Summary
这份手稿提出了手术治疗方案，用于对再生轴虫（Ambystoma墨西哥）造成控制性钝和尖锐的脊髓损伤。
Abstract
本研究的目的是在axolotl（墨西哥阿姆比托马）中建立一个标准化和可重复的再生钝脊髓损伤模型。大多数临床脊髓损伤都发生高能量钝性创伤，导致挫伤。然而，大多数研究在轴线脊髓已经进行了尖锐的创伤。因此，本研究旨在产生一种更具有临床相关性的再生模型。由于其令人印象深刻的再生能力，几乎任何组织，轴球被广泛用作模型在再生研究，并已广泛用于脊髓损伤（SCI）研究。在此协议中，异体通过浸入苯甲酸溶液进行麻醉。在显微镜下，一个角切口是双边的，正好对后肢有一个切口。从这个切口，有可能解剖和暴露的旋转过程。使用钳子和剪刀，进行两级拉平切除术，暴露脊髓。构建了一个由圆柱体中落杆组成的定制创伤装置，该装置用于诱导脊髓的挫伤。切口然后缝合，动物从麻醉中恢复。手术方法成功地暴露了脊髓。创伤机制可以产生脊髓的挫伤，由动物学、MRI和神经学检查证实。最后，脊髓从损伤中再生。该协议的关键步骤是去除旋转过程，而不会对脊髓造成损伤。此步骤需要培训以确保安全的程序。此外，伤口封闭高度依赖于在切口期间不对皮肤造成不必要的损伤。该协议是在对12只动物的随机研究中进行的。
Introduction
本研究的总体目标是建立一种可控和可重复的显微外科方法，用于将钝和尖锐的SCI施加到axolotl（墨西哥的Ambystoma），从而产生一个再生脊髓损伤模型。
SCI是一个严重的条件，根据水平和程度，造成神经残疾的四肢以及受损的膀胱和肠道控制1，2，3。大多数SCI是高能量钝性创伤的结果，如交通事故和跌倒4，5。剧烈的损伤非常罕见。因此，最常见的宏观损伤类型是挫伤。
哺乳动物中枢神经系统（CNS）是一种非再生组织，因此在SCI之后神经组织没有恢复，另一方面，一些动物有一个有趣的能力，以再生组织，包括中枢神经系统组织。这些动物之一是弓形虫。它被广泛用于再生生物学的研究，并有兴趣在脊髓再生，因为它是脊椎动物9，10，11，12。
在轴线中，大多数SCI研究要么截肢整个尾巴，要么使脊髓的较大部分消融9，10，11，12。最近，一项新的研究发表在钝损伤13，模仿临床情况更好。虽然完全附属截肢在轴异体导致完全再生，一些非截肢为基础的再生现象依赖于临界尺寸缺陷（CSD）14，15。这意味着超过临界阈值的伤害不会再生。为了开发一种具有较高临床转化价值的再生模型，本研究调查了2毫米钝性创伤是否会超过CSD极限。
这种方法与研究小动物模型脊髓再生的研究人员相关，特别是在异种动物模型中。此外，它可能更普遍的利益，因为它展示了一种使用标准实验室设备来开发一种钝性创伤机制的方法，这种机制一般适用于小动物。
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Protocol
本研究遵循了关于动物伦理使用的所有适用的体制和政府条例。这项研究在批准ID下进行：2015-15-0201-0061由丹麦动物实验监察局进行。动物是墨西哥的斧头 （墨西哥阿姆比斯托马，平均身体质量 = STD： 12.12 g = 1.25 g）。
1. 准备
-
准备麻醉用的轴药。
- 使用高质量的非化学处理自来水。如果不可用，请使用 40% 霍尔特弗雷特的解决方案。
- 在3mL的丙酮中溶解200毫克乙基4-氨基苯甲酸酯（苯甲酸酯）。将溶液溶解在1升自来水或40%霍尔特弗雷特溶液中。
- 使用放置在立体显微镜下的标准培养皿（直径100毫米）作为手术台。在培养皿上放置一个手术纺织布。
注：使用培养皿作为手术区域，使动物在不接触的情况下移动和旋转，确保手术期间的脊柱稳定性。 - 准备所有无菌显微手术器械（即剪刀和解剖钳）。
2. 麻醉
- 将阿索洛特放入装有苯甲酸溶液的容器中约 45 分钟，以确保深度和稳定的麻醉。
注：苯甲酸的给定浓度会导致麻醉，在所有大小的阿索洛特。 - 检查30-45分钟内是否有一般麻醉的迹象。这些包括完全缺乏刺运动，正确的反射，或反应触觉或痛苦的刺激（温柔捏脚趾网）。
- 为了保持麻醉，用纸巾包裹动物，用麻醉液湿润。在手术过程中定期用这种溶液润湿这些，以确保皮肤和刺保持湿润。
- 手术后，将动物放入装有新鲜自来水的容器中，恢复动物。观察恢复的迹象，如刺运动和恢复正确的反射，在1小时16。
3. 显微外科拉米切除术
注：层切除术是在立体显微镜下进行的。
- 将动物放在培养皿的易发位置。用纸巾包起来，使尾巴露出来。
注：纸巾是优秀的，以确保整个程序的稳定性。 -
识别后肢。做第一个切口只是对他们。
- 用一把微剪刀，从龙骨上进行垂直切口，直到感觉到旋转过程的骨突出。
注：用钳子抓住龙骨和皮肤时要非常小心，因为这些很容易对娇嫩的皮肤造成伤害。 - 横向延伸切口，使切口穿过整个尾部宽度。
- 用钳子抓住旋转过程，以确保正确的深度。
- 将垂直切口在两侧的旋转工艺下方延伸 1 mm。
- 用一把微剪刀，从龙骨上进行垂直切口，直到感觉到旋转过程的骨突出。
-
将动物放在一侧，执行心室和水平切口，如下所述。
- 用一对微剪刀，从垂直切口的腹点开始，为动物做一个约15毫米的水平切口，重量为10-20克。使大动物的切口变长，对较小的动物缩短。
- 使用剪刀，通过水平切口进行内切解剖，直到在中线感觉到椎柱。
- 在动物的另一侧重复步骤 3.3、3.3.1 和 3.3.2。
-
从两侧在深中平面上解剖，通过中线解剖，从而连接两个水平切口。
- 将自由一块尾巴和龙骨移到一侧，露出旋转过程（图1）。
- 用湿纸巾固定尾片。
-
再次将动物置于易发位置，头部朝向外科医生的非主导侧。
- 用一对钳子，抓住旋转过程，只是对后肢的扭曲。轻轻抬起，然后朝动物头部提起。
- 将一对微剪刀的刀片水平放在加工过程中，轻轻切割。过程中的提升确保现在将其移除，露出脊髓。
- 抓住旋转的过程，只是对刚删除的过程进行重复，并重复步骤 3.5.1 和 3.5.2。
注：这应该留下一个暴露的脊髓对应于两个椎骨水平。进行层切除术时，经常出现白色泡沫分泌。脊髓很容易识别其独特的光泽，以及沿着中线运行的血管。 - 根据动物的大小，暴露区域可能不够宽。使用两对钳子，抓住脊髓两侧的层压，然后用温和的动作横向扭曲。
4. 引入结化型损伤 （图 2）
- 保持动物处于易发位置。
- 使用培养皿将动物转移到创伤室。
- 让助手在脊髓上用手电筒照射。
- 使用装置上的微调节器将挫伤创伤单元圆柱体置于外露脊髓上方。瞄准气缸。
- 降低气缸，直到与层压水平。
- 将下降杆连接到电磁铁上。将所需的下降高度调节油缸放在创伤单元上。
- 将下降杆放入气缸中。
注：对于一个失明的研究，外科医生现在应该离开房间，不知道动物是否会被分配到一个受伤或假手术组。 - 关闭电磁铁。杆落在暴露的脊髓上。
- 使用高度调节螺钉将杆从脊髓提起。
- 通过显微镜观察脊髓确认损伤。受伤部位将显得较暗，中线血管出血明显。
5. 介绍锐伤
注：在 3.5.4 之后执行这些步骤。
- 用一把微剪刀将脊髓切割成完美的垂直切口。
- 将切口 2 mm 重复到车身的牛侧。
注：可根据研究要求调整切除的脊髓的长度。然而，2毫米的切割将是可再创10。 - 确保切割已完成。完成后，感觉剪刀的刀片沿脊髓管的腹腔刮擦。
- 从脊髓管提起 2 毫米的脊髓。
6. 关闭手术伤口
- 把动物送回手术台。在失明的研究中，重新定位龙骨，使外科医生看不到脊髓。
-
保持动物处于易发位置。
- 开始放置10.0尼龙缝合线从水平切口的最缝合部分。把伤口合上一层。
注：不要抓住皮肤太紧，因为它会造成坏死。 - 朝切口的垂直部分努力。
- 达到角度时，转动培养皿并缝合另一个水平切口。
- 在垂直切口上设置缝合线。
- 不要将缝合线放在龙骨的上部，因为这里的皮肤无法保持。
- 开始放置10.0尼龙缝合线从水平切口的最缝合部分。把伤口合上一层。
7. 将动物送回无麻醉溶液
- 提起与动物的培养皿，将两者轻轻地浸入只有5厘米深的淡水中，让动物滑出。
注：浅水深度确保动物不会试图游到水面呼吸。 - 第一周不要换水。
- 喂食动物时，确保食物放在动物头部附近。
注：这些措施的目的是避免在第一周尽可能多地移动。
8. 术后超声
- 在麻醉终止之前，使用高频超声系统获取损伤图像，可用于构建 SCI 站点的三维图像。
- 将传感器连接到微操作器，最好由远程操纵杆控制。
- 将麻醉动物浸入易发位置，放入装满麻醉溶液的小容器中。
注：用微型沙袋或其他设备固定动物，以避免在扫描过程中移动。 - 将传感器的尖端与动物的长度轴对齐，并将其浸入苯甲酸溶液中，直到它仅比动物后肢后面的龙骨高出几毫米。
- 识别 SCI 站点。
注：由于 SCI 正上方缺少旋转过程，损伤部位很容易识别。 - 通过调整超声波设置优化图像。确保 SCI 站点位于图像的中心。调整视场（即图像深度、深度偏移和图像宽度），以覆盖 SCI 站点和相邻的健康组织。调整二维增益以优化图像对比度。
- 通过使用电子操作的微操作器扫描整个 SCI 站点的超声波传感器，获取覆盖 SCI 站点的 B 模式图像，该位置位于多个射手横截面切片位置，具有连续切片间隔50 μm.获取包含 500 帧的 cine 图像，帧速率为 +50 帧/秒，传感器频率为 40 MHz。
注：此设置需要由远程操纵杆（步骤 8.2）管理的电子微操作器。 - 完成扫描序列后返回步骤 7。
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Representative Results
该协议的目的是产生一个SCI，将瘫痪的电机和感觉功能对损伤。由于axolotl具有再生能力，它可以在几周内恢复功能，使研究人员能够在短时间内研究CNS再生。
麻醉为所有动物提供45分钟，没有经历早产的发作。所有动物在一小时内恢复，在接下来的星期十三、十六日，没有因麻醉而受损的迹象。
层切除术在所有动物身上都取得了成功。然而，脊柱运河宽度的解剖变化要求使用钳子扩大运河，并在一些个体中扭转。此外，一些个体的残余层压使落杆无法达到其目标，因此外科医生必须将磁场从残留的骨骼和突出位置中清除。
关闭切口与一些困难有关，特别是在研究的试验阶段。龙骨顶部的缝合不会保持，导致关闭不足。研究中一只动物的封闭没有保持，导致龙骨被撕裂，随后感染和死亡。这强调需要沿着整个切口小心缝合。
最初的机械损伤在手术过程中很明显。在模型开发过程中，受伤和假动物被沾染了血氧林和欧辛，以验证损伤。每个组的代表性结果如图3A1、A2和图3C1、C2所示。 再生通过九周后进行组织学部分准备（图3B1、B2和图3D1D2）得到确认，这表明SCI动物的脊髓连接已重新建立。
损伤和再生之后，可以检查神经功能。用轻触和钳子捏合刺激尾巴，将揭示触觉和感知感官功能是否丧失，并有可能重新建立。神经得分是根据动物的反应定义的：0分 =无反应，1点=局部尾部运动，2点=断腿运动，3分=四肢和/或头部与断头运动一起协调运动，4分=动物立即协调快速移动。在六只SCI动物和五只假动物中，发现在受伤后三周失去神经功能，并在九周内逐步恢复（图4和补充视频1）。
使用上述方案可以获取受伤脊髓的超声图像。由于明显缺乏骨质旋转过程，可以可视化 SCI 站点（图 5）。此外，使用B模式可以可视化未受伤的脊髓的背动脉，产生血管完整性的标志。
在动物重新觉醒后立即进行测试是可能的。然而，一些动物在刺激时表示局部的小振幅、重复和有节奏的尾巴运动，与人类SCI中观察到的克隆现象相当。这些运动可能代表克洛纳斯或缺乏中央反射抑制，并可能造成更多的损害，新受伤的脊髓。因此，在受伤后一周之前不建议对动物进行测试。
从对动物的简单定性观察来看，尾巴明显瘫痪，游泳受到明显抑制，使动物完全依赖移动四肢。这些观察结果也将验证协议的成功。
高场MRI扫描（9.4 T）在受伤后立即进行，以形象化体内的损伤（图6）。然而，与非操作动物相比，扫描信号噪声比通常较低，这可能是由于出血和血白辛。因此，结论是MRI是验证协议损伤和成功的一种次优方法。
图1：显微外科拉氏切除术的原理图。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：挫伤创伤机制的原理图。（A） 整个设置，显示动物上方的掉落杆。（B） 拆卸机构，显示杆如何与电磁体断开。（C） 坠落杆与电磁铁相连.安装下降高度调节油缸，并将电磁铁和杆装入气缸。整个系统的高度调整由调节轮控制。（D） 关闭电磁铁将导致杆掉落，操作员不接触系统。图最初由泰格森等人13号公布。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：组织学部分血氧林和欧辛立即染色，受伤后九周。（A1）SCI 动物受伤后立即。（B1）SCI动物在九个星期。（C1）受伤后立即进行深手术动物。（D1）九个星期的假动物。红色方块 – 标志着SCI动物的损伤，以及假动物的层切除术。图2A，图2B，图2C是这些区域的放大倍数，为5倍。蓝色箭头 = 未受伤的脊髓。这个数字最初是由泰格森等人13日公布的。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：触觉刺激反应图。与假群体相比，SCI组在三周后的反应较低。WPI = 受伤后的周，黑线 = SCI，灰色 = 假。深 n = 5，SCI n = 6。图最初由泰格森等人13号公布。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：超声图像，显示脊髓在下垂部分。黄线标记脊髓，黄色圆圈标记损伤部位，白色箭头标记椎骨。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：MRI扫描在损伤或假手术后的不同时间点。脊髓周围的CSF缺乏，特别是在SCI动物的三个WPI，表明脊髓肿胀。脊髓变暗也表示水肿。请注意这些更改如何随着再生的进行而消失。黄色箭头 = 层切除术的区域。图最初由泰格森等人13号公布。请点击此处查看此图的较大版本。
补充视频 1：视频显示触觉刺激后的神经功能，以及后来的感知刺激。先是健康的控制动物，然后是患有SCI的动物。请点击这里下载这段视频。
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Discussion
由于脊髓损伤的风险很大，协议的关键步骤是去除脊柱过程，并根据需要扩大对脊髓管的骨质访问。如协议所述，强烈建议首先删除最颅骨过程。这将意味着更多的牛加工保护脊髓免受剪刀的击中。建议确保足够的手术治疗，这意味着不要使过小的主要切口。此外，当用钳子抓住任何东西时，必须始终考虑所施加的拉力方向。在抓地力失效和仪器滑移时，从脊髓上轻轻拉出，将保护脊髓。
弓形虫的外科手术与其他动物没有区别。然而，某些重要差异确实存在，主要归因于动物的组织组成和大小。轴骨龙骨皮肤非常脆弱，自相矛盾的是，在切口过程中受到的微小损伤后，不能很好地愈合。应谨慎，特别是在主要切口时，因为损坏会使缝合工作严重复杂化。非常年轻的弓形虫的骨头非常柔软。这意味着，通常基本的解剖钳子可能足以去除骨头。这提出了另一个谨慎的因素，因为挤压旋转过程可能会造成重大损害。皮下和肌肉筋膜层不能缝合，因为它们的组织组成脆弱。必须确保术后一周平静。手术后动物可能不能充分休息。因此，它们可能在术后对脊髓造成二次损伤。其小解剖结构既不允许内部固定，也不允许样条固定。
下降杆系统的重量和下降高度对造成挫伤至关重要。在进行早期研究的广泛试验中，发现所需的杆重量和下降高度为25克和3厘米13。这足以诱导12克异体麻痹，而不切割或分解脊髓。更大的动物可能需要增加体重或下降的高度。此外，对于较大的动物来说，落杆的直径可能需要更大，而较小的动物则需要变短。
该模型有一些限制。由于异体不用于学习的行为研究，因此不能测试复杂的神经功能。损伤被引入四肢，使后肢、肠和膀胱免于瘫痪。这样做的原因是合乎道德的，将对动物的影响减少到最低限度。然而，它确实限制了研究对肢体运动的影响的机会，这可能更容易描述和分类。SCI相关发病的很大一部分源于肠和膀胱失去控制。此模型不允许将来在这些领域进行研究。对后肢造成损伤是可能的，但并不是企图。
在再生模型（如轴醇）中研究 SCI 允许在 SCI 研究中采用不同的方法。由于动物模型可以再生，消除研究将能够揭示再生的关键因素。对SCI的传统研究是在非再生模型中进行的，这意味着人们需要干预所有关键因素，以诱导再生反应。
这个模型和协议与Krogh的原则是一致，指出："对于如此多的问题，将会有一些动物的选择或一些这样的动物，它可以最方便地研究"17。哺乳动物再生受到多种因素的抑制。在哺乳动物模型中抑制这些通常不会引起任何影响。然而，增加在axolotl的抑制剂水平应消除再生，从而揭示该抑制剂是否关键10。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
迈克尔·佩德森，奥胡斯大学，他的专业知识和时间在开发MRI协议和建立整个项目。彼得·阿格尔，奥胡斯大学，他的专业知识和时间在开发MRI协议。奥胡斯大学的斯特芬·林加德，他在开发MRI协议方面的专长和时间。A.P. Müller Maersk 基金会、里斯福基金会、Linex 基金会和 ELRO 基金会大力支持了 A.P. Müller Maersk 基金会在 axolotl 中开发 SCI 模型。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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