Drosophila Flight Muscle är en kraftfull modell för att studera transkriptionell reglering, alternativa skarvning, metabolism och mechanobiologi. Vi presenterar ett protokoll för dissektion av fluorescerande-märkta flygning muskler från levande puppor att generera höganrikade prover idealisk för proteomik och djup-sekvensering. Dessa prover kan erbjuda viktiga mekanistiska insikter i olika aspekter av muskelutveckling.
Drosophila Flight Muscle är en kraftfull modell för att studera olika processer såsom transkriptionella reglering, alternativa skarvning, metabolism, och mechanobiology, som alla påverkar muskelutveckling och myofibrillogenes. Omics-data, till exempel de som genereras av masspektrometri eller djupsekvensering, kan ge viktiga mekanistiska insikter i dessa biologiska processer. För sådana metoder är det fördelaktigt att analysera vävnadsspecifika prover för att öka både selektivitet och specificitet hos omics fingeravtryck. Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av fluorescerande-märkta flygning muskler från levande puppor att generera höganrikade muskel prover för omics applikationer. Vi beskriver först hur man dissekera flygmuskler vid tidig Pupp stadier ( 48 h APF) eller vuxna, när musklerna är distinguishable under en dissekera Mikroskop. Det medföljande video protokollet kommer att göra dessa tekniskt krävande dissektioner mer lättillgängliga för forskarsamhällena i muskler och Drosophila . För RNA-tillämpningar, vi assay kvantitet och kvalitet av RNA som kan isoleras vid olika tidpunkter och med olika metoder. Vi visar vidare att Bruno1 (Bru1) är nödvändigt för en temporal förskjutning i myosin heavy chain (MHC) skarvning, visar att dissekerade muskler kan användas för mRNA-SEQ, masspektrometri, och omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) Program. Denna dissekeringsprotokoll kommer att bidra till att främja vävnads-specifika omics analyser och kan allmänt tillämpas för att studera flera biologiska aspekter av myogenes.
Moderna omics Technologies ger viktiga insikter i muskelutveckling och mekanismerna bakom mänskliga muskelsjukdomar. Till exempel har analys av transkriptomics data kombinerat med genetisk och biokemisk verifiering i djurmodeller visat att förlust av skarvning faktor RBM20 orsakar dilaterad kardiomyopati på grund av dess reglering av ett mål nätverk av mer än 30 sarcomere gener som tidigare förknippats med hjärtsjukdom, inklusive Titin1,2,3.
I ett andra exempel, studier från cellkultur, djurmodeller, och mänskliga patienter har visat att internationellt dystrofi orsakas av en störning i RNA-reglering på grund av kvarstad på muscleblind (MBNL) och uppreglering av CELF14,5. Den tvär reglerande och temporala dynamiken mellan MBNL och CELF1 (även kallad CUGBP1 eller Bruno-like 2) bidra till att förklara de ihållande embryonala skarvning mönster i internationellt dystrofi patienter. Dessutom bidrar det stora nätverket av felreglerade mål till att förklara sjukdomens komplexa natur4,6,7,8. En majoritet av sådana studier utnyttjar omics metoder i genetiska modellorganismer för att förstå mekanismerna bakom människans muskelsjukdom. Dessutom, de belyser vikten av att först förstå temporala och vävnads-typ specifika genuttryck, protein modifiering, och metabola mönster i friska muskler att förstå förändringar i sjuka eller åldrande muskler.
Drosophila melanogaster är en annan väletablerad genetisk modellorganism. Strukturen i sarcomere samt enskilda sarcomere komponenter är mycket bevaras från flugor till ryggradsdjur4,9,10, och indirekta flyg musklerna (ifms) har blivit en kraftfull modell för att studera flera aspekter av muskelutveckling11,12. Först, fibrillar flygmuskler är funktionellt och morfologiskt skiljer sig från tubulär kroppens muskler11,13, vilket möjliggör utredning av muskel-typ specifika utvecklingsmekanismer. Transkriptionsfaktorer inklusive spalt Major (Salm)14, extradenticle (EXD), och Homothorax (HTH)15 har identifierats som fibrillar öde regulatorer. Dessutom, nedströms i Salm, den CELF1 homolog Bruno1 (Bru1, aret) leder en fibrillar-specifika skarvning program16,17.
För det andra, ifms är en viktig modell för att förstå processen för myogenes själv, från myoblast fusion och myotube fastsättning till myofibrillogenes och sarcomere mognad9,18,19. För det tredje tillåter Drosophila Genetics utredning av bidrag från enskilda proteiner, protein domäner och proteinisoformer till sarcomere formation, funktion och biofysiska egenskaper20,21,22 ,23. Slutligen har IFM modeller utvecklats för studier av flera mänskliga muskelsjukdomar, såsom internationellt dystrofi, myofibrillar myopatier, muskel degenerativa sjukdomar, actinopatier, etc.24,25,26 ,27, och har gett viktiga insikter om sjukdomsmekanismer och potentiella terapier28,29,30. Således är Drosophila en användbar modell för att ta itu med många öppna frågor i myogenes fältet, inklusive mekanismer för muskel-typ specifik transkription, skarvning, och kromatin reglering, samt till den roll som metabolism i muskelutveckling. Tillämpningen av modern omics-teknik, i synnerhet i kombination med det breda utbudet av genetiska, biokemiska och cellbiologiska analyser som finns i Drosophila, har potential att dramatiskt främja förståelsen av muskel utveckling, åldrande och sjukdom.
Ifms är de största musklerna i farten, som spänner över nästan 1 mm över hela längden av bröstkorgen hos vuxna31,32. Men denna lilla storlek genererar utmaningen att få tillräckligt med prov för att tillämpa omics teknik i Drosophila i ett vävnads-typ specifikt sätt. Dessutom, ifms är en del av den vuxna muskulatur som bildas under Pupp stadier. Myoblasts säkring för att bilda myotubes, som fäster på senor runt 24 h efter puparium formation (APF) och genomgå en Kompaktion steg som krävs för att initiera myofibrillogenes runt 30 h APF (figur 1a-D)18,33, 34.
Den myofibers sedan växa för att spänna över hela längden av bröstkorgen, med myofibriller genomgår en initial tillväxtfas fokuserat på sarcomere tillägg fram till ca 48 h APF, och sedan övergår till en mogning fas, där sarkomeres växa i längd och bredd och är remodeled att etablera stretch-aktivering av 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Uppkomsten av fiber mognad är åtminstone delvis kontrolleras av Salm och E2F32,36,37, och flera IFM-specifika sarcomere protein isoformer vars skarvning styrs av Bru1 införlivas under denna fas16,17. Mogna flugor eclose från 90 – 100 h APF. Detta innebär att för att studera muskelutveckling, IFM måste isoleras med tillräcklig kvantitet, kvalitet och renhet från flera Pupp tidpunkter att underlätta analys med hjälp av omics metoder.
Flera protokoll för IFM dissektion har publicerats. Även om dessa protokoll fungerar bra för deras avsedda tillämpningar, är ingen idealisk för omics metoder. Protokoll som bevarar IFM morfologi för immunofluorescens av Pupp och vuxna ifms19, isolera IFM fibrer för mekanisk utvärdering31, eller utnyttja microdissection av Pupp IFM från kryosections38 är för specialiserade och tid och arbetsintensiva att rimligen få tillräckliga mängder av IFM vävnad för omics applikationer. Andra protokoll har utvecklats för snabb dissektion av specifikt vuxen IFM38,39, alltså inte är tillämpliga på Pupp stadier, och använda buffertar som inte är idealiska eller kan vara oförenliga med, till exempel, RNA-isolering. Därför finns det ett behov av att utveckla nya metoder för att isolera Pupp IFM för biokemi eller omics applikationer.
Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av IFM under Pupp stadier som har använts framgångsrikt för mRNA-SEQ analys från 16 h APF genom vuxna stadier16,32. Protokollet sysselsätter en grön fluorescerande protein (GFP) etikett för att identifiera ifms i alla stadier av Pupp och vuxen utveckling, vilket möjliggör levande dissektion under en fluorescerande dissekera Mikroskop. Metoden är mindre arbetsintensiva, med ett högre dataflöde än befintliga IFM dissektion-protokoll. Detta möjliggör snabb isolering och kryopreservation av prover, genererar tillräckligt med material efter flera omgångar av dissektion för omics metoder samt för standard omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) eller Western blotting.
Vi presenterar protokollet i två delar, visar hur man snabbt dissekera ifms både före 48 h APF (under tidig metamorfos, när IFM bilagor är mer tenuous) och efter 48 h APF (när Pupp Body plan och IFM bilagor är väldefinierade). Vi visar att vi kan isolera högkvalitativa RNA från dissekerade IFMs vid alla tidpunkter och presentera data om olika metoder för att RNA-isolering och omvänd Transkription. Slutligen demonstrerar vi tillämpningen av dissekeringsprotokollet till mRNA-SEQ, masspektrometri och RT-PCR med hjälp av CELF1 homolog Bruno1 som exempel. Vi visar misexpression av sarcomere protein isoformer i proteomik data från Bruno1 Mutant IFM och undersöka Bruno1 reglering av C-terminalen splice händelse av myosin tung kedja (MHC). Dessa resultat illustrerar hur omics data kan ge en djupare förståelse för biologiska fenomen, som komplement till genetiska och biokemiska experiment.
I detta protokoll presenterar vi den grundläggande tekniken för att dissekera Drosophila ifms från tidiga och sena stadier av puppor för nedströms isolering av protein, DNA, RNA eller andra makromolekyler. Protokollet kan enkelt anpassas för att dissekera IFM från vuxna flugor. Vi visar nyttan med vårt dissekeringsprotokoll för mRNA-SEQ, proteomik och RT-PCR-program. Med kontinuerlig förbättring av omics-teknik för att möjliggöra analys av prover med mindre utgångsmaterial och lägre ingångs koncentrationer kommer dessa dissektioner sannolikt att bli värdefulla för många ytterligare tillämpningar. Som ifms är en etablerad modell för mänskliga myopatier4,24 och muskel-typ specifik utveckling9,12, vi föreställa, till exempel, IFM-berikad metabolomics, undersökningar av kromatin konformation via 3C eller 4C, skarvning nätverks utvärdering via CLiP interaktioner eller Phospho-proteomik av myofibrillogenes.
Det är viktigt att tänka på att dessa dissektioner producerar ett prov berikat för IFM i stället för ett rent IFM-prov. Detta är oundvikligt på grund av motoriska neuron innervation, senor bilagor och luftrör invasion av muskelfibrer. Bioinformatik analys kan användas för att identifiera IFM berikade gener eller proteiner, men ytterligare experiment krävs för att visa att de är i själva verket IFM-specifika. Prov renhet kan analyseras med hjälp av publicerade vävnadsspecifika markörer som stripe45 (senan), Act79B4,44 (tubulär muskel), Act88F15 (IFM) eller SYB46 (neuronala specifika). Det kan vara möjligt att använda sådana markörer för att normalisera datauppsättningar till IFM-specifikt innehåll, men användarna varnas för att temporala förändringar i uttrycket av gener som används för normalisering, till exempel av IFM-specifika gener eller tubulin, kan bias ett sådant tillvägagångssätt.
Genetiskt kodade vävnadsspecifika märkningsmetoder, till exempel EC-märkning47,48 eller pabp-märkning49,50 för att isolera RNA har utvecklats under de senaste åren, vilket kan bidra till att få en verkligt vävnadspecifikt RNA-prov. Men EG-märkning kräver konstant utfodring av flugor47 och därmed är inte tillämplig under Pupp stadier. Känsligheten och fullständigheten hos PABP-märkta transkriptomer kan ha begränsningar51. FACS metoder för att isolera enskilda muskelfibrer kompliceras av den stora storleken och syncytial natur av IFMs. Intakt52,53 stil metoder kan tillämpas för att isolera specifika subcellulära-avdelningar från ifms, vilket kan visa sig användbart för att isolera rena populationer av IFM kärnor eller mitokonen. Manuella dissektioner är fortfarande den nuvarande standarden för att få intakt IFM vävnad för de flesta nedströms applikationer.
Prov kvaliteten beror på flera kritiska steg i dissekeringsprocessen. Dissektioner är tekniskt krävande, med dissektionshastighet och prov renhet ökar med erfarenhet. Dissekera för korta tidsperioder (20 – 30 min) i kyld buffert utan rengöringsmedel och omedelbart frysning hjälper till att bevara prov integriteten, som har observerats tidigare för mus senan isolering54. IFMs kan framgångsrikt frysas efter avlägsnande av alla buffert från pelleten, men specifikt för RNA isolering, frysning prover i isolering buffert tenderar att ge bättre resultat. Ifms från upp till 20 separata dissektioner kombineras före RNA eller protein isolering, vilket gör att skala upp och samla tillräckligt med material, även från tidiga tidpunkter eller mutanter16,32, för nedströms analys.
För RNA-tillämpningar kan det mest kritiska steget vara isoleringen av RNA självt. Guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform isolering (metod 1 ovan) överträffar de flesta kommersiella kit testade och, som tidigare nämnts, är betydligt billigare55. Variationen som observerades i RNA-isolationsavkastningar med kommersiella Kits är i samförstånd med tidigare observationer56,57. Vi lägger ytterligare glykogen under isopropanol nederbörd att hjälpa till att återvinna alla RNA. Bortom RNA avkastning, är det viktigt att kontrollera RNA integritet för att säkerställa att provet inte har fragmenterats eller försämrats under dissektion och isolerings processer. Det är också viktigt att arbeta RNase-fri. Slutligen kan valet av RT-kit påverka känsligheten för omvänd Transkription processen. Även om de inte ofta diskuteras i detalj, påverkar alla dessa punkter kvaliteten på IFM-provet och de data som erhålls från nedströmsprogram.
Flera viktiga ändringar ställer in protokollet bortsett från befintliga IFM dissekeringsprotokoll. Även om en detaljerad dissekeringsprotokoll för IFM immunofluorescens finns19, presenterar detta protokoll en annan metod för Pupp dissektioner som möjliggör en snabbare isolering av IFM vävnad. Detta möjliggör insamling av stora mängder IFM vävnad (relativt sett) med begränsad dissekera gånger för att förhindra proteomet eller transkriptome förändringar. Andra protokoll beskriver dissektion av vuxna IFM för att visualisera GFP färgning i enskilda myofibriller39 eller för färgning av larv Body-Wall muskler58, men de inte adress dissektion vid Pupp stadier eller för isolering av RNA eller protein. Denna metod skiljer sig också från det befintliga protokollet för microdissektion av Pupp ifms från kryosections38, som kan generera en renare IFM prov men är mer arbetsintensiva och producerar mindre material. Jämfört med andra Rapid Adult IFM dissektion protokoll38,39, ifms isoleras i PBS buffert utan rengöringsmedel för att begränsa stress induktion och andra stora förändringar uttryck.
Den viktigaste förskott i detta protokoll är införandet av en levande, fluorescerande reporter, vilket gör isolering av ifms vid tidiga Pupp stadier. Vi använder standardmässigt Mef2-GAL459 köra antingen UAS-CD8:: GFP eller UAS-GFP:: GMA60. Detta möjliggör differentiell märkning av IFM (flygmuskler är starkare märkta och annorlunda formade än andra Pupp muskler) samt prestanda GAL4-UAS-baserade manipulationer, till exempel Rescue eller RNAi experiment. Det är också möjligt att kombinera Mef2-GAL4 med tub-GAL80TS för att undvika RNAi-associerad tidig dödlighet eller med UAS-Dcr2 för att öka RNAi Efficiency40.
Det finns ytterligare GAL4 drivrutiner eller GFP-linjer tillgängliga som varierar i muskel-typ specificitet, temporal uttryck mönster och föraren styrka19,61 som kan användas i stället för Mef2-GAL4. Till exempel, Act88F-GAL4 uttrycks först runt 24 h APF, så det kan inte användas för tidigare tidpunkter; Det är dock starkt etiketter IFM och kan vara användbart för att undvika RNAi-associerad tidig dödlighet. Honom-GFP eller Act88F-GFP Label IFM, återigen med temporala restriktioner, men de undviker GAL4 beroende av markör uttryck och kan vara användbara i kombination med en mutant bakgrund av intresse. Listor över andra möjliga markör linjer finns tillgängliga19. Det bör också noteras att användning av transgener och GAL4/UAS systemet kan orsaka gener Expression artefakter, så det är viktigt att använda lämpliga kontroller, till exempel föraren linje korsas till Wild-typ bakgrund stam, så att sådana artefakter är förmodligen samma i alla prover.
Med den medföljande videon syftar detta detaljerade protokoll till att göra Pupp IFM dissektion mer tillgänglig och främja användningen av omics metoder för att studera muskelutveckling. Koppling kraften i Drosophila genetik och cellbiologi med biokemi och omics analyser tillgängliga genom DISSEKERADE IFM har potential att avancera mekanistisk förståelse av myogenes och muskelfunktion. Framtidsstudier länka system-nivå observationer av transkriptome och proteomet reglering till metaboliska och funktionella utgångar kommer att ge en djupare förståelse av muskel-typ specifik utveckling och patogenesen av muskelsjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Andreas Ladurner och Frank Schnorrer för generöst stöd. Vi tackar Sandra Esser för utmärkt teknisk assistans och Akanksha Roy för att generera masspektrometri data. Vi erkänner Bloomington och Wien lager centra för att tillhandahålla flugor. Vi tackar Core facility bioimaging för hjälp med konfokalmikroskopi Imaging och zentrallabor für proteinanalytik för analys av masspektrometriprover, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, de). Vårt arbete stöddes av Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), centrum för Integrated protein Science Munich (CIPSM) vid Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) och International Max Planck-Forskningsskolan (EN).
5x High Fidelity (HF) buffer | Thermo Fisher | F518L | |
60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
black dissecting dish (glass) | Augusta Laborbedarf | 42021010 | Lymphbecken, black glass, 4×4 cm |
black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder | Sigma-Aldrich | C9157 | Also available from most pharmacies |
black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes). |
blue pestle | Sigma-Aldrich | Z359947-100EA | Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder |
cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
chloroform | PanReac AppliChem | A3691,0500 | |
confocal microscope, Leica SP8X upright confocal | Leica | www.leica-microsystems.com | |
confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal | Zeiss | www.zeiss.com | |
double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 x 0.02 mm tip |
EtOH (100%, RNase free) | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’. |
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
microtome blades | PFM Medical | 207500003 | C35 feather 80mm |
Monarch DNase I | New England Biolabs | T2004-21 | |
Monarch DNase I Reaction Buffer | New England Biolabs | T2005-21 | |
normal goat serum | Thermo Fisher | 16210072 | |
OneTaq Polymerase | New England Biolabs | M0480X | |
Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Fisher | F-530XL | |
Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
Preomics iST 8x Kit | Preomics | P.O.00001 | peptide preparation kit for mass spectrometry |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | 725500 | mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center |
Qubit RNA Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen, Molecular Probes | 10063052 | |
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
RNA Pico Chips | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
RNase A | Promega | A7937 | |
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
slide mounting buffer, Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | containing DAPI |
statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |