Drosophila Flight muskel er en kraftfuld model til at studere transkriptional regulering, alternative splicing, metabolisme, og mechanobiology. Vi præsenterer en protokol for dissektion af fluorescerende-mærket flyve muskel fra levende pupper til at generere meget berigede prøver ideel til proteomics og dybe sekvensering. Disse prøver kan tilbyde vigtig mekanistisk indsigt i forskellige aspekter af muskel udvikling.
Drosophila Flight muskel er en kraftfuld model til at studere forskellige processer såsom transkriptional regulering, alternative splicing, metabolisme, og mechanobiology, som alle påvirker muskel udvikling og myofibrillogenesis. Omics-data, såsom dem, der genereres af massespektrometri eller dybe sekvensering, kan give vigtig mekanistisk indsigt i disse biologiske processer. For sådanne tilgange er det gavnligt at analysere vævsspecifikke prøver for at øge både selektiviteten og specificiteten af de omik-fingeraftryk. Her præsenterer vi en protokol for dissektion af fluorescerende-mærket flyve muskel fra levende pupper til at generere stærkt berigede muskel prøver for omik applikationer. Vi først beskrive, hvordan man dissekere Flight muskler i begyndelsen af før etaper ( 48 h APF) eller voksne, når musklerne kan skelnes under en dissekere mikroskop. Den medfølgende video protokol vil gøre disse teknisk krævende dissektioner mere bredt tilgængelige for musklen og Drosophila forskersamfund. For RNA-applikationer, vi assay mængden og kvaliteten af RNA, der kan isoleres på forskellige tidspunkter og med forskellige tilgange. Vi viser endvidere, at Bruno1 (Bru1) er nødvendig for en tidsmæssig forskydning i myosin Heavy Chain (MHC) splicing, hvilket viser, at dissekerede muskler kan anvendes til mRNA-SEQ, massespektrometri, og reverse transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR) Programmer. Denne dissektion-protokol vil bidrage til at fremme vævsspecifikke omik-analyser og kan generelt anvendes til at studere flere biologiske aspekter af myogenesis.
Moderne omik teknologier giver vigtig indsigt i muskel udvikling og de mekanismer, underliggende menneskelige muskellidelser. For eksempel har analysen af transkriptomics-data kombineret med genetisk og biokemisk verifikation i dyremodeller afsløret, at tabet af splejsning-faktoren RBM20 forårsager forstørret kardiomyopati på grund af dets regulering af et målnetværk på mere end 30 sarcomere gener, der tidligere har været forbundet med hjertesygdomme, herunder tidligere1,2,3.
I et andet eksempel har undersøgelser fra cellekultur, dyremodeller og humane patienter vist, at myotonisk dystrofi skyldes en forstyrrelse i RNA-reguleringen som følge af binding af muscleblind (mbnl) og docetaxels opregulering af CELF14,5. Den tvær regulerende og tidsmæssige dynamik mellem mbnl og CELF1 (også kaldet CUGBP1 eller Bruno-lignende 2) bidrager til at forklare de vedvarende embryonale splejsning mønstre i myotoniske dystrofi patienter. Desuden, det store netværk af fejl regulerede mål hjælper med at forklare den komplekse karakter af sygdommen4,6,7,8. Et flertal af sådanne undersøgelser udnytter omik tilgange i genetiske model organismer til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for menneskets muskelsygdom. Desuden fremhæver de vigtigheden af første forståelse af tidsmæssig og vævstype specifikt genekspression, protein modifikation og metaboliske mønstre i raske muskler for at forstå ændringer i syge eller aldrende muskler.
Drosophila melanogaster er en anden veletableret genetisk model organisme. Strukturen af sarcomere samt individuelle sarcomere komponenter er meget bevaret fra fluer til hvirveldyr4,9,10, og indirekte Flight muskler (IFMS) er blevet en kraftfuld model til at studere flere aspekter af muskel udvikling11,12. Første, fibrillar Flight muskler er funktionelt og Morfologisk adskiller sig fra rørformede krops muskler11,13, tillader undersøgelse af muskel-typespecifikke udviklingsmekanismer. Transkriptionsfaktorer, herunder spalt Major (Salm)14, extradlole (Exd), og Homothorax (HTH)15 er blevet identificeret som fibrillar skæbne regulatorer. Desuden, nedstrøms for Salm, den CELF1 ligner Bruno1 (Bru1, aret) dirigerer en fibrillar-specifikke splejsning program16,17.
For det andet, IFMS er en vigtig model for at forstå processen med myogenesis selv, fra fremmer fusion og myotube vedhæftet fil til myofibrillogenesis og sarcomere modning9,18,19. For det tredje, Drosophila genetik tillader undersøgelse af bidrag af individuelle proteiner, protein domæner, og protein isoformer til sarcomere dannelse, funktion, og biofysiske egenskaber20,21,22 ,23. Endelig, ifm modeller er blevet udviklet til studiet af flere menneskelige muskellidelser, såsom myotonisk dystrofi, myofibrillar myopatier, muskel degenerative lidelser, aktinopatier, etc.24,25,26 ,27, og har givet vigtig indsigt i sygdomsmekanismer og potentielle terapier28,29,30. Således, Drosophila er en nyttig model til at løse mange åbne spørgsmål i myogenesis felt, herunder mekanismer af muskel-type specifik transskription, splejing, og kromatin forordning, samt til rollen af metabolisme i muskel udvikling. Anvendelsen af moderne omik-teknologier, især i kombination med de mange forskellige genetiske, biokemiske og celle biologiske analyser, der findes i Drosophila, har potentialet til dramatisk at fremme forståelsen af muskel udvikling, aldring og sygdom.
IFMS er de største muskler i flue, spænder næsten 1 mm over hele længden af thorax i voksne31,32. Men denne lille størrelse genererer udfordringen med at få nok prøve til at anvende omik teknologier i Drosophila i en vævstype specifik måde. Desuden er IFMS en del af den voksne muskulatur, der dannes under før etaper. Myoblasts Fuse til dannelse af myotubes, som Fastgør til sener omkring 24 h efter puparium dannelse (APF) og gennemgå et komprimerings trin nødvendigt at initiere myofibrillogenesis omkring 30 h APF (figur 1a-D)18,33, 34.
Den myofibers derefter vokse til at spænde hele længden af thorax, med myofibrils undergår en indledende vækstfase fokuseret på sarcomere tilsætning indtil omkring 48 h APF, og derefter overgår til en modning fase, hvor sarcomeres vokse i længde og bredde og er ombygget til at etablere stretch-aktivering af 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Fremkomsten af fiber modning er i det mindste delvist kontrolleret af Salm og E2F32,36,37, og flere ifm-specifikke sarcomere protein isoformer, hvis splejsning styres af Bru1 er indarbejdet i denne fase16,17. Modne fluer eclose fra 90 – 100 h APF. Det betyder, at for at studere muskel udvikling, ifm skal isoleres med tilstrækkelig mængde, kvalitet og renhed fra flere før tidspunkter for at lette analyse ved hjælp af omik tilgange.
Flere protokoller for ifm dissektion er blevet offentliggjort. Mens disse protokoller fungerer godt for deres tilsigtede applikationer, ingen er ideelle til omik tilgange. Protokoller, der bevarer ifm morfologi for immunofluorescens af før og voksne IFMS19, isolere ifm fibre til mekanisk evaluering31, eller udnytte microdissection af før ifm fra cryosektioner38 er for specialiseret og tid og arbejdskraftintensiv til rimeligt at opnå tilstrækkelige mængder af ifm væv for omik applikationer. Andre protokoller er blevet udviklet til hurtig dissektion af specifikt voksne ifm38,39, således ikke gælder for før etaper, og bruge buffere, der ikke er ideelle eller kan være uforenelig med, for eksempel, RNA isolation. Der er således behov for at udvikle nye tilgange til at isolere før ifm til biokemiske eller omik applikationer.
Her præsenterer vi en protokol for dissektion af ifm under før etaper, der er blevet anvendt med succes til mRNA-SEQ analyse fra 16 h APF gennem voksne etaper16,32. Protokollen anvender en grøn fluorescerende protein (gfp) etiket til at identificere IFMS i alle stadier af før og voksen udvikling, så levende dissektion under et fluorescerende dissekere mikroskop. Tilgangen er mindre arbejdskraftintensiv, med et højere gennemløb end eksisterende ifm dissektion-protokoller. Dette giver mulighed for hurtig isolation og Kryopreservation af prøver, genererer nok materiale efter flere runder af dissektion for omik tilgange samt for standard reverse transkriptionen polymerase kædereaktion (RT-PCR) eller Western blotting.
Vi præsenterer protokollen i to dele, viser, hvordan man hurtigt dissekere IFMS både før 48 h APF (under tidlig Metamorphosis, når ifm vedhæftede filer er mere svag) og efter 48 h APF (når før krop plan og ifm vedhæftede filer er veldefinerede). Vi viser, at vi kan isolere høj kvalitet RNA fra dissekeret IFMS på alle tidspunkter og præsentere data om forskellige tilgange til RNA isolation og reverse transskription. Endelig viser vi anvendelsen af dissektion-protokollen til mRNA-SEQ, massespektrometri og RT-PCR ved hjælp af CELF1 ligner Bruno1 som et eksempel. Vi viser misexpression af sarcomere protein isoformer i proteomics data fra Bruno1 mutant IFM og undersøger Bruno1 regulering af C-Terminal Splice hændelse af myosin Heavy Chain (MHC). Disse resultater illustrerer, hvordan omik-data kan give en dybere forståelse af biologiske fænomener, der supplerer genetiske og biokemiske eksperimenter.
I denne protokol præsenterer vi den grundlæggende teknik til dissekere Drosophila IFMS fra tidlig og sene pupper til nedstrøms isolering af protein, DNA, RNA eller andre makromolekyler. Protokollen kan let tilpasses til dissekere IFM fra voksne fluer. Vi demonstrerer nytten af vores dissektion-protokol for mRNA-SEQ-, proteomics-og RT-PCR-applikationer. Med den kontinuerlige forbedring af omik teknologier for at muliggøre analyse af prøver med mindre udgangsmateriale og lavere input koncentrationer, vil disse dissektioner sandsynligvis blive værdifulde for mange ekstra applikationer. Da IFMS er en etableret model for human myopatier4,24 og muskel-type specifik udvikling9,12, vi forestiller, for eksempel, ifm-beriget metabolomics, undersøgelser af kromatin konstellation via 3c eller 4c, splejsning netværk evaluering via CLiP interaktioner eller phospho-proteomics af myofibrillogenesis.
Det er vigtigt at overveje, at dissektionerne fremstiller en prøve beriget til IFM i stedet for en ren IFM-prøve. Dette er uundgåeligt på grund af motorisk neuron innervation, sene vedhæftede filer og trakeal invasion af muskelfibre. Bioinformatik analyse kan bruges til at identificere IFM-berigede gener eller proteiner, men der kræves yderligere eksperimenter for at påvise, at de faktisk er IFM-specifikke. Prøvens renhed kan prøves ved hjælp af publicerede vævsspecifikke markører såsom Stripe45 (Tendon), Act79B4,44 (tubulær muskel), Act88F15 (ifm) eller Syb46 (neuronal specifik). Det kan være muligt at bruge sådanne markører til at normalisere datasæt til IFM-specifikke indhold, men brugere er advaret om, at tidsmæssige ændringer i ekspression af gener, der anvendes til normalisering, for eksempel af IFM-specifikke gener eller Tubulin, kan bias en sådan tilgang.
Genetisk kodede vævsspecifikke mærkningsmetoder, for eksempel EC-tagging47,48 eller pabp-mærkning49,50 for isolerende RNA er blevet udviklet i de seneste år, hvilket kan bidrage til at opnå en virkelig vævs specifik RNA-prøve. Men EF-mærkning kræver konstant fodring af fluer47 og dermed ikke anvendes under før etaper. De PABP-mærkede transkriptomes følsomhed og fuldstændighed kan have begrænsninger51. FACS tilgange til at isolere individuelle muskelfibre er kompliceret af den store størrelse og syncytial karakter af IFMs. Intakt52,53 stil tilgange kan anvendes til at isolere specifikke subcellulære-rum fra IFMS, hvilket kan vise sig nyttigt til isolering af rene populationer af ifm kerner eller mitochondrier. Manuelle dissektioner er stadig den nuværende standard for at opnå intakt IFM-væv for de fleste downstream-applikationer.
Prøve kvaliteten afhænger af flere kritiske trin i dissektions processen. Dissektionerne er teknisk krævende, med dissektion hastighed og prøve renhed stigende med erfaring. Dissekting i korte perioder (20 – 30 min) i kølet buffer uden rengøringsmiddel og straks frysning hjælper med at bevare prøvens integritet, som tidligere er observeret for mus sene isolation54. IFMs kan med held tørre-frosne efter fjernelse af alle buffer fra pellet, men specielt for RNA isolation, frysning prøver i isolation buffer tendens til at producere bedre resultater. IFMS fra op til 20 separate dissektioner kombineres før RNA eller protein isolation, tillader opskalering og indsamling nok materiale, selv fra tidlige tidspunkter eller mutanter16,32, til downstream-analyse.
For RNA-applikationer kan det mest kritiske trin være isoleringen af selve RNA. Guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform isolation (metode 1 ovenfor) overgår de fleste kommercielle kits testet og, som tidligere bemærket, er betydeligt billigere55. Variabiliteten observeret i RNA-isolations udbyttet med kommercielle kits er i forståelse med tidligere observationer56,57. Vi tilføjer yderligere glykogen under isopropanol nedbør for at hjælpe genvinde alle RNA. Ud over RNA-udbyttet er det vigtigt at verificere RNA-integriteten for at sikre, at prøven ikke er blevet fragmenteret eller forringet under dissektions-og isolations processerne. Det er også vigtigt at arbejde RNase-fri. Endelig kan valget af RT-kit påvirke følsomheden af den omvendte transskription proces. Selv om de ikke ofte drøftes i detaljer, påvirker alle disse punkter kvaliteten af IFM-prøven og de data, som er indhentet fra downstream-ansøgningerne.
Flere vigtige ændringer sætter protokollen ud over eksisterende ifm dissektion-protokoller. Selv om en detaljeret dissektion protokol for ifm immunofluorescenstest findes19, denne protokol præsenterer en anden tilgang til før dissektioner, der giver mulighed for hurtigere isolering af ifm væv. Dette gør det muligt at indsamle store mængder ifm-væv (relativt set) med begrænsede dissektions tider for at forhindre, at proteom eller transkriptomer ændres. Andre protokoller beskriver dissektion af voksen ifm til visualisering af gfp-farvning i individuelle myofibrils39 eller til farvning af larve legeme-vægmuskler58, men de løser ikke dissektion i før stadier eller isolering af RNA eller protein. Denne fremgangsmåde adskiller sig også fra den eksisterende protokol for microdissection af før IFMS fra cryosektioner38, som kan generere en renere ifm prøve, men er mere arbejdskraftintensiv og producerer mindre materiale. Sammenlignet med andre hurtige voksne ifm dissektion-protokoller38,39, er IFMS isoleret i PBS-buffer uden rengøringsmiddel for at begrænse stress induktion og andre større udtryks ændringer.
Det vigtigste frem trin i denne protokol er medtagelsen af en levende, fluorescerende reporter, tillader isolering af IFMS på tidlige før etaper. Vi bruger indføre Mef2-GAL459 kørsel enten UAS-CD8:: gfp eller UAS-gfp:: GMA60. Dette tillader differentiel mærkning af ifm (Flight muskler er mere stærkt mærket og forskelligt formet end andre før muskler) samt ydeevne af GAL4-UAS-baserede manipulationer, for eksempel redning eller RNAi eksperimenter. Det er også muligt at kombinere Mef2-GAL4 med tub-GAL80TS for at undgå RNAi-associeret tidlig dødelighed eller med UAS-Dcr2 for at øge RNAi Efficiency40.
Der er yderligere GAL4 drivere eller gfp-linjer til rådighed, der varierer i muskel-type specificitet, temporale udtryk mønster, og føreren styrke19,61 der kan anvendes i stedet for Mef2-GAL4. For eksempel, Act88F-GAL4 er først udtrykt omkring 24 h APF, så det kan ikke bruges til tidligere tidspunkter; Men, det kraftigt mærker IFM og kan være nyttigt at undgå RNAi-associeret tidlig dødelighed. Ham-gfp eller Act88F-GFP label ifm, igen med tidsmæssige begrænsninger, men de undgår GAL4 afhængighed af markør udtryk og kan være nyttige i kombination med en mutant baggrund af interesse. Lister over andre mulige markør linjer er tilgængelige19. Det skal også bemærkes, at brugen af transgener og GAL4/UAS systemet kan forårsage genekspression artefakter, så det er vigtigt at bruge passende Kontroller, for eksempel føreren linje krydset til Wild-type baggrunds stamme, således at sådanne artefakter er formentlig det samme i alle prøver.
Med den medfølgende video, denne detaljerede protokol har til formål at gøre før ifm dissektion mere tilgængelig og fremme brugen af omik tilgange til at studere muskel udvikling. Kobling af kraften i Drosophila genetik og cellebiologi med biokemi og omik assays tilgængelige gennem dissekeret ifm har potentiale til at fremme mekanistisk forståelse af myogenesis og muskelfunktion. Fremtidige undersøgelser, der forbinder system-niveau observationer af transkriptomer og proteom regulering til metaboliske og funktionelle udgange vil give en dybere forståelse af muskel-type specifik udvikling og patogenesen af muskellidelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Andreas Ladurner og Frank Schnorrer for generøs støtte. Vi takker Sandra esser for fremragende teknisk assistance og Akanksha Roy for at generere massespektrometri data. Vi anerkender Bloomington og Vienna Stock Centers for at levere fluer. Vi takker Core Facility bioimaging for hjælp med konfokale Imaging og zentrallabor für proteinanalytik til analyse af massespektrometriske prøver, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, de). Vores arbejde blev støttet af Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated protein Science Munich (CIPSM) på Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS), og den internationale Max Planck Research School (EN).
5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4×4 cm |
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip |
EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80mm |
Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
RNase A | Promega | A7937 | |
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |