Kontusion rygmarvsskader via en Mikrokirurgisk laminektomi i den regenerative Axolotl
Summary
Dette manuskript præsenterer protokoller for kirurgisk påføre kontrollerede stumme og skarpe rygmarvsskader til en regenerativ Axolotler (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Formålet med denne undersøgelse er at etablere en standardiseret og reproducerbar regenerativ stump rygmarvsskade model i Axolotler (Ambystoma mexicanum). De fleste kliniske rygmarvsskader forekommer som høje energi stumme traumer, inducerende kontusion skader. Men, de fleste undersøgelser i Axolotler rygmarven er blevet udført med skarpe traumer. Derfor har denne undersøgelse til formål at producere en mere klinisk relevant regenerativ model. På grund af deres imponerende evne til at regenerere næsten alle væv, kendt er almindeligt anvendt som modeller i regenerativ undersøgelser og har været anvendt i udstrakt grad i rygmarvsskade (sci) undersøgelser. I denne protokol, er kendt bedøvet ved nedsænkning i en benzocain opløsning. Under mikroskopet er et vinkel snit lavet bilateralt på et niveau, der kun er hale til bagbenene. Fra denne Incision, er det muligt at dissekere og udsætte de spinøse processer. Ved hjælp af pincet og saks udføres en to-niveau laminektomi, der udsætter rygmarven. En brugerdefineret traume anordning bestående af en faldende stang i en cylinder er konstrueret, og denne anordning bruges til at fremkalde en kontusion skade på rygmarven. Indsnit er derefter sutureres, og dyret genindvinder fra anæstesi. Den kirurgiske tilgang er en succes i at udsætte rygmarven. Traume mekanismen kan producere kontusion skader på rygmarven, som bekræftet af histologi, MRI, og neurologisk undersøgelse. Endelig, rygmarven regenererer fra skaden. Det kritiske trin i protokollen er at fjerne de spinale processer uden at påføre rygmarven skade. Dette trin kræver uddannelse for at sikre en sikker procedure. Desuden er sårlukning meget afhængig af ikke at påføre huden unødvendig skade under indsnit. Protokollen blev udført i en randomiseret undersøgelse af 12 dyr.
Introduction
Det overordnede mål med denne undersøgelse var at etablere en kontrolleret og reproducerbar mikrokirurgisk metode til at påføre sløv og skarp SCI til Axolotler (Ambystoma mexicanum), der producerede en regenerativ rygmarvsskade model.
Sci er en alvorlig tilstand, at afhængigt af niveau og omfang, påfører neurologiske handicap til ekstremiteterne sammen med nedsat blære og tarm kontrol1,2,3. De fleste sci er resultatet af høj energi stumme traumer såsom trafikulykker og falder4,5. Skarpe skader er meget sjældne. Derfor er den mest almindeligt forekommende makroskopiske skadetype kontusioner.
Den pattedyrs centralnervesystemet (CNS) er en ikke-regenerativ væv, derfor ingen restaurering af neurologiske væv efter sci ses6,7,8. På den anden side, nogle dyr har en spændende evne til at regenerere væv, herunder CNS-væv. Et af disse dyr er Axolotl. Det er meget udbredt i undersøgelser af regenerativ biologi og er af interesse i rygmarven regenerering, fordi det er et hvirveldyr9,10,11,12.
De fleste sci-studier i Axolotler udføres enten som amputation af hele halen eller ablation af en større del af rygmarven9,10,11,12. For nylig blev en ny undersøgelse offentliggjort på stump skader13 , der efterligner kliniske situationer bedre. Der henviser til, at komplet vedhæng-amputation i Axolotler resulterer i fuld regenerering, er nogle ikke-amputations baserede regenerativ fænomener afhængige af den kritiske størrelses defekt (CSD)14,15. Det betyder, at skader, der overskrider en kritisk tærskel, ikke regenereres. For at udvikle en regenerativ model med en højere klinisk translationel værdi undersøgte denne undersøgelse, om et 2 mm stump traume ville overskride CSD-grænsen.
Denne metode er relevant for forskere, der arbejder på rygmarven regenerering i små dyremodeller, især i Axolotl. Desuden kan det være af mere almen interesse, fordi det udviser en måde at bruge standard laboratorium udstyr til at udvikle en stump traume mekanisme, der er egnet til brug i små dyr i almindelighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordi risikoen for skader på rygmarven er signifikant, de kritiske trin i protokollen er at fjerne de spinale processer og udvidelse af knogle adgang til rygmarvskanalen, hvis det er nødvendigt. Som nævnt i protokollen, at fjerne den mest kranie proces først anbefales stærkt. Dette vil betyde, at jo mere hale processer beskytte rygmarven fra at blive ramt af saksen. Det anbefales at sikre tilstrækkelig kirurgisk adgang, hvilket betyder at ikke gøre for lille en primær incision. Også, når man griber noget med ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Aarhus Universitet for sin ekspertise og tid på at udvikle MRI-protokoller og oprette hele projektet. Peter Agger, Aarhus Universitet for sin ekspertise og tid på at udvikle MRI-protokollerne. Steffen Ringgard, Aarhus Universitet for sin ekspertise og tid på at udvikle MRI-protokollerne. Udviklingen af SCI-modellen i Axolotler blev venligt støttet af A.P. Møller Maersk Foundation, Riisfort Foundation, Linex Foundation og ELRO Foundation.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
