Summary
В этой статье представлен модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности, который требует декальцинации и использования клея клетки и ткани, чтобы придерживаться кусочков кохлеарной эпителии к 10 мм круглым крышкам для иммуногистохимии у взрослых улиток мыши.
Abstract
Слуховая обработка в улине зависит от целостности механосенсорных волосковых клеток. В течение жизни, потеря слуха может быть приобретена из многочисленных этиологий, таких как воздействие чрезмерного шума, использование ототоксических препаратов, бактериальных или вирусных инфекций уха, травмы головы, и процесс старения. Потеря сенсорных волосковых клеток является общей патологической особенностью разновидностей приобретенной потери слуха. Кроме того, синапс внутренней клетки волос может быть поврежден мягкимоскорбления. Поэтому поверхностные препараты кохлеарных эпителий, в сочетании с иммуномаркировкой и конфокальными изображениями, являются очень полезным инструментом для исследования кохлеарных патологий, включая потери ленточных синапсов и сенсорных волосковых клеток, изменения в уровнях белка в волосковых клетках и поддерживающих клетках, регенерация волосяных клеток и определение экспрессии генов отчета (т.е. GFP) для проверки успешной трансдукции и идентификации трансиндуцированных типов клеток. Улита, костлявая спиральная структура во внутреннем ухе, содержит слуховой сенсорный конечный орган, орган Корти (OC). Сенсорные волосковые клетки и окружающие поддерживающие клетки в ОК содержатся в кохлеарном протоке и покоятся на базилярной мембране, организованном тонотопическим способом с высокочастотным обнаружением, происходящим в основании и низкочастотным на вершине. С наличием молекулярной и генетической информации и способностью манипулировать генами нокаутом и стучать в методы, мыши были широко использованы в биологических исследованиях, в том числе в науке о слухе. Тем не менее, взрослая улитка мыши является незначительным, и кохлеарный эпителий инкапсулируется в костлявом лабиринте, что затрудняет микрорассеилосцию. Хотя методы вскрытия были разработаны и использованы во многих лабораториях, этот модифицированный метод микродиссекции с использованием клея клеток и тканей проще и удобнее. Он может быть использован во всех типах взрослых улиток мыши после декальцинации.
Introduction
Улишайка посвящена обнаружению звука и отвечает за слух. Кохлеарный проток сжимается в спиральной форме в костлявом лабиринте и содержит слуховой сенсорный конечный орган, орган Корти (OC). OC опирается на базилярную мембрану, составляющую кохлеарный эпителий, с длиной около 5,7 мм, когда рассеялся у взрослых cbA/CaJ мышей1,2. Поскольку OC тонотопически организован с высокими частотами, обнаруженными в основании и низких частотах в вершине, кохлеарный эпителий часто делится на три части для аналитических сравнений: пикические, средние и базальные повороты, соответствующие низким, среднего и высокочастотного обнаружения, соответственно. В дополнение к массиву поддерживающих клеток, OC состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток (IHCs), расположенных медиально и трех рядов наружных волосковых клеток (OHCs), расположенных боково по отношению к кохлеарной спирали.
Правильная слуховая обработка зависит от целостности сенсорных волосковых клеток в улине. Повреждение или потеря сенсорных волосковых клеток является общей патологической особенностью приобретенной потери слуха, вызванной многочисленными этиологиями, такими как воздействие чрезмерного шума, использование ототоксических препаратов, бактериальных или вирусных инфекций уха, травмы головы и старение процесс3. Кроме того, целостность и функции внутренней клетки волос / слуховых нервных синапсов могут быть нарушены мягкими оскорблениями4. С наличием молекулярной и генетической информации и манипуляции генов нокаутом и стук в методы, мыши были широко использованы в науке о слухе. Хотя улитка для взрослых мышей мизерна, а кохлеарный эпителий окружен костлявой капсулой, что приводит к технически сложным микрорасделяциям, поверхностным препаратам эпителия в сочетании с иммуномаркировкой или иммуногистохимией и конфокальные изображения широко использовались для исследования кохлеарных патологий, включая потери ленточных синапсов и волосковых клеток, изменения в уровнях белков в сенсорных волосковых клетках и поддерживающих клетках, а также регенерацию волосяных клеток. Кохлеарные поверхностные препараты также использовались для определения модели экспрессии генов репортеров (т.е. GFP) и подтверждения успешной трансдукции и выявления трансиндуцированных типов клеток. Эти методы ранее были использованы для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе шума индуцированной потерей слуха с использованием взрослых CBA / J мышей5,6,7,8,9.
В отличие от иммуногистохимии с использованием парафиновых секций или криосекций для получения небольших поперечных частей улишки, которые содержат три внешние волосковые клетки (OHCs) и одну внутреннюю клетку волос (IHC) на каждом участке, кохлеарные препараты поверхности позволяют визуализация всей длины OC для подсчета сенсорных волосковых клеток и ленточных синапсов и иммуномаркировки сенсорных волосковых клеток, соответствующих специфическим функциональным частотам. В таблице 1 показано отображение частот слуха как функция расстояния по длине кохлеарной спирали у взрослых CBA/J mouse согласно исследованиям Мюллера1 и Viberg и Canlon1,2. Кохлеарные поверхностные препараты широко используются для исследования кохлеарных патологий4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Метод кохлеарной рассечения всего гора был первоначально описан в книге под редакцией Ганса Энгстрома в 1966году 16. Этот метод был впоследствии усовершенствован и адаптирован к различным видам, как описано в литературе рядом ученых в слух науки10,11,12,13, 15,17 и Eaton-Peabody лабораторий в Массачусетсглаз и ухо18. Недавно, другой метод кохлеарного вскрытия было сообщено Монтгомери и др.19. Микродиссекция улиски является важным и критическим шагом для кохлеарных препаратов поверхности. Тем не менее, вскрытие мыши улики является технической задачей и требует значительной практики. Здесь представлен модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности для использования во взрослых уличках мышей. Этот метод требует декальцинации и использования клея клеток и тканей (т.е. Cell-Tak) для присоединения кусочков кохлеарного эпителия к 10 мм круглым крышкам для иммуномаркировки. Клейк клеток и тканей широко используется для иммуногистохимии20. Этот модифицированный метод микродиссекции кохлеарных относительно прост по сравнению с теми, которые ранее сообщалось18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы исследований с участием взрослых мужчин CBA / J мышей в возрасте от 10 до 12 недель и C57BL/6J мышей в возрасте 6-8 недель были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) в Медицинском университете южной Каролины (MUSC). Уход за животными находился под наблюдением Отдела лабораторных ресурсов животных В MUSC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедур, представленных ниже, мышей обезболивают кетамин (100 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) с помощью интраперитонеальных инъекций. Мыши обезглавливаются после того, как животное больше не реагирует на болезненные раздражители, такие как щепотка.
1. Извлечение временных костей
- Обезглавить мышь сразу посмертно с хирургическими ножницами (17 см в длину) и вырезать череп кости ножницами от заднего аспекта вперед вдоль центральной линии черепа после разоблачения кости черепа, потянув кожу передняя.
- Удалить ткани мозга с помощью щипц и вручную удалить височные кости с большим и указательным пальцами для мышей трех месяцев или старше. Используйте небольшие хирургические ножницы (11 см в длину), чтобы сократить височной кости мышей моложе трех месяцев.
- Положите височную кость в чашку Петри (30 мм в диаметре), содержащую ледяной свежий 4% параформальдегида (PFA), растворенный в фосфатно-буферизированном сольнике (PBS), рН 7.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий 4% раствор PFA и отрегулируйте рН до 7,4 непосредственно перед фиксацией височных костей, потому что неправильное балансировка рН раствора PFA уменьшит качество иммуномаркировки.
2. Фиксация и перфузия
- Удалите стайпы из овального окна и проколить круглую оконную мембрану размером #5 щипцы. Под стерео рассечение микроскопсделать небольшое отверстие в вершину улички с помощью 27 G иглы, подключенной к 1 мл шприца.
- Аккуратно и медленно пронизываете улику с 4% РАСТВОРом PFA через круглые и овальные окна, пока раствор не вымывается из небольшого отверстия на вершине. Перенесите улиную (одну или две улички на флакон) на 20 мл сцинтилляционных флаконов, содержащих 10 мл 4% раствора PFA.
- Аккуратно агитировать сцинтилляционные флаконы при комнатной температуре (RT) в течение 2 ч и оставить на ночь в холодильнике (4 кС) на ротаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время фиксации может быть скорректировано в зависимости от используемого антитела. Например, ограничение фиксации до 1,5 ч позволит успешно иммуномаркировки постсинапических терминалов при использовании антитела GluA 2.
3. Декалькация временной кости
- Удалить раствор PFA и мыть улитки со свежими PBS 3x в течение 5 минут каждый.
- Добавьте 20 мл 4% этилендеаминетететраацетических кислоты на соль динатрия (EDTA) раствор (pH 7.4) в флаконы сцинтилляции и храните в холодильнике 48-72 ч на ротаторе с нежным возбуждением. Ежедневно изменяйте решение EDTA до тех пор, пока улички не будут декальцинированы. Проверьте, если улитки декальцилируются, касаясь костлявой вестибулярной части с щипками для оценки эластичности или просто вырезать небольшой кусочек от края вестибулярной части. Если такое сокращение приводит к дробленая часть, улиная не декальцифицирована.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ЭДТА может мешать иммунореакции первичных антител в зависимости от концентрации раствора. Подготовка 4% EDTA в PBS и настроить рН до 7,4. Для последовательной декальцинации височных костей используется свежий раствор EDTA. - Измените решение pbS для микрорассечения после декальцинации завершена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если улички недостаточно декальцинированы, вскрытие улик иней не может быть выполнено.
4. Микродисесекция кохлеарного эпителия
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только декальцификация завершена, микрорассечение кохлеарного эпителия для иммуномаркировки должно быть выполнено как можно скорее. В чистом 30 мм чашке Петри, содержащей PBS, внутреннее ухо ориентировано следующим образом: в связи с верхней (крышкой) и нижней крышкой блюда Петри, кохлеарные круглые и овальные окна выходят на верхнюю часть. Что касается диссектора, то кохлеарная часть ориентирована на фронт (вдали от диссектора) и вестибулярную часть в сторону спины (около диссектора). Ниже описаны шаги в деталях.
- Держите вестибулярную часть височной кости с щипками и вырезать атикальный поворот с скальпелем под углом 45 ", как указано на красной линии (Рисунок 1a).
- Вырезать вертикально вдоль слабой линии между круглым окном и овальным окном, как указано на красной линии(Рисунок 1b) отделить улитки от вестибулярной части(рисунок 1c).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта кохлеарная часть содержит средние, базальные и крючковые части эпителия. - Поместите кохлеарную часть с базальным поворотом к дну и средним поворотом к верхней части чашки Петри и вырежьте костлявую капсулу и боковую стену среднего поворота к концу, из которого была удалена апикальная секция, о чем свидетельствует красная линия (Фигу re 1d,e).
- Продолжить резки полностью отделить среднюю часть от базальных и крючков регионах(Рисунок 1f,g).
ПРИМЕЧАНИЕ: Область крючка улички является концом кохлеарного эпителия, соответствующего чувствительности к тонов 48 кГц и выше у мышей. - Положите базальный и крюк часть с базилярной мембраны сайт ориентирован на дно блюда и вертикально сократить modiolus от крючка области, чтобы удалить modiolus, как указано на вертикальной красной линии (Рисунок 1г).
ПРИМЕЧАНИЕ: Модиолус представляет собой коническую центральную ось улиной, которая состоит из губчатой кости и кохлеарного нерва, а также спирального ганглия. Это может быть предпочтительнее, чтобы выполнить этот разрез с ножницами. - Вырезать базальных и крючка регионов, как и другие красные линии указывает на рисунке 1г, чтобы отделить часть крючка(Рисунок 1ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Улиша теперь разделена на апикальные, средние, базальные и крючковые части. Следующими шагами будет окончательное вскрытие каждого из отдельных поворотов, используя средний поворот в качестве примера. - Отрежьте относительно большие порции костной капсулы и боковой ткани стенки среднего поворота, как указано на красной линии(рисунок 1i).
ПРИМЕЧАНИЕ: Боковая стенка кохлеарного протока образуется спиральной связки и стриа васкулярия. - Держите боковую стенку с щипками, чтобы выровнять костлявую капсулу и боковую стену с нижней частью чашки Петри и вырезать эти ткани из базилярной мембраны стороне. Затем сгладить образец, чтобы сориентировать сенсорную поверхность волосяных клеток вверх. Обрезать остальную часть костной капсулы и боковой стенки(рисунок 1j).
- Удалите текториальную мембрану с помощью щипц, чтобы полностью отделить среднюю область(рисунок 1к).
- Повторите шаги 4.7-4.9 для окончательных вскрытий оставшихся поворотов или областей, как показано на рисунке 1л.
- Подготовьте 10-мм круглый крышку для слипа сенсорного эпителия. Используйте пипетку для ручного распространения 0,5 л клеток и клей ткани по центру круглого покрытия. После сушки (3-5 мин на RT), положить крышки в PBS в чашках Петри.
- Stick все четыре части сенсорного эпителия на 10 мм круглый покрывало в чашке Петри. Затем держите один край крышки, чтобы перенести его в четыре колодца блюдо для иммуномаркировки или иммуногистохимии(рисунок 1м).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 2 иллюстрирует расположение основных сокращений.
5. Иммуномаркировка для кохлеарных синапсов
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол иммуномаркировки кохлеарных синапсов, последовавший в данном исследовании, ранее был описан13. Пресинаптические ленты были помечены антителами CtBP2 (мышь анти-карбоксил-терминал связывающий белок 2 IgG1, маркировка B домена леса белка RIBEYE). Почтовые синаптические терминалы были помечены антителами GluA2 (мышечный антиглютаматический рецептор 2 IgG2a, маркировка субъединиц рецептора АМРА).
- Вымойте сенсорный эпителий с PBS 3x на 5 минут каждый мыть в четыре колодца блюдо, а затем добавить 2 мл 2% неионического сурфактанта (т.е. Triton-X 100) в блюдо в течение 30 минут на RT на ротаторе.
- Удалите неионический сурфактантный раствор из тарелки с помощью пипетки и добавьте 100 злблокирующий раствор, содержащий 10% нормальной козьей сыворотки к каждой скважине в течение 1 ч на ротаторе с нежным возбуждением на RT.
- Удалите блокирующий раствор из каждого колодца, промойте PBS 3x в течение 5 минут каждый мыть под нежным возбуждением на RT.
- Добавьте 100 л первичных антител, разбавленных PBS, к каждому колодцу: мышь anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), мышь анти-CtBP2 IgG1 (1:400). Накройте каждое блюдо из четырех колодцев крышкой и поместите в большой увлажненный контейнер, который защищает от света. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве опции можно добавить кролика антимиозина VIIa (1:400) для иммуномаркировки сенсорных волосковых клеток. - Вымойте 3x с PBS в течение 5 минут каждый мыть с нежным возбуждением на RT.
- Добавьте 100 л вторичных антител Alexa 594 козла антимык IgG1a (1:1,000), Alexa 488 коза анти-мышь IgG2a (1:1,000) разбавленной PBS к каждой скважине. Накройте каждое блюдо из четырех колодцев крышкой и поместите в большой увлажненный контейнер, который защищает от света. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если миосин VIIa используется, добавить Alexa 350 коза анти-кролик (1:200). - Вымойте 3x с PBS в течение 5 мин. Затем перенесите 10-мм круглый покрывало на горку с образцами сверху.
- Аккуратно добавьте 8 зл флюоро-гель с буфером Tris в центр ею. Затем держите край еще 10 мм круглый покрывало с щиптом, чтобы смонтировать на вершине, сэндвич два coverslips вместе.
- Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать слайды, положить их в папку слайд картонной, и хранить в холодильнике.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если некоторые Fluoro-Gel протекает между крышками во время монтажа, очистите края крышки перед уплотнением слайда с лаком для ногтей. Конфокальные изображения должны быть приняты в течение 7 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поверхностные препараты кохлеарного эпителия, в сочетании с иммуномаркировкой и конфокальной визуализацией, широко использовались в науке о слухе для исследования кохлеарных патологий, таких как количественная оценка ленточных синапсов, сенсорных волосковых клеток, и выражение белка в сенсорных волосковых клетках5,6,7,8. Хотя вскрытие взрослых улажных мышей для подготовки поверхности не просто, новые аспиранты могут узнать этот модифицированный метод после практики с 10-15 ушами(Рисунок 1 и Рисунок 2). С помощью этого метода, в сочетании с иммуномаркировкой для CtBP2 (маркер для пресинаптических лент) и GluA2 (маркер для пост синаптических терминалов), считая IHC/auditory нервные синапсы с использованием конфокальных изображений под прогнозами с интервалами 0,25 мкм, основанных на размер синапсов мышиной ленты, возможно21. Это согласуется с опубликованными результатами4,6,13. Поверхностные препараты мышей CBA/J (без лечения) в возрасте 10-12 недель с иммуномаркировкой CtBP2 (красный) и GluA2 (зеленый) показали, что как пресинаптические ленты, так и постсинаптические терминалы расположены ниже ядер IHC и сопоставляются, что указывает на функциональные синапсы(рисунок 3)6,13.
При иммуномаркировке поверхностные препараты с различными антителами возможна оценка молекулярной сигнализации и структуры в сенсорных волосковых клетках. Например, на рисунке 4 показаны результаты иммуномаркировки миозина VIIa и противопоказаний фаллоидином и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Для оценки того, мешает ли используемый клей иммуномаркировке и без клея клеток и тканей с использованием идентичных растворов, были проведены эксперименты с использованием клея. Кохлеарные поверхностные препараты были иммуномаркированы миозином VIIa и противопоставить фаллоидина. Конфокальные изображения были сделаны с 63x увеличение объектива в одинаковых условиях и равные настройки параметров для лазерного выгоды и фотомультипликатор трубки (PMT) выгоды. Не было никакой разницы в иммунореакциях или единообразии с клеем и без нее(рисунок 5). Используя различные фиксаторы, поверхностные препараты послужили основой для сканирования изображений электронной микроскопии (SEM) для визуализации кохлеарной стереоцитии9. C57BL/6J мышей (без лечения) в возрасте 6-8 недель показывают хорошо организованные V-образные стереосции OHCs в трех рядах(рисунок 6). Кроме того, кохлеарные поверхностные препараты были использованы для определения модели экспрессии гена отчета (т.е. GFP) и подтверждения успешной трансдукции и выявления трансиндуцированных типов клеток.
Рисунок 1: Изображение ступеней для подготовки поверхности для взрослых мышей. ()Кохлеарная костлявая капсула височной кости сталкивается вверх. Красная линия указывает на первый разрез, чтобы отделить апекальное поворот. RW - круглое окно, OW и овальное окно. (b)Вершина отделена от улички, как указано стрелой. Красная линия между круглым окном и овальным окном указывает на второй разрез, сделанный в улине. (c)Кохлеарная часть, содержащая средние, базальные и крючковые области, отделена от вестибулярной части. (d)Кохлеарная часть расположена лицом вверх. Красная линия указывает на третий разрез, направленный к концу, из которого был удален акиальный участок. (e) Стрелка указывает на зазор, оставшийся после завершения третьего разреза. (f) Это изображение показывает среднюю область. (g)На этом снимке показаны комбинированные базальные и крюковые области. Вертикальная красная линия указывает на разрез между областью modiolus и крючком. Разрез между базальными и крючковые области указывается другой красной линией. (h)Базальные и крючковые области разделены, как указано стрелками. (i) Средняя область костлявой капсулы разрезается, как указано красной линией. (j) Изображение показывает среднюю область после того, как одна сторона костной капсулы удаляется. (k) Это изображение показывает среднюю область после завершения вскрытия. l)Все четыре региона полностью расчленены. (м)Cochlear превращается прикреплены к 10 мм круглый coverslip переданы четыре хорошего Петри блюдо с четырьмя регионами, как указано. Все изображения были сделаны под стерео-рассечением микроскопа на 1.2x, 2.5x, и 0.6x увеличения. На каждом изображении указаны бары масштаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Расположение основных сокращений. Вся кохлеачная костлявая капсула была удалена. Указаны места крупных сокращений. 1) Место, где акиальный поворот разрезается. 2) Участок, где отделяется средний поворот. 3) Критический разрез, чтобы удалить modiolus. 4) Линия для разделения базальных и крючковых областей. Шкала бар 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Конфокальные изображения показывают иммуномаркировку для CtBP2 и GluA2 на взрослых подготовке поверхности мыши. Обозначены атические, средние и базальные области. Нижнее увеличение конфокальные изображения были приняты с 10x объективом. Красный цвет - CtBP2, зеленый - GluA2. Шкала бар 100 мкм. Конфокальные изображения 5-, 16-и 32-кГц регионов были приняты с 63x объективом. Увеличенный вид областей, обозначенных белыми прямоугольниками в вершине, средней и базовой частях. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Конфокальные изображения показывают иммуномаркировку сенсорных волосковых клеток поверхностного приготовления из области 32 кГц. Все изображения были объединены проекциями стека. Фаллоидин (зеленый) запятнал структуру трех рядов OHCs и одного ряда IHCs. Myosin VIIa (красный) иммуномаркировки три ряда OHCs и один ряд IHCs. DAPI окрашенные ядра волосковых клеток. Слияние конфокальных изображений были реконструированы для боковых представлений сенсорных волосковых клеток. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Кохлеарные поверхностные препараты с клеем клетки и ткани и без них обрабатывались параллельно, иммуномаркировки для миозина VII (красный) и противопоставить фаллоидина (зеленый) с использованием идентичных решений. Используемый клей клеток и тканей не мешает иммунореакциям. Конфокальные изображения были сделаны с объективом 63x увеличение в одинаковых условиях и равных параметров параметров. Снимки были сделаны из области 32 кГц. Иммуномаркировка для миозина VIIa и окрашивание фаллоидина в УВК была аналогична с клеем клеток и тканей. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Сканирование электронной микроскопии показывает три ряда стереоцитов OHC от c57BL/6J мышей. Изображения были взяты из среднего региона. ()Низкое увеличение зрения трех рядов OHCs. (b) Увеличенные изображения показывают три ряда хорошо организованных стереоцитов OHC, которые появляются в формах "V". Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя | ||||||||
| Расстояние от вершины (мм) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| Расстояние от вершины (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Частоты (кГц) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Таблица 1: Картирование кохлеарной частоты CBA/J мыши как функции расстояния от вершины в соответствии с Мюллером1 и Viberg и Canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кохлеарная микродиссекция цельномонтажных препаратов поверхности в сочетании с иммуномаркировкой является основным инструментом для исследования патологий внутреннего уха и молекулярных механизмов. Этот модифицированный метод кохлеарного рассечения клеток и тканей с использованием клея клетки и ткани упрощает эту сложную процедуру.
Хотя этот модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности относительно прост и доступен, он по-прежнему требует практики для достижения квалификации. Чтобы сделать правильные сокращения, диссектор нуждается в тщательной концентрации. Поскольку кохлеарные сенсорные волосковые клетки в базальном повороте настолько близки к спиральной лимбу, трудно полностью удалить ткань лимбуса, чтобы поверхность подготовки лежать полностью плоским, но конфокальные прогнозы могут компенсировать этот вопрос. Кроме того, область крючка улики по-прежнему является самой трудной частью для вскрытия. Могут возникать разграничения между УВКи и МХК области крюк. Область крючка отображает большие анатомические изменения в организме человека и имеет важное значение для костно-проводимого слуха22,23. На основе кохлеарного отображения частоты сообщили Мюллер1 и Viberg и Canlon2, крючок области, начиная около 4,7 мм от вершины, соответствует чувствительности к 48 кГц тонов и выше (Таблица 1), в то время как слуховые функциональные оценки приобретенной потери слуха у мышей, в том числе шуминдуцированной, аминогликоид индуцированной потерей слуха, и возрастной потерей слуха, как правило, измеряются на 8, 16 и 32 кГц со слуховой реакцией ствола мозга (ABR)5,6 ,7,9,24 и от 6-45 кГц с искажением продукта отоакустические выбросы (DPOAE)25. В согласии с Монтгомери и др., искажение эпителия обычно не наблюдается, когда спираль делится на 3-4 штук19.
Представленный здесь метод включает в себя расчленение кохлеарной спирали на четыре части (вершина, средний, базальные повороты и область крючка), в то время как техника Eaton-Peabody производит шесть частей18. Техника Eaton-Peabody начинается с кохлеарного бисекции, которая позволяет избежать тангенциальных прорезей через эпителий, чтобы сначала отделить апикальный поворот от остальной части спирали, как описано в этой модифицированной технике. Производя более мелкие кусочки, техника Eaton-Peabody предназначена для минимизации уплощения, необходимого для просмотра большого куска с целью погружения. В самом деле, большие части ткани облегчить измерение частоты отображения от apical к базальному повороту, в соответствии с Монтгомери и др.19. Кроме того, разница между этим методом и Монтгомери и др.19 заключается в том, что модифицированный метод кохлеарного вскрытия, описанный здесь, использует скальпель для большинства порезов и только один шаг делается с ножницами (т.е. разделение базальных и крюковых регионов как иллюстрируется в третьем разрезе на рисунке 2), в то время как Монтгомери и др.19 использовали ножницы с силиконовым elastomer покрытием вскрытия блюдо для поверхностных препаратов. Чтобы избежать искажения ткани, отключение базилярной мембраны для удаления модиолуса имеет решающее значение.
Этот протокол использует клей клетки и ткани (Таблица материалов) для прижаться части кохлеарного эпителия к 10 мм круглый крышка для иммуномаркировки или иммуногистохимии, что делает процессы более удобными и позволяет избежать потери эпителий ткани во время многочисленных стисов иммуномаркировки процедур. Клейк клеток и тканей является формула полифенольных белков, который придерживается клеток и тканей и широко используется во многих распространенных методов in-vitro, включая иммуногистохимию, гибридизацию на месте, ииммуноанализы 20. В соответствии с понятием, что клей клетки и ткани не мешает иммунореакции, параллельная иммуномаркировка миозина VIIa с поверхностными препаратами не показывает разницы иммунореакций или однородности с и без клетки и ткани Клей. Сравнивая эти три метода вскрытия (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, и описанный модифицированный метод), аспиранты в лаборатории согласны с тем, что этот модифицированный метод с использованием клея клетки и ткани легче узнать и Мастер.
Таким образом, производство цельномонтаж взрослых подготовки поверхности мыши является основным навыком для оценки кохлеарных патологий. Описанный измененный протокол для взрослых мышей поверхностных препаратов упрощает эту сложную процедуру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Описанный исследовательский проект был поддержан грантом R01 DC009222 от Национального института глухоты и других коммуникационных расстройств, Национальные институты здравоохранения. Эта работа велась в здании WR в МЦУ в отремонтированном помещении при поддержке гранта C06 RR014516. Звери были размещены в musC CRI животных объектов при поддержке гранта C06 RR015455 от вневедомственные научно-исследовательские учреждения программы Национального центра научных ресурсов. Авторы благодарят д-ра Иохена Шахта за его ценные комментарии и Андру Талашу за коррективы рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
