Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Cochlear forbehandling i voksen mus

doi: 10.3791/60299 Published: November 6, 2019

Summary

Denne artikkelen presenterer en modifisert cochlear overflate Forberedelses metode som krever Avkalking og bruk av en celle og vev lim for å overholde deler av cochlear prolifererende til 10 mm runde deksel slips for immunhistokjemi i voksen mus cochleae.

Abstract

Hørselsbehandling i sneglehuset avhenger av integriteten til de mechanosensory hårcellene. Over en levetid, hørselstap kan skaffes fra mange årsaker som eksponering for overdreven støy, bruk av ototoxic medisiner, bakteriell eller viral øret infeksjoner, hodeskader, og aldringsprosessen. Tap av sensoriske hårceller er en vanlig patologisk funksjon i varianter av ervervet hørselstap. I tillegg kan den indre hår celle synapse bli skadet av milde fornærmelser. Derfor er overflate preparater av cochlear prolifererende, i kombinasjon med immunolabeling teknikker og konfokalmikroskopi bilder, et svært nyttig verktøy for etterforskning av cochlear patologi, inkludert tap av bånd synapser og sanse hårceller, endringer i proteinnivåer i hårceller og støtte celler, hår celle regenerering, og fastsettelse av rapport genuttrykk (dvs. GFP) for verifisering av vellykket Transduction og identifisering av transduced celletyper. Cochlea, en tynn spiral-formet struktur i det indre øret, holder hørsels sensorisk ende organ, orgelet i Corti (OC). Sensoriske hårceller og omkringliggende støtte celler i OC finnes i cochlea-kanalen og hviler på basilar membranen, organisert i en tonotopic mote med høyfrekvent deteksjon som forekommer i basen og lav frekvens i Apex. Med tilgjengeligheten av molekylær og genetisk informasjon og evnen til å manipulere gener ved knockout og knock-in teknikker, har mus vært mye brukt i biologisk forskning, blant annet i hørsels vitenskap. Men den voksne musen cochlea er minimale, og cochlear epitel er innkapslet i en tynn labyrint, noe som gjør microdissection vanskelig. Selv om disseksjon teknikker har blitt utviklet og brukt i mange laboratorier, er denne modifiserte microdissection metoden ved hjelp av celle og vev lim enklere og mer praktisk. Den kan brukes i alle typer voksen mus cochleae følgende Avkalking.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cochlea er dedikert til påvisning av lyd og ansvarlig for hørsel. Cochlea-kanalen er spiral i en spiralform i bein labyrinten og holder hørsels sensorisk ende organ, orgelet i Corti (OC). OC hviler på basilar membranen, noe som gjør opp cochlear epitel, med en lengde på ca 5,7 mm når rulles i voksen CBA/CaJ mus1,2. Fordi OC er tonotopically organisert med høye frekvenser oppdages i basen og lave frekvenser i Apex, er cochlear epitel ofte delt inn i tre deler for analytiske sammenligninger: Den apikale, midtre og basale svinger tilsvarende lav, Middels, og høy frekvens deteksjon, henholdsvis. I tillegg til en rekke støtte celler, er OC sammensatt av en rad med indre hårceller (IHCs) som ligger anteriort og tre rader med ytre hårceller (OHCs) som ligger sidelengs med hensyn til cochlear spiral.

Riktig hørselsbehandling avhenger av integriteten til de sensoriske hårcellene i sneglehuset. Skade på eller tap av sensoriske hårceller er en vanlig patologisk funksjon av ervervet hørselstap, forårsaket av en rekke årsaker som for eksempel eksponering for overdreven støy, bruk av ototoxic medisiner, bakteriell eller viral øret infeksjoner, hodeskader, og den aldrende prosess3. I tillegg kan integriteten og funksjonen til det indre hår celle/hørselsnerven synapser svekkes av milde fornærmelser4. Med tilgjengeligheten av molekylær og genetisk informasjon og manipulering av gener ved knockout og knock-in teknikker, har mus vært mye brukt i hørsel vitenskap. Selv om den voksne musen cochlea er ørsmå og cochlear epitel er omgitt av en bein kapsel som resulterer i teknisk vanskelig microdissections, overflate preparater av epitel i kombinasjon med immunolabeling eller immunhistokjemi og konfokalmikroskopi bilder har blitt brukt i stor grad for undersøkelse av cochlear patologi, inkludert tap av bånd synapser og hårceller, endringer i nivåer av proteiner i sensoriske hårceller og støtte celler, og hår celle regenerering. Cochlear overflate forberedelser har også blitt brukt til å bestemme mønsteret for uttrykk for reporter gener (dvs. GFP) og bekrefte vellykket Transduction og identifisere transduced celletyper. Disse teknikkene har tidligere blitt brukt til studiet av molekylære mekanismer underliggende støy-indusert hørselstap ved hjelp av voksen CBA/J mus5,6,7,8,9.

I motsetning til immunhistokjemi som bruker para fin seksjoner eller cryosections for å oppnå små tverrsnitt deler av cochlea som inneholder tre ytre hårceller (OHCs) og en indre hår celle (IHC) på hver del, tillater visualisering av hele lengden av OC for telling av sensoriske hårceller og bånd synapser og immunolabeling av sensoriske hårceller som tilsvarer spesifikke funksjonelle frekvenser. Tabell 1 viser kartlegging av hørsel frekvenser som en funksjon av avstand langs lengden av cochlear spiral i voksen CBA/J Mouse Ifølge studier fra Muller1 og Viberg og Canlon1,2. Cochlear Surface-preparater har blitt mye brukt til undersøkelse av cochlear patologi4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den hel-Mount cochlear disseksjon metoden ble opprinnelig beskrevet i en bok redigert av hans Engstrom i 196616. Denne teknikken ble senere raffinert og tilpasset en rekke arter som beskrevet i litteraturen av en rekke forskere i høring Science10,12,13, 15,17 og ved Eaton-Peabody Laboratories ved Massachusetts Eye og Ear18. Nylig ble en annen cochlear disseksjon metode rapportert av Montgomery et al.19. Microdissection av cochlea er et viktig og kritisk trinn for forberedelser til overflate forberedelse av cochlea. Imidlertid, dissekere musen cochleae er en teknisk angripe og behøver betydelig praksis. Her presenteres en modifisert cochlear overflate forberedelse metoden for bruk i voksen mus cochleae. Denne metoden krever Avkalking og bruk av celle og vev lim (dvs. Cell-tak) for å overholde bitene av cochlear epitel til 10 mm runde coverslips for immunolabeling. Celle og vev limet har vært mye brukt for immunhistokjemi20. Denne modifiserte cochlear microdissection-metoden er relativt enkel sammenlignet med de tidligere rapporterte18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forsknings protokoller som involverer mannlig voksen CBA/J mus i alderen 10-12 uker og C57BL/6J mus i alderen 6-8 uker ble godkjent av institusjonelle Animal Care and use Committee (IACUC) ved Medical University of South Carolina (MUSC). Animal omsorg var under tilsyn av delingen av laboratorium Animal Resources på MUSC.

Merk: For prosedyrene som presenteres nedenfor, er mus anesthetized med ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) via intraperitoneal injeksjoner. Mus er halshugget etter at dyret ikke lenger reagerer på smertefulle stimuli, for eksempel en tå knipe.

1. ekstraksjon av timelige bein

  1. Halshugge musa umiddelbart postmortem med kirurgisk saks (17 cm lang) og kutt skallen bein med saks fra bakre aspekt fremover langs midten linje av skallen etter utsette skallen benet ved å trekke i huden anteriort.
  2. Fjern hjernevevet ved hjelp av pinsett og manuelt fjerne timelige bein med tommelen og pekefingeren for mus tre måneders alder eller eldre. Bruk liten kirurgisk saks (11 cm lang) for å kutte den timelige bein av mus yngre enn tre måneder gammel.
  3. Sett det timelige benet inn i en Petri-tallerken (30 mm i diameter) som inneholder iskald frisk 4% paraformaldehyde (PFA) løsning oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7,4.
    Merk: Forbered frisk 4% PFA løsning og Juster pH til 7,4 like før du reparerer timelige bein, fordi uriktig pH balansering av PFA løsningen vil redusere kvaliteten på immunolabeling.

2. fiksering og

  1. Fjern stigbøylen fra det ovale vinduet og stikk den runde vindus membranen med størrelse #5 tang. Under et stereo disseksjon mikroskop gjør et lite hull i toppen av cochlea ved hjelp av en 27 G nål koblet til en 1 mL sprøyte.
  2. Forsiktig og langsomt perfuse cochlea med 4% PFA løsning via runde og ovale vinduer til løsningen vasker ut av det lille hullet på toppen. Overfør cochlea (ett eller to cochleae per hetteglass) til 20 mL volum scintillation hetteglass som inneholder 10 mL 4% PFA oppløsning.
  3. Agitere forsiktig de scintillation hetteglassene ved romtemperatur (RT) i 2 timer og la det ligge i kjøleskapet (4 ° c) på en rotator.
    Merk: Fikserings tiden kan justeres avhengig av hvilket antistoff som brukes. For eksempel, begrense fiksering til 1,5 h vil tillate vellykket immunolabeling av post Synaptic terminaler når du bruker GluA 2 antistoff.

3. Avkalking av Temporal Bone

  1. Fjern PFA-løsningen og vask cochleae med frisk PBS 3x i 5 minutter hver.
  2. Tilsett 20 mL 4% ethylenediaminetetraacetic syre Disodium salt (EDTA) oppløsning (pH 7,4) til de scintillation hetteglassene og oppbevares i kjøleskap i 48 – 72 timer på en Rotator med skånsom agitasjon. Endre EDTA-løsningen daglig til cochleae er decalcified. Sjekk om cochleae er decalcified ved å berøre bein Vestibular delen med tang for å vurdere for elastisitet eller bare skjære et lite stykke fra kanten av den Vestibular delen. Hvis et slikt snitt resulterer i et knust stykke, er sneglehuset ikke decalcified.
    Merk: EDTA-løsningen kan forstyrre immunoreaction av primære antistoffer avhengig av løsnings konsentrasjonen. Forbered 4% EDTA i PBS og justere pH til 7,4. For konsekvent Avkalking av timelige bein, fersk EDTA-løsning brukes.
  3. Endre løsningen til PBS for microdissection etter at avkalking er fullført.
    Merk: Hvis cochleae ikke er tilstrekkelig decalcified, kan Disseksjon av cochleae ikke utføres.

4. Microdissection av cochlear epitel

Merk: Når avkalking er fullført, må microdissection av cochlea-epitel for immunolabeling utføres så snart som mulig. I en ren 30 mm Petri parabolen inneholder PBS, er det indre øret orientert på følgende måte: i referanse til Petri parabolen topp (lokk) og bunn, cochlear runde og ovale vinduer ansikt toppen. I referanse til dissector er cochlea-delen orientert mot fronten (borte fra dissector) og Vestibular delen mot baksiden (nær dissector). Nedenfor beskrives trinnene i detalj.

  1. Hold den Vestibular delen av Tinning benet med pinsett og skjær apikale sving med skalpell i en 45 ° vinkel som indikert av den røde linjen (figur 1a).
  2. Skjær vertikalt langs den svake linjen mellom det runde vinduet og det ovale vinduet, som indikert av den røde linjen (figur 1b) for å skille sneglehuset fra den Vestibular delen (figur 1c).
    Merk: Dette cochlear delen inneholder midten, basal, og krok deler av epitel.
  3. Plasser cochlear delen med basal sving mot bunnen og den midtre sving mot toppen av Petri parabolen og kutt bein kapselen og lateral veggen på midten sving mot slutten som apikale delen ble fjernet, som indikert av den røde linjen (Figu Re 1d, e).
  4. Fortsett å kutte for å helt skille den midterste delen fra basal og krok regioner (figur 1f, g).
    Merk: Kroken regionen i sneglehuset er slutten av cochlea epitel tilsvarende følsomhet for toner 48 kHz og høyere i mus.
  5. Sett basal og krok del med basilar membran området orientert mot bunnen av fatet og vertikalt kuttet modiolus av kroken regionen for å fjerne modiolus som indikert av den vertikale røde linjen (figur 1g).
    Merk: Modiolus er den koniske, sentrale aksen i sneglehuset som består av svampete bein og cochlea-nerve samt spiral Ganglion. Det kan være å foretrekke å utføre denne kuttet med saks.
  6. Skjær basal og krok regioner som den andre røde linjen indikerer i figur 1g å skille kroken delen (figur 1h).
    Merk: Cochlea er nå delt opp i apikale, midtre, basale og krok porsjoner. De neste trinnene vil være den endelige Disseksjon av hver av de enkelte svinger, ved hjelp av midtre sving som et eksempel.
  7. Skjær bort de relativt store deler av bein kapsel og lateral vegg vev i midten sving som indikert av den røde linjen (figur 1i).
    Merk: Den laterale veggen av cochlear duct er dannet av spiral leddbånd og stria vascularis.
  8. Hold den laterale veggen med tang for å justere bein kapselen og lateral veggen med bunnen av Petri parabolen og skjær disse vev fra basilar membran side. Deretter flate prøven for å orientere den sensoriske hår celleoverflaten side opp. Trim bort resten av bein kapselen og sideveggen (figur 1j).
  9. Fjern tectorial membranen ved hjelp av pinsett for å skille mellom midten regionen (figur 1k).
  10. Gjenta trinn 4.7 − 4.9 for den endelige dissections av de resterende svingene eller regionene som vist i figur 1l.
  11. Forbered en 10 mm rund dekkglass for vedheft av sensorisk epitel. Bruk en pipette til hånd-spredning 0,5 μL av celle og vev lim på midten av den runde dekkglass. Etter tørking (3-5 min ved RT), sette coverslips i PBS i Petri retter.
  12. Stick alle fire stykker av sensorisk epitel på 10 mm runde dekkglass i Petri parabolen. Deretter holder du den ene kanten av dekkglass for å overføre den til en fire-brønn parabol for immunolabeling eller immunhistokjemi (figur 1m).
    Merk: figur 2 illustrerer plasseringen av de store kuttene.

5. Immunolabeling for cochlear synapser

Merk: Protokollen for immunolabeling for cochlear synapser fulgt i denne studien har tidligere blitt beskrevet13. Presynaptiske nerve bånd ble merket med et CtBP2-antistoff (mus anti-kar bok syl-Terminal bindings protein 2 IgG1, merking av B-domenet til RIBEYE stillas protein). Post Synaptic terminaler ble merket med GluA2 antistoff (mus anti-glutamat reseptor 2 IgG2a, merking under enheter av AMPA reseptor).

  1. Vask sensorisk epitel med PBS 3x for 5 min hver vask i en fire-brønn parabol og deretter legge 2 mL 2% ioniske overflateaktivt middel (dvs., Triton-X 100) i fatet i 30 min på RT på en rotator.
  2. Fjern den ioniske overflateaktive middel løsningen fra parabolen ved hjelp av en pipette og tilsett 100 μL av blokkerings løsning som inneholder 10% normal geit serum til hver brønn for 1 time på en Rotator med skånsom agitasjon på RT.
  3. Fjern blokkerings løsningen fra hver brønn, vask med PBS 3x i 5 minutter hver vask under skånsom agitasjon ved RT.
  4. Tilsett 100 μL av den primære antistoffer fortynnet med PBS til hver brønn: mus anti-GluA2 IgG2a (1:2000), mus anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Dekk hver fire-godt parabolen med lokket og plasser i en stor fuktet beholder som beskytter mot lys. Ruge ved 37 ° c for 24 h.
    Merk: Som et alternativ, kanin anti-myosin VIIa (1:400) for immunolabeling sensoriske hårceller kan tilsettes.
  5. Vask 3x med PBS i 5 minutter hver vask med skånsom agitasjon ved RT.
  6. Tilsett 100 μL av sekundære antistoffer Alexa 594 geit anti-mus IgG1a (1:1000), Alexa 488 geit anti-mus IgG2a (1:1000) fortynnet med PBS til hver brønn. Dekk hver fire-godt parabolen med lokket og plasser i en stor fuktet beholder som beskytter mot lys. Ruge ved 37 ° c for 2 h.
    Merk: Hvis myosin VIIa brukes, Legg Alexa 350 geit anti-kanin (1:200).
  7. Vask 3x med PBS i 5 min. Deretter overfører du de 10 mm runde dekkglass til et lysbilde med prøvene oppå.
  8. Legg forsiktig til 8 μL av fluoro-gel med Tris-buffer i midten av dekkglass. Deretter holder kanten av en annen 10 mm rund dekkglass med tang for å montere på toppen, sandwiching de to coverslips sammen.
  9. Bruk neglelakk å forsegle lysbildene, legg dem i en papp Slide mappe, og oppbevar i kjøleskapet.
    Merk: Hvis noen fluoro-gel lekker ut mellom coverslips under montering, rengjør kantene på coverslips før tetting av raset med neglelakk. Konfokalmikroskopi bilder må tas innen 7 dager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Overflate preparater av cochlea-epitel, i kombinasjon med immunolabeling og konfokalmikroskopi avbildning, har blitt brukt i stor grad i hørsels vitenskap for etterforskning av cochlea-patologi, slik som kvantifisering av bånd synapser, sanse hårceller, og protein uttrykk i sensoriske hårceller5,6,7,8. Selv om Disseksjon av voksen mus cochleae for overflate forberedelser er ikke enkel, nye graduate studenter er i stand til å lære denne endrede metoden etter å øve med 10 – 15 ører (figur 1 og figur 2). Med denne teknikken, i kombinasjon med immunolabeling for CtBP2 (en markør for presynaptiske nerve bånd) og GluA2 (en markør for post Synaptic terminaler), telling IHC/hørbar nerve synapser bruke konfokalmikroskopi bilder under Z anslag med 0,25 μm intervaller, basert på størrelsen på musen bånd synapser, er mulig21. Dette samsvarer med publiserte resultater4,6,13. Surface preparater av CBA/J mus (uten behandling) i en alder av 10-12 uker immunolabeled med CtBP2 (rød) og GluA2 (grønn) viste at både presynaptiske nerve bånd og post Synaptic terminaler er plassert under IHC kjerner og er sidestilt, indikerer funksjonell synapser (Figur 3)6,13.

Ved immunolabeling overflate preparater med forskjellige antistoffer, er vurdering av molekylær signalering og struktur i sensoriske hårceller mulig. Figur 4 viser for eksempel resultatene for immunolabeling for myosin VIIa og counterstaining med phalloidin og 4 ', 6-diamidino-2-PHENYLINDOLE (DAPI). Parallelle immunolabeling eksperimenter med og uten celle og vev lim med identiske løsninger er utført for å vurdere om limet som brukes forstyrrer immunoreactions. Immunolabeled med myosin VIIa og counterstained med phalloidin. Konfokalmikroskopi bilder ble tatt med en 63x forstørrelse linse under identiske forhold og like parameterinnstillinger for laser gevinster og photomultiplier Tube (PMT) gevinster. Det var ingen forskjell i immunoreactions eller ensartethet med og uten celle og vev lim (figur 5). Ved hjelp av ulike fiksativene har overflate preparater gitt grunnlag for å skanne elektron mikroskopi (SEM) bilder for visualisering av cochlear stereocilia9. C57BL/6J-mus (uten behandling) i en alder av 6 – 8 uker viser godt organiserte V-formede stereocilia av OHCs i tre rader (figur 6). I tillegg har cochlear overflate forberedelser blitt brukt til å bestemme mønsteret av uttrykk for et rapport gen (dvs. GFP) og bekrefte vellykket Transduction og identifisere transduced celletyper.

Figure 1
Figur 1: skildring av trinnene for voksen mus overflate forberedelser. (a) cochlear bein kapselen til Tinning benet vender opp. Den røde linjen indikerer det første kuttet for å skille apikale sving. RW = runde vindu, OW = oval vindu. (b) Apex er adskilt fra sneglehuset som indikert av pilen. Den røde linjen mellom det runde vinduet og det ovale vinduet indikerer det andre snittet som ble gjort i sneglehuset. (c) cochlear-delen som inneholder de midtre, basale og krok regionene er adskilt fra den Vestibular delen. (d) cochlear-delen ligger vendt oppover. Den røde linjen indikerer det tredje kuttet, rettet mot slutten som apikale delen ble fjernet. (e) pilen indikerer gapet igjen etter ferdigstillelse av tredje kuttet. (f) dette bildet viser den midtre regionen. (g) dette bildet viser de kombinerte basal-og krok regionene. Den vertikale røde linjen indikerer snittet mellom modiolus og krok regionen. Snittet mellom basal og krok regioner er indikert av den andre røde linjen. (h) basal og Hook områder er separert som indikert av pilene. (i) den midtre delen av bein kapselen kuttes som indikert av den røde linjen. (j) bildet viser den midtre regionen etter at den ene siden av bein kapselen er fjernet. (k) dette bildet viser den midtre regionen etter fullføring av disseksjon. (l) alle fire regionene er helt dissekert. (m) cochlear svinger festet til en 10 mm rund dekkglass overført til en 4-brønn Petri parabolen med de fire regionene som indikert. Alle bilder ble tatt under et stereo-disseksjon mikroskop på 1,2 x, 2,5 x, og 0,6 x forstørrelser. Skala linjer er angitt i hvert bilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: plassering av de store kuttene. Den totale cochlea bein kapselen ble fjernet. Plasseringen av de store kuttene er indikert. 1) stedet der apikale tur er kuttet. 2) stedet der midten sving er separert. 3) den kritiske kutt for å fjerne modiolus. 4) linjen for å dele basal og krok regioner. Scale bar = 0,5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: konfokalmikroskopi bilder avslører immunolabeling for CtBP2 og GluA2 på voksen mus overflate forberedelser. De apikale, midtre og basale regionene er merket. Den nedre forstørrelse konfokalmikroskopi bilder ble tatt med en 10x linse. Rød = CtBP2, grønn = GluA2. Scale bar = 100 μm. Konfokalmikroskopi bilder av 5-, 16-og 32-kHz-områder ble tatt med et 63x-objektiv. Forstørret visning av områdene som er angitt av de hvite rektanglene i de Apex-, midtre-og basis delene. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: konfokalmikroskopi bilder avslører immunolabeling av sensoriske hårceller i en overflate forberedelse fra 32-kHz regionen. Alle bilder ble slått sammen Z-stack anslag. Phalloidin (grønn) beiset strukturen av de tre rader av OHCs og en rad av IHCs. Myosin VIIa (rød) immunolabeled tre rader med OHCs og én rad med IHCs. DAPI hår cellekjerner. Sammenslåtte konfokalmikroskopi bilder ble rekonstruert for sidevisninger av sanse hårceller. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: cochlear overflate preparater med og uten celle og vev limet ble behandlet parallelt, immunolabeled for MYOSIN VII (rød), og counterstained med phalloidin (grønn) ved hjelp av identiske løsninger. Celle-og vevs limet som brukes, forstyrrer ikke immunoreactions. Konfokalmikroskopi bilder ble tatt med en 63x forstørrelse objektiv under identiske forhold og like parameterinnstillinger. Bildene ble tatt fra 32 kHz regionen. Immunolabeling for myosin VIIa og farging for phalloidin i OHCs var lik med og uten celle og vev lim. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: skanning av elektron mikroskopi viser tre rader med OHC-stereocilia fra C57BL/6J-mus. Bilder ble tatt fra den midtre regionen. (a) en lav forstørrelse visning av tre rader med OHCs. (b) forstørrede bilder viser tre rader med godt organiserte OHC-stereocilia som vises i "V"-figurer. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

navn
Avstand fra Apex (mm) 0,4 1 2,4 3,3 3,9 4,7 5,7
Avstand fra Apex (%) 7,7 18 43 54 68 82 100
Frekvenser (kHz) 6 8 16 22 32 48

Tabell 1: kartlegging av CBA/J musen cochlear frekvens følsomhet som en funksjon av avstand fra Apex i henhold til Muller1 og Viberg og Canlon2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cochlear-microdissection av overflate forberedelser i kombinasjon med immunolabeling gir et grunnleggende verktøy for etterforskning av indre øre sykdommer og molekylære mekanismer. Denne modifiserte voksen musen cochlear disseksjon metoden ved hjelp av celle og vev limet forenkler denne vanskelige prosedyren.

Selv om denne endrede cochlear forbehandling metoden er relativt enkel og tilgjengelig, krever det fortsatt praksis for å oppnå ferdigheter. For å gjøre de riktige kuttene, trenger dissector nøye konsentrasjon. Fordi cochlear sensoriske hårceller i basal sving er så nær spiral limbus, er det vanskelig å fullt ut fjerne limbus vev slik at overflaten forberedelse til å ligge helt flatt, men konfokalmikroskopi Z-anslag kan kompensere for dette problemet. I tillegg er kroken regionen i sneglehuset fortsatt den vanskeligste delen å analysere. Det kan oppstå separasjoner mellom OHCs og IHCs på krok området. Kroken regionen viser store anatomiske variasjoner i mennesker og er viktig for Ben-ledning høring22,23. Basert på den cochlear frekvens kartlegging rapportert av Muller1 og Viberg og Canlon2, kroken regionen, som begynner rundt 4,7 mm fra Apex, tilsvarer følsomhet til 48 kHz toner og høyere (tabell 1), mens hørbar funksjonell vurderinger av ervervet hørselstap hos mus, inkludert støy induserte, aminoglykosid hørselstap og alders relaterte hørselstap, måles vanligvis med 8, 16 og 32 kHz med hørsels hjernestammen respons (ABR)5,6 ,7,9,24 og 6 – 45 kHz med forvrengning produkt otoacoustic utslipp (DPOAE)25. I samråd med Montgomery et al., forvrengning av epitel er ikke ofte sett når spiral er delt inn i 3-4 stykker19.

Den modifiserte metoden som presenteres her innebærer dissekere av cochlear spiral til bare fire brikker (Apex, midtre, basale svinger, og kroken regionen), mens Eaton-Peabody teknikken produserer seks stykker18. Teknikken Eaton-Peabody starter med en cochlear bisection, som unngår å gjøre tangential skjærer gjennom epitel for å først skille apikale sving fra resten av Spiralen, som beskrevet i denne modifiserte teknikken. Ved å produsere mindre deler er Eaton-Peabody designet for å minimere sammenslåingen som kreves for å vise et stort stykke med en nedsenking mål. Faktisk, de større delene av vev Letter måling av frekvens kartlegging fra apikale til basal sving, i tråd med Montgomery et al.19. I tillegg, en forskjell mellom denne metoden og Montgomery et al.19 er at den modifiserte cochlear disseksjon metoden beskrevet her benytter en skalpell for de fleste kutt og bare ett skritt er gjort med saks (dvs. separasjon av basal og krok regioner som illustrert i den tredje kuttet i figur 2), mens Montgomery et al.19 brukt saks med en silikon elastomer-belagt disseksjon parabolen for overflate forberedelser. For å unngå forvrengning av vevet, er frakobling av basilar membranen for å fjerne modiolus kritisk.

Denne protokollen bruker en celle og vev lim (tabell av materialer) for vedheft av bitene av cochlea epitel til 10 mm runde dekkglass for immunolabeling eller immunhistokjemi, som gjør prosessene mer praktisk og unngår tap av epitel vev under flere vasker av immunolabeling prosedyrer. Celle-og vevs limet er en formulering av polyfenoliske proteiner som overholder celler og vev, og som har blitt mye brukt i mange vanlige in vitro-teknikker, inkludert immunhistokjemi, in-situ-hybridisering og immunanalyser20. I samsvar med forestillingen om at celle og vev limet ikke forstyrrer immunoreactions, parallelle immunolabeling av myosin VIIa med overflate preparater viser ingen forskjell på immunoreactions eller ensartethet med og uten celle og vev Lim. Sammenligne disse tre disseksjon metoder (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, og den endrede metoden beskrevet), den Graduate studentene i laboratoriet enige om at denne endrede metoden ved hjelp av celle og vev limet er lettere å lære og Master.

Oppsummert, produsere hel-Mount voksen mus overflate forberedelser er en grunnleggende ferdighet for evaluering av cochlear patologi. Den beskrevne modifisert protokoll for voksne mus overflate forberedelser forenkler denne vanskelige prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskningsprosjektet beskrevet ble støttet av stipend R01 DC009222 fra National Institute on døvhet og andre kommunikasjons forstyrrelser, National Institutes of Health. Dette arbeidet ble gjennomført i WR Building på MUSC i renovert plass støttes av stipend C06 RR014516. Dyr ble plassert i MUSC CRI dyr anlegg støttes av stipend C06 RR015455 fra ekstra Research fasiliteter program av National Center for Research Resources. Forfatterne takker Dr. Jochen Schacht for hans verdifulle kommentarer og Andra Talaska for korrekturlesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm Rund Coverslips Microscopy products for science and industry 260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 Thermo Fisher Scientific A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 Thermo Fisher Scientific A-21125
Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A11012
Carboard Micro Slide Trays Fisher Scientific 12-587-10
Cell-Tak BD Biosciences 354240
Corning Petri Dishes Fisher Scientific 353004
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
Dumont #5 Forceps FST fine science tools 11251-20
EDTA Disodium Salt Sigma-Aldrich E5134
Fluoro-gel with Tris Buffer Electron Microscopy Sciences 17985-10
Four-well Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 627170
Goat Anti-myosin VIIa Antibody Proteus Biosciences 25-6790
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse Anti-CtBP2 Antibody BD Biosciences #612044
Mouse Anti-Glu2R Antibody Millipore MAB397
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 31872
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Scalpel VWR 100491-038
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15001-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202, (1-2), 63-73 (2005).
  2. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197, (1-10), (2004).
  3. Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26, (1), 85-96 (2017).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  5. Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32, (36), 12421-12430 (2012).
  6. Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36, (28), 7497-7510 (2016).
  7. Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20, (3), 217-232 (2019).
  8. Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22, (15), 1308-1324 (2015).
  9. Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
  10. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109, (1-2), 34-45 (1997).
  11. Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13, (1), 20-30 (2006).
  12. Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81, (2), 179-193 (1972).
  13. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  14. Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
  15. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (2), 781-785 (2008).
  16. Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
  17. Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
  18. MassEyeAndEar.org. https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
  19. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  20. Corning Cell Culture Surfaces. https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
  21. Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209, (2-3), 153-165 (2006).
  22. Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19, (6), 378-385 (2014).
  23. Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107, (1), 233-241 (2014).
  24. Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
  25. Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
Cochlear forbehandling i voksen mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).More

Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter