり、48 kHzトーン以上(表1)に対する感度に対応します。騒音誘発性、アミノグリコシド誘発難聴、年齢関連難聴を含むマウスの後天性難聴の評価は、一般に聴覚脳幹応答(ABR)5、6で8、16、および32kHzで測定される、7、9、24および歪み生成オト音響放出(DPOAE)25と6〜45kHzから。モンゴメリーらとの合意では、螺旋が3〜4個19に分割されると上皮の歪みは一般的に見られない。

ここで提示される改変方法は、人工内耳スパイラルを4個(頂点、中間、基底旋回、およびフック領域)のみに解剖することを含むのに対し、Eaton-Peabody技術は6個の18個を生成する。イートンピーボディ技術は、この修正された技術で説明されているように、最初に螺旋の残りの部分からアピカルターンを分離するために上皮を通して接線カットを行うことを避ける人工内耳から始まります。より小さい部分を作り出すことによって、Eaton-Peabodyの技術は浸漬の目的と大きい部分を見るために必要な平坦化を最小にするように設計されている。実際には、組織のより大きな部分は、モンゴメリーら19に沿って、アピカルから基底旋回への周波数マッピングの測定を容易にする。さらに、この方法とMontgomery et al.19の違いは、ここで説明する修飾人工内耳解離法がほとんどのカットにメスを採用し、1つのステップのみがはさみで行われるということです(すなわち、基礎領域とフック領域の分離図2)の第3のカットに例示したのに対し、Montgomery et al.19は表面製剤用のシリコーンエラストマーコーティング解剖皿を用いた。組織の歪みを避けるために、生体を除去するバジラール膜の切断が重要である。

このプロトコルは、免疫標識または免疫組織化学のための10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を接着するために細胞および組織接着剤(材料の表)を使用し、プロセスをより便利にし、損失を回避します免疫標識手順の複数のワッシュ中の上皮組織。細胞および組織接着剤は、細胞および組織に付着するポリフェノールタンパク質の製剤であり、免疫組織化学、in-situハイブリダイゼーション、および免疫アッセイ20を含む多くの一般的なインビトロ技術で広く使用されている。細胞および組織接着剤が免疫反応を妨げないという概念と一致して、表面製剤とのミオシンVIIaの並行免疫標識は、細胞および組織の有無にかかわらず免疫反応または均一性の違いを示さない接着 剤。これら3つの解剖方法(Eaton-Peabody Labies、モンゴメリーら19、および記載された改変方法)を比較すると、研究室の大学院生は、細胞および組織接着剤を使用したこの改変方法が学習しやすく、およびマスター。

要約すると、全実装成人マウス表面製剤の製造は、人工内耳病理の評価のための基本的なスキルである。成体マウス表面製剤に関して記載された改変プロトコルは、この困難な手順を簡素化する。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

記載された研究プロジェクトは、国立衛生研究所の国立ろう者・その他のコミュニケーション障害研究所の助成金R01 DC009222によって支援されました。この作業は、MUSCのWRビルで、助成金C06 RR014516によってサポートされる改装された空間で行われました。動物は、国立研究資源センターの村外研究施設プログラムから助成金C06 RR015455によって支援されたMUSC CRI動物施設に収容されました。著者たちは、ヨッヘン・シャハト博士の貴重なコメントとアンドラ・タラカ博士の原稿の校正に感謝する。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm Rund Coverslips Microscopy products for science and industry 260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 Thermo Fisher Scientific A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 Thermo Fisher Scientific A-21125
Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A11012
Carboard Micro Slide Trays Fisher Scientific 12-587-10
Cell-Tak BD Biosciences 354240
Corning Petri Dishes Fisher Scientific 353004
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
Dumont #5 Forceps FST fine science tools 11251-20
EDTA Disodium Salt Sigma-Aldrich E5134
Fluoro-gel with Tris Buffer Electron Microscopy Sciences 17985-10
Four-well Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 627170
Goat Anti-myosin VIIa Antibody Proteus Biosciences 25-6790
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse Anti-CtBP2 Antibody BD Biosciences #612044
Mouse Anti-Glu2R Antibody Millipore MAB397
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 31872
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Scalpel VWR 100491-038
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15001-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202, (1-2), 63-73 (2005).
  2. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197, (1-10), (2004).
  3. Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26, (1), 85-96 (2017).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  5. Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32, (36), 12421-12430 (2012).
  6. Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36, (28), 7497-7510 (2016).
  7. Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20, (3), 217-232 (2019).
  8. Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22, (15), 1308-1324 (2015).
  9. Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
  10. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109, (1-2), 34-45 (1997).
  11. Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13, (1), 20-30 (2006).
  12. Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81, (2), 179-193 (1972).
  13. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  14. Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
  15. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (2), 781-785 (2008).
  16. Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
  17. Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
  18. MassEyeAndEar.org. https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
  19. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  20. Corning Cell Culture Surfaces. https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
  21. Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209, (2-3), 153-165 (2006).
  22. Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19, (6), 378-385 (2014).
  23. Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107, (1), 233-241 (2014).
  24. Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
  25. Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
大人のマウスにおける人工内耳表面製剤
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Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).More

Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).

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