En skiktad monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela Zebrafish embryon
Summary
Denna artikel beskriver en metod för att montera bräckliga zebrafiskar embryon för utökad tid-lapse konfokal mikroskopi. Denna lågkostnads metod är lätt att utföra med hjälp av vanliga glasbotten mikroskopi rätter för avbildning på någon inverterad Mikroskop. Monteringen utförs i lager av aganat vid olika koncentrationer.
Abstract
Dynamiken i utvecklingen kan följas av konfokaltidsförlopp mikroskopi av levande transgena zebrafiskar embryon uttrycker fluorescens i specifika vävnader eller celler. En svårighet med avbildning hela embryots utveckling är att zebrafiskar embryon växer avsevärt i längd. När den monteras som regelbundet görs i 0,3-1% låg smält aguppstod, aguppstod innebär tillväxt begränsning, vilket leder till snedvridningar i den mjuka embryot kroppen. Ändå, för att utföra konfokaltid-lapse mikroskopi, måste embryot immobiliseras. Denna artikel beskriver en skiktad monteringsmetod för zebrafiskar embryon som begränsar motilitet av embryon samtidigt som det möjliggör obegränsad tillväxt. Monteringen utförs i lager av aganat vid olika koncentrationer. För att demonstrera användbarheten av denna metod, hela embryo vaskulär, neuronala och muskelutveckling var avbildas i transgena fisk för 55 timmar i följd. Denna monteringsmetod kan användas för enkel, låg kostnad avbildning av hela zebrafiskar embryon med inverterade Mikroskop utan krav på formar eller särskild utrustning.
Introduction
Sebrafisken har länge varit en modellorganism för utvecklingsbiologi, och mikroskopi är den viktigaste metoden för att visualisera embryonal utveckling. Fördelarna med att använda zebrafiskar embryon för utvecklingsstudier inkluderar liten storlek, optisk klarhet, snabb utveckling, och hög Fecundity av den vuxna fisken. Generering av transgena zebrafiskar linjer uttrycker fluorescens i vissa vävnader eller celler har tillåtit en direkt visualisering av vävnads utveckling på ett sätt som inte är möjligt med större ryggradsdjur. I kombination med tidsfördröjd mikroskopi kan detaljer och dynamik i vävnads utvecklingen lätt studeras.
En svårighet med Imaging zebrafiskar utveckling är att embryona växer avsevärt i längd; embryot förlänger sin längd fyra gånger inom de första 3 dagarna i livet1. Också, kroppen av det tidiga embryot är mjuk, och lätt blir förvrängd om tillväxten är begränsad. Men för att utföra konfokalmikroskopi måste embryot immobiliseras. För att hålla embryon i en fast position för konfokaltid-lapse Imaging, de är regelbundet sövda och monteras i 0,3-1% låg smälta Agreste. Detta har fördelen av att tillåta viss tillväxt under bildtagning under en viss tidsperiod, samtidigt som man begränsar embryots rörelser. Delar av embryot kan effektivt avbildas så här. Vid användning av denna metod för avbildning av hela embryot under längre tidsperioder observeras dock snedvridningar på grund av den begränsade tillväxt som orsakats av aganden. Därför krävs andra monteringsmetoder. Kaufmann och kollegor har beskrivit en alternativ montering av zebrafiskar embryon för ljusplåt mikroskopi, såsom selektiv plan belysning mikroskopi (spim), genom att montera embryon i fluorerade etylenpropylen (FEP) rör som innehåller låga koncentrationer av aguppstod eller metylcellulosa2. Denna teknik ger en superb visualisering av embryogenes över tid. Schmid et al. beskriva montering av upp till sex embryon i aguppstod i FEB rör för ljus-Sheet mikroskopi3 tillhandahålla visualisering av flera embryon i en avbildning session. Formar har använts för att skapa embryomatriser för effektiv montering av ett större antal embryon4. Masselkink et al. har konstruerat 3D tryckt plast formar som kan användas för att göra kisel kastar att zebrafiskar embryon i olika stadier kan placeras i, vilket möjliggör montering i en konstant position för avbildning, inklusive konfokalmikroskopi Imaging5. 3D-utskrifter har också använts för att göra formar för konsekvent positionering av zebrafiskar embryon i 96-väl format6. Vissa formar är anpassade för vissa stadier och kan inte tillåta obegränsad tillväxt under långa tidsperioder, medan andra formar är mer flexibla. Nyligen publicerade weijts et al. design och tillverkning av en fyra-väl skålen för levande avbildning av zebrafiskar embryon7. I denna maträtt, är svansen och stammen av sövda fisk embryon placeras manuellt under en klar silikon tak bifogas strax ovanför ett täckglas för att bilda en ficka. Embryot är sedan fast i detta läge genom tillsats av 0,4% Agreste. Denna montering möjliggör avbildning av den ca 2 mm långa bakre delen (bål och svans) av embryot, och upp till 12 embryon kan monteras per brunn, metoden möjliggör avbildning av flera prover. Likaså presenterade Hirsinger och Steventon nyligen en metod där huvudet av fisken är monterad i aguppstod, medan svansen kan fritt växa, och denna metod också effektivt underlättar avbildning av stammen och svans regionen av embryot8.
Denna artikel beskriver en skiktad monteringsmetod för zebrafiskar embryon som begränsar förflyttningar av embryon samtidigt som den möjliggör obegränsad tillväxt. Fördelarna med denna monteringsmetod är att det är en låg kostnad, snabb och enkel metod för att montera embryon i olika stadier för avbildning med hjälp av inverterade Mikroskop. Monteringen tillåter långsiktig avbildning av hela kroppen (huvud, bål och svans) under embryots utveckling. För att Visa användbarheten av denna metod, hela embryo vaskulär, neuronala och muskelutveckling var avbildas i transgena fisk. Två embryon per session, vid två våglängder i 3D var avbildas av Time-lapse mikroskopi för 55 timmar i sträck för att återge filmer av vävnad utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs en monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela zebrafiskar embryon. Det mest kritiska steget för monteringsmetoden är att identifiera den optimala koncentrationen av aguppstod som kommer att möjliggöra obegränsad zebrafiskar embryotillväxt, och samtidigt hålla embryona i en helt fast position för konfokal avbildning. Eftersom den optimala koncentrationen av aguppstod är mycket smal, är detta värde mycket känsligt för fel i mätningen av vikten av Agreste och volyme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Albert Pan och Arndt Sieakmann för gåvor av transgena fiskar. Vi tackar Koichi Kawakami vid National Institute of Genetics, det nationella Bioresource projektet från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan för gåvan av den transgena zebrafiskar HGn39b. Vi tackar också Fatima Merchant och Kathleen Gajewski för hjälp med konfokalmikroskopi, och Tracey Theriault för fotografier.
Detta arbete stöddes av bidrag från nationella institutet för miljö hälsovetenskaper vid National Institutes of Health (bidrags nummer P30ES023512 och kontraktsnummer HHSN273201500010C). SU stöddes av ett stipendium från Keck Computational cancer biologi program (Gulf Coast konsortia CPRIT Grant RP140113) och av Hugh Roy och Lillie donationsfond. J-Å G stöddes av Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
