Summary
Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.
Abstract
La dinámica de desarrollo puede ser seguida por una microscopía confocal de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos vivos que expresan fluorescencia en tejidos o células específicos. Una dificultad con el desarrollo de embriones enteros es que los embriones de pez cebra crecen sustancialmente en longitud. Cuando se monta como se hace regularmente en 0.3-1% baja agarosa de fusión, la agarosa impone restricción de crecimiento, dando lugar a distorsiones en el cuerpo del embrión blando. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal de lapso de tiempo, el embrión debe ser inmovilizado. Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen la motilidad de los embriones mientras permiten el crecimiento sin restricciones. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones. Para demostrar la usabilidad de este método, el desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros se realizó en peces transgénicos durante 55 horas consecutivas. Este método de montaje se puede utilizar para obtener imágenes fáciles y de bajo costo de embriones enteros de peces cebra utilizando microscopios invertidos sin necesidad de moldes o equipos especiales.
Introduction
El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la biología del desarrollo, y la microscopía es el principal método para visualizar el desarrollo embrionario. Las ventajas de utilizar embriones de pez cebra para estudios de desarrollo incluyen pequeño tamaño, claridad óptica, desarrollo rápido y alta fecundidad de los peces adultos. La generación de líneas transgénicas de peces cebra que expresan fluorescencia en ciertos tejidos o células han permitido una visualización directa del desarrollo de tejidos de maneras no posibles con animales vertebrados más grandes. En combinación con la microscopía de lapso de tiempo, los detalles y la dinámica del desarrollo del tejido se pueden estudiar fácilmente.
Una dificultad con el desarrollo de peces cebra por imágenes es que los embriones crecen sustancialmente en longitud; el embrión extiende su longitud cuatro veces dentro de los primeros 3 días de vida1. Además, el cuerpo del embrión temprano es suave, y fácilmente se distorsiona si el crecimiento está restringido. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal, el embrión debe estar inmovilizado. Para mantener los embriones en una posición fija para la toma de imágenes confocales de lapso de tiempo, se anestesian regularmente y se montan en agarosa de fusión baja del 0,3-1%. Esto tiene la ventaja de permitir cierto crecimiento durante la toma de imágenes durante un cierto período de tiempo, mientras que restringe los movimientos del embrión. Partes del embrión se pueden imaginar eficientemente así. Sin embargo, cuando se utiliza este método para la toma de imágenes de todo el embrión durante períodos de tiempo prolongados, se observan distorsiones debido al crecimiento restringido causado por la agarosa. Por lo tanto, se requieren otros métodos de montaje. Kaufmann y sus colegas han descrito un montaje alternativo de embriones de pez cebra para la microscopía de láminas ligeras, como la microscopía de iluminación selectiva de plano (SPIM), montando los embriones en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) que contienen bajas concentraciones de agarosa o metilcelulosa2. Esta técnica produce una excelente visualización de la embriogénesis a lo largo del tiempo. Schmid et al. describen el montaje de hasta seis embriones en agarosa en tubos FEB para la microscopía de hoja de luz3 proporcionando visualización de varios embriones en una sesión de imágenes. Se han utilizado moldes para crear matrices de embriones para un montaje eficiente de un mayor número de embriones4. Masselkink et al. han construido moldes de plástico impresos en 3D que se pueden utilizar para hacer moldes de silicio en los que se pueden colocar embriones de pez cebra en diferentes etapas, lo que permite el montaje en una posición constante para la toma de imágenes, incluida la imagen confocal5. La impresión 3D también se ha utilizado para hacer moldes para el posicionamiento consistente de embriones de pez cebra en formato de 96 pozos6. Algunos moldes se personalizan para ciertas etapas y pueden no permitir un crecimiento sin restricciones durante largos períodos de tiempo, mientras que otros moldes son más flexibles. Recientemente, Weijts et al. publicaron el diseño y la fabricación de un plato de cuatro pozos para la toma de imágenes en vivo de embriones de pez cebra7. En este plato, la cola y el tronco de los embriones de pescado anestesiados se colocan manualmente bajo un techo de silicona transparente unido justo encima de un cristal de cubierta para formar un bolsillo. El embrión se fija entonces en esta posición mediante la adición de 0,4% de agarosa. Este montaje permite la toma de imágenes de la parte posterior de unos 2 mm de largo (tronco y cola) del embrión, y como se pueden montar hasta 12 embriones por pozo, el método permite la toma de imágenes de múltiples muestras. Del mismo modo, Hirsinger y Steventon presentaron recientemente un método donde la cabeza del pez está montada en agarose, mientras que la cola puede crecer libremente, y este método también facilita eficientemente la toma de imágenes del tronco y la región de la cola del embrión8.
Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen los movimientos de los embriones mientras permiten un crecimiento sin restricciones. Las ventajas de este método de montaje son que es un método de bajo costo, rápido y fácil para montar embriones de varias etapas para la toma de imágenes utilizando cualquier microscopio invertido. El montaje permite imágenes a largo plazo de todo el cuerpo (cabeza, tronco y cola) durante el desarrollo embrionario. Para mostrar la usabilidad de este método, se realizó la imagen del desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros en peces transgénicos. Dos embriones por sesión, a dos longitudes de onda en 3D fueron representados por microscopía de lapso de tiempo durante 55 horas consecutivas para representar películas de desarrollo de tejido.
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Protocol
El trabajo animal presentado aquí fue aprobado por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUCs) de la Universidad de Houston y la Universidad de Indiana.
1. Cría de pescado
NOTA: El trabajo con modelos de vertebrados requiere un protocolo aprobado por la IACUC. Debe llevarse a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes.
- Mantener el pez cebra adulto como se describe en la literatura publicada anteriormente9.
- Por la tarde, coloque el pez cebra adulto en tanques de cría. Criar machos a hembras en una proporción de 1:2.
2. Preparación de soluciones
- Hacer una solución en stock de agarosa baja de fusión 1% en medios embrionarios (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, ajustado a pH 7.0). Alísgue la solución en stock en tubos de 1,5 ml y guárdelos a 4 oC.
- Hacer una solución en stock de 4% (p/v) tricaína (MS-222) en agua destilada. Conservar a 4oC en una botella oscura.
ADVERTENCIA: La tricaína es tóxica y debe pesarse y disolverse en una campana de humos. - Hacer una solución de stock de 20 mM N-feniltionea (PTU) en agua destilada. Conservar a -20oC.
3. Preparación de embriones
- Después del apareamiento, cosechar embriones en E3 en una placa de Petri e incubarlos a 26,5 oC durante unos 28 h antes del montaje.
NOTA: Esto ralentiza el desarrollo de los embriones de modo que los embriones estén aproximadamente en 30 etapas de somita al comienzo de la toma de imágenes. - Anestetizar embriones en 0.016-0.020% Tricaína en E3. Para inhibir la pigmentación, añada la PTU a una concentración de 200 m.
- Decotermir los embriones usando fórceps bajo un microscopio de disección. Usando dos fórceps, agarre y tire suavemente del coro para liberar el embrión.
4. Montaje en agarosa
NOTA: El método de montaje desarrollado requiere dos concentraciones diferentes de agarosa de baja fusión en E3 con 0.02% Tricaína y PTU según sea necesario. La primera solución de agarosa contiene una concentración óptima de agarosa en la que la distorsión y la motilidad son mínimas. La optimización se describe en el paso 5 a continuación.
- Calentar las soluciones de agarosa para las dos capas (concentración definida en el paso 5 a continuación y 1%) a 65 oC. Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 30 oC justo antes del montaje para que el embrión no se dañe por el calor. Para el montaje, utilice platos inferiores de vidrio de 35 mm con un fondo de vidrio de cubierta No. 0. El vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato crea un pozo de 10 mm poco profundo (aprox. 1,2 mm de profundidad), en el que se va a colocar el embrión.
NOTA: En este caso, la concentración con la menor motilidad y distorsiones estaba entre 0.025 a 0.040% agarosa. - Coloque suavemente un embrión desconfiónizado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato utilizando una pipeta de vidrio o una micropipette. Si utiliza un micropipeta, corte la parte externa de la punta para aumentar el tamaño de la abertura para que se ajuste al embrión(Figura 1A). Retire con cuidado cualquier E3 restante con un micropipeta.
- Añadir la primera solución de agarosa al pequeño pozo creado por el vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión (Capa 1)(Figura 1B). Asegúrese de que la agarosa cubra el pozo pequeño, pero no lo desbordará.
- Cubra el pozo pequeño con un vidrio de cubierta (22 mm x 22 mm)(Figura 1C)para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre los dos vasos de cubierta.
- Coloque una capa de solución de agarosa al 1% en la parte superior del cristal de la cubierta por toda la parte inferior del plato (Capa 2)(Figura 1D). A medida que esta capa se solidifica, mantiene el vidrio de la cubierta en su lugar.
- Llene la porción restante del plato con E3 que contiene 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado (Capa 3)(Figura 1E).
NOTA: En esta configuración, el vidrio de la cubierta y el 1% de agarosa protegen la capa inferior de diluirse.
5. Optimización de la solución de agarosa para la capa 1
- Para identificar la concentración óptima de agarosa para la Capa 1, utilice un enfoque de búsqueda de cuadrícula multiescala. Monte embriones en concentraciones crecientes de agarosa que van del 0,01% al 1% seguido de imágenes de lapso de tiempo de restricción del crecimiento embrionario y motilidad en el campo de visión. Identificar las concentraciones en las que tanto la distorsión como la motilidad son mínimas.
- Para optimizar aún más la concentración de agarosa, monte los embriones utilizando un rango más fino de concentraciones de agarosa (por ejemplo, entre 0,025 y 0,040% agarosa) dependiendo de la concentración que se encuentre mejor en el paso 5.1 (por ejemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
NOTA: En nuestro laboratorio, la concentración óptima de agarosa fue de alrededor del 0,03%.
6. Imágenes de lapso de tiempo
NOTA: Este método de montaje funciona para cualquier microscopio invertido con funcionalidad de lapso de tiempo para fluorescencia e imágenes de campo brillante.
- Realizar imágenes de lapso de tiempo para todo el embrión o partes del mismo durante un máximo de 55 horas. Para obtener imágenes de varios embriones, utilice un adaptador de etapa que sostenga varios platos con un embrión montado por plato. Gire los platos uno por uno para que los embriones se posicionen aproximadamente horizontalmente según lo determinado por el ojo. Para un crecimiento y desarrollo óptimo de embriones, utilice una etapa de microscopio con una incubadora establecida a 28,5 oC.
- Seleccione un objetivo de aumento bajo en el software del microscopio. Debajo de la pieza del ojo, localice y alinee finamente los embriones horizontalmente girando los platos utilizando la iluminación de campo brillante y registre sus ubicaciones en el software. Cree un nombre de archivo para el guardado automático de los datos.
NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de plan apo 4x 0.2 NA y la pestaña XY dentro de la ventana de adquisición de ND para registrar las ubicaciones de los embriones. Los datos se guardaron en formato .nd2. El objetivo fue seleccionado haciendo clic en sus iconos en la pestaña Ti Pad. - Establezca el tamaño del agujero, la velocidad de escaneado, el tamaño de la imagen y el zoom. A continuación, seleccione un objetivo de ampliación más alto para capturar las imágenes.
NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de na de 10 x 0,45 planos para la toma de imágenes de embriones enteros, y se utilizó un objetivo superfluor 20x 0,75 NA para la mayor magnificación de partes del embrión. El agujero se estableció en 1,2 UA (19,2 m para la lente 10x), la velocidad de escaneo se estableció para un tiempo de permanencia de píxeles de 2,4 s y el tamaño de la imagen se estableció en 1024 x 1024 píxeles con un zoom de escaneo de uno, dando un tamaño de píxel de 1,24 ám para la lente 10x y 0,62 m para la lente 20x. - Seleccione los canales para la fluorescencia que se va a tomar en la imagen. Ajuste los ajustes de captura de imagen de un canal a la vez. Para cada canal de fluorescencia ajustar la potencia del láser y el detector de alto voltaje, asegurándose de recoger el mejor rango dinámico posible evitando la saturación y limitando el fotoblanqueo.
NOTA: En este experimento, GFP se dio a la imagen del canal verde de 488, (láser de 488 nm y emisión entre 500 y 550 nm), y RFP con el canal rojo 561 (láser de 561 nm y emisión entre 570 y 600 nm), y la imagen de transmisión se recogió utilizando el láser de 561 nm y el detector de luz transmitida (canalTD). - Para tomar imágenes de todo el embrión con el objetivo 10x, idee varios campos de visión con superposición y coselos con el software del microscopio.
NOTA: Como los embriones crecerán sustancialmente en tamaño durante la toma de imágenes, asegúrese de que haya espacio en el campo de visión anterior y posterior al embrión. Utilice la pestaña Escanear imagen grande de la ventana de adquisición de ND y seleccione un patrón de 4 x 1 con una superposición del 10% para capturar cuatro campos de visión adyacentes. - Configure los ajustes para capturar las pilas Z utilizando el software del microscopio.
NOTA: Debido a que el embrión está montado cerca de la parte inferior de la placa de vidrio, su centro se alejará de la parte inferior a medida que crece. Utilice la pestaña Z de la ventana de adquisición ND y seleccione el rango relativo asimétrico. Con este método, el plano de enfoque actual se utiliza como plano de referencia y el resto de los planos se distribuyen asimétricamente por encima y por debajo para incluir todo el embrión dentro del volumen de la pila Z, con suficiente espacio para tener en cuenta el crecimiento de la muestra. En todos los experimentos, el intervalo se estableció en 11 m y el rango total en unos 45 planos. - Para mantener el enfoque de varios embriones durante las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice un enfoque automatizado. Si toma imágenes de varios embriones, ajuste los niveles de desplazamiento individuales para que cada embrión se centre en el plano de referencia.
NOTA: En este experimento, se utilizó un sistema de estabilización de enfoque basado en láser. - Configure los parámetros de lapso de tiempo en el software del microscopio y la imagen para una duración de 55 h a intervalos de aproximadamente 1 h. En cada ciclo, capture dos conjuntos de datos de embriones secuencialmente y guarde los datos automáticamente después de cada ciclo.
- Procese imágenes utilizando una versión en línea o fuera de línea del software del microscopio. Si se ha creado una imagen de más de un embrión, cree archivos independientes para cada embrión dividiendo el conjunto de datos en función de la ubicación de la imagen. Utilice proyecciones de intensidad máxima o una herramienta similar para convertir conjuntos de datos de tiempo 3D en conjuntos de datos de tiempo 2D. Cree archivos de película mediante la opción de menú Guardar como, seleccionando .avi como formato de archivo. Seleccione la opción Sin compresión con intervalos de 200 ms para una velocidad de reproducción de 5 fotogramas /s.
NOTA: El conjunto de datos original de dos embriones en este experimento se dividió utilizando la función De las ubicaciones divididas en el software (Archivo ? Importación/Exportación (Import/Export) Dividir multipuntos). Los datasets de tiempo 3D se convirtieron en conjuntos de datos de tiempo 2D mediante la función de proyección de intensidad máxima (Imagen ? Procesamiento ND Crear imagen de proyecciónde intensidad máxima en Z ).
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Representative Results
Desarrollo del método de montaje
El objetivo principal de este trabajo era desarrollar una técnica de montaje de bajo costo para la toma de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo de peces cebra durante largos períodos de tiempo. El método de montaje en capas fue desarrollado para permitir el crecimiento completo del frágil cuerpo embrionario de pez cebra, al tiempo que restringe sus movimientos. Si la concentración de agarosa de la capa 1 es demasiado alta, los embriones se distorsionarán y curvarán(Figura 2). Los embriones crecidos a 0,1% y 0,5% de agarosa tienen colas acortadas, aletas distorsionadas y cabezas curvas. Por el contrario, si la concentración de agarosa es demasiado baja, los embriones saldrán del campo de visión durante la microscopía de lapso de tiempo, a pesar de que están anestesiados, a medida que la cola en crecimiento sale del cuerpo del embrión y hace que se mueva. En nuestras manos, la concentración óptima de agarosa varió entre 0.028% y 0.034% agarose entre diferentes lotes de agarosa. El montaje por debajo del 0,025% de agarosa no proporcionó suficiente resistencia para que el embrión se quedara en el campo de visión.
Imágenes de lapso de tiempo extendido del desarrollo vascular, neuronal y muscular
Después de optimizar el método de montaje descrito anteriormente, las imágenes de microscopía confocal de lapso de tiempo se capturaron en un lapso de 55 h. Nos dimos imágenes de peces cebra transgénicos vivos expresando GFP o RFP en diferentes tejidos. Una ventaja de utilizar peces transgénicos con fluorescencia endógena para imágenes de lapso de tiempo es que las moléculas de fluorescencia, como GFP y RFP, se producen continuamente en el embrión vivo y, por lo tanto, no fotografian fácilmente la lejía. En primer lugar, se crearon la imagen de embriones de una cruz de Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b69210 y Ubi-zebrabow11. En estos embriones, RFP se expresa en todas las células del embrión, lo que permite la visualización de la estructura embrionaria general. GFP se expresa en las células endoteliales de la vasculatura. Los embriones transgénicos dobles se tomaron imágenes durante 55 horas desde aproximadamente 30 etapas de somita para visualizar el desarrollo vascular en la cabeza y el cuerpo(Figura 3 y Película Suplementaria S1) utilizando un objetivo de 10x con 0,45 NA. Dos embriones/sesión fueron imaginados con pilas z y time-lapse en un bucle de modo que después de tomar imágenes del primer embrión en dos longitudes de onda diferentes, el segundo fue posteriormente imaginado y luego el primero de nuevo. La Figura 3 muestra el brote del vaso intersegmental (ISV), el desarrollo de vasos subintestinales y vasculatura de la cabeza, y la condensación del plexo venocaudal junto con la extensión del tronco. Las imágenes de todo el embrión con la vasculatura muestran que el ISV brota entre las somitas y crece dorsalmente hasta el punto del tubo neural, donde los ISV toma un camino diferente y brota en una dirección hacia el siguiente límite de somite anterior.
A continuación, los embriones de una cruz de Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 y Ubi-zebrabow fueron imágenados durante 55 horas aproximadamente desde la etapa de 30 somite para visualizar el desarrollo de la neurona motorneuron(Figura 4 y Película Suplementaria S2). Tg(mnx:GFP) se había cruzado por primera vez a mitfab692/b692 (ambos del Centro Internacional de Recursos Zebrafish de la Universidad de Oregón, OR) para producir Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629. Los axons de neuronas motoras brotan del tubo neural ventral sobre las somitas hacia el lado ventral del embrión. A diferencia de los vasos intersegmentales que brotan entre las somitas, los axones brotan sobre el medio sobre las somitas formadas por un galón. El brote comienza hacia el extremo anterior del tubo neural, en un ángulo recto desde el tubo neural, y se extiende hacia atrás. Por la interfaz de somita/yema, la brotación cambia de dirección a la brotación anterior y posterior. Observe la inervación del corazón en desarrollo por los neuitas anteriores.
Además, se crearon embriones de una cruz de Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 (cruz de Tg(kdr:enl.memRFP y mitfab692/b692)y Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692. En los embriones anteriores, la fluorescencia vascular roja no era visible hasta 36 horas después de la fertilización (hpf), y por lo tanto comenzamos la toma de imágenes en un momento posterior a 2 dpf. Hemos imagendeado una parte del tronco, dorsalmente a la extensión del saco de yema, utilizando un aumento más alto (20x objetivo). Esta película muestra que los embriones yacen lo suficientemente quietos como para una buena calidad de imagen con un aumento más alto. Se siguió el co-desarrollo del brote dorsal de axones motorneuron en relación con la posición de los vasos intersegmentales(Figura 5 y Película Suplementaria S3). En estas películas, los detalles más finos de la brotación de axón ventral son visibles, así como el axón dorsal que brota del tubo neural hasta un punto donde los axónicos neuronales y los vasos intersegmentales co-migran. La condensación del plexo veno caudal también se muestra claramente. Tenga en cuenta que como un brote de neurita falta hacia el extremo posterior de la cola (en la posición de la12a neurita desde el lado derecho), la neurona posterior más cercana se extiende hacia la parte anterior del embrión para cubrir el área entre los neuritas 11 y 13.
Finalmente, se dio una imagen de la cruz de HGn39b12,13 y Ubi-zebrabow. HGn39b es una línea zTRAP con el inserto GFP en el activador de la proteína de choque térmico ATPase homolog 1 (AHA1) gen (http://kawakami.lab.nig.ac.jp/) y expresa GFP en los músculos de las somitas(Figura 6 y Película suplementaria S4). A medida que aumentan los números de somitas, las somitas también se extienden en longitud y anchura. Esta película también muestra muy bien el desarrollo del corazón en fluorescencia roja de la línea de peces Ubi-zebrabow.
Figura 1 : Descripción del método de montaje. (A) Añadir el embrión de pez cebra al pequeño pozo creado por el fondo de vidrio en el plato de 35 mm. (B) Añadir la capa de agarosa 1 al pequeño pozo para cubrir el embrión. (C) Coloque cuidadosamente un vaso de cubierta sobre el pozo pequeño. (D) Añadir la capa de agarosa 2 en toda la parte inferior de la placa de 35 mm. (E) Añadir E3 al plato. (F) Dibujo esquemático de una sección transversal de la configuración de montaje. (G) Imagen del microscopio (5x objetivo) del embrión de pez cebra en el montaje final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Restricción del crecimiento del embrión y retraso del desarrollo en diferentes concentraciones de agarosa. Los embriones se montaron en diferentes concentraciones de agarosa y su tamaño y desarrollo se imaginaron a 48 hpf. Imágenes capturadas por un microscopio equipado con una cámara digital en color (objetivo 2.5x) y el software del microscopio que lo acompaña. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización del desarrollo de la vasculatura. Cruz de Tg(kdr1: EGFP)mitfab692/b692 y Ubi-zebrabow imageed from about 30 somite stage for 55 h on a confocal microscope. Vasculatura en verde y todas las demás células en rojo. Barra de escala 500 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visualización del desarrollo de neuronas y brotación de neurita. Cruz de Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 y Ubi-zebrabow imageed from about 30 somite stage for 55 h on a confocal microscope. Motorneurones en verde, todas las demás células en rojo. Barra de escala 500 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Visualización del co-desarrollo de neuronas y vasculatura. Cruz de Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 y Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 imageed durante 55 horas desde aproximadamente 2 dpf en un microscopio confocal. Vasculatura en rojo, neuronas motoras en verde. Barra de escala 500 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Visualización de la expresión gFP muscular en somitas. Cruz de HGn39b y Ubi-zebrabow fueron imágenes en un microscopio confocal durante 55 h desde unaetapa de aproximadamente 30 somitas. Músculo en verde, todas las demás células en rojo. Barra de escala 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementaria S1: Película de un embrión de una cruz de Tg(kdr1:EGFP)mitfab692/b692 y Ubi-zebrabow imágenes de aproximadamente 30 etapas somite durante 55 h en un microscopio confocal utilizando un objetivo 10x. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película suplementaria S2: Película de un embrión de una cruz de Tg(mnx:GFP)mitfab692/b629 y Ubi-zebrabow imageed from about 30 somite stage for 55 h on a confocal microscope using a 10x objective. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película suplementaria S3: Película de un embrión de una cruz de Tg(kdr:enl.memRFP)mitfab692/b692 y Tg(mnx:GFP)mitfab692/b692 imagen de aproximadamente 2 dpf durante 55 h en un microscopio confocal utilizando un objetivo 20x. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película suplementaria S4: Película de un embrión de una cruz de HGn39b y Ubi-zebrabow imageed from about 30 somite stage for 55 h on a confocal microscope using a 10x objective. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí se describe un método de montaje para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de peces cebra. El paso más crítico para el método de montaje es identificar la concentración óptima de agarosa que permitirá el crecimiento sin restricciones del embrión del pez cebra, y al mismo tiempo mantener los embriones en una posición completamente fija para la toma de imágenes confocales. Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, este valor es muy sensible a los errores en la medición del peso de la agarosa y el volumen de E3 durante la preparación de la solución. La concentración óptima también puede depender de la temperatura y el estadio del embrión. Por lo tanto, la concentración óptima tendrá que ser redefinida para cada nuevo lote de solución de agarosa a través de la repetición de pruebas de diferentes concentraciones.
Otro paso crítico es en el método de montaje es la adición de la segunda capa de agarosa. La segunda capa mantiene el vidrio de la cubierta en su lugar. Debe añadirse cuidadosamente al plato un poco a la vez para que no haga que el vidrio de la cubierta se mueva. La segunda capa también sirve como una barrera permeable para E3. Sin E3, los embriones se secarán durante la toma de imágenes. Sin la segunda capa de agarosa, el vidrio de la cubierta y el embrión comenzarán a flotar.
Una limitación del método de montaje propuesto es que si bien funciona bien para microscopios invertidos, no funciona para microscopios verticales. Se hicieron varios intentos para realizar imágenes de lapso de tiempo utilizando un microscopio vertical, llenando el plato inferior de vidrio con E3, sellándolo con parafilm y poniéndolo patas arriba. Sin embargo, a menudo esto resultó en que el montaje se derrumbó a mitad de la imagen. Esto podría haber sido causado por el aumento del calor en la muestra después de la larga exposición a la luz láser, lo que hace que la capa de agarosa solidificada se derrita.
Al final de la microscopía de lapso de tiempo, los embriones comenzaron a mostrar edema pericárdico. Variando entre diferentes experimentos, se observó edema entre 35 y 50 horas de diagnóstico por imágenes. Actualmente se desconoce si esto fue causado por la inmovilización embrionaria, o un efecto de anestésicos. La triaína es conocida por suprimir la contracción de los músculos esqueléticos y cardíacos. En consecuencia, Tricaine afecta la frecuencia cardíaca en peces adultos14 y embriones15. Otros estudios también han informado de que el tratamiento de la tricaína causa edema pericárdico en embriones de pez cebra2,16. En este artículo, una concentración de tricaína (0.016-0.020%) se utilizó que se utiliza comúnmente en la investigación de peces cebra; aún así, el edema pericárdico se produjo al final de nuestro período de diagnóstico por imágenes. El edema pericárdico constituyó una restricción principal para permitir la toma de imágenes de los embriones durante períodos de tiempo aún más largos. Las posibles formas de disminuir esta toxicidad cardíaca están combinando dos anestésicos diferentes, como la tricaína con eugenol, o utilizando la inyección de ARNm de la bungarotoxina para los anestésicos16; los efectos beneficiosos de los compuestos anestelizantes combinatoriales o alternativos deben investigarse más a fondo para obtener imágenes prolongadas de lapso de tiempo en el desarrollo del pez cebra.
En conclusión, el método de montaje descrito es rápido, fácil, rentable y funciona en cualquier microscopio invertido. Se pueden utilizar platos regulares de fondo de vidrio y agarosa de baja fusión, y no se requieren moldes especiales, equipos o instrumentación. El método de montaje en capas permite el crecimiento de embriones y, al mismo tiempo, mantiene los embriones en una posición fija. Mediante el uso de imágenes de lapso de tiempo extendido de todo el organismo se puede obtener un nuevo conocimiento del desarrollo de tejidos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Albert Pan y Arndt Sieakmann por los regalos de pescado transgénico. Agradecemos a Koichi Kawakami en el Instituto Nacional de Genética, el Proyecto Nacional de Biorecursos del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón por el regalo del pez cebra transgénico HGn39b. También agradecemos a Fatima Merchant y Kathleen Gajewski por su ayuda en microscopía confocal, y a Tracey Theriault por fotografías.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Institutos Nacionales de Salud (número de subvención P30ES023512 y número de contrato HHSN273201500010C). SU fue apoyada por una beca del programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) y por Hugh Roy y Lillie Endowment Fund. La Fundación Robert A. Welch (E-0004) contó con el apoyo de j-o G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
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