Contusione Mitraglio Cavolo spinale con una MicrochirurgicA laminectomia nell'Axolotl Rigenerativo
Summary
Questo manoscritto presenta protocolli per infliggere chirurgicamente le lesioni del midollo spinale smussate e taglienti controllate ad un axolotl rigenerativo (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Lo scopo di questo studio è quello di stabilire un modello di lesione del midollo spinale smussato rigenerativo standardizzato e riproducibile nell’axolotl (Ambystoma mexicanum). La maggior parte delle lesioni cliniche del midollo spinale si verificano come traumi contundenti ad alta energia, inducendo lesioni da contusione. Tuttavia, la maggior parte degli studi nel midollo spinale axolotl sono stati condotti con traumi acuti. Pertanto, questo studio mira a produrre un modello rigenerativo più rilevante dal punto di vista clinico. A causa della loro impressionante capacità di rigenerare quasi tutti i tessuti, gli axolotl sono ampiamente utilizzati come modelli negli studi rigenerativi e sono stati ampiamente utilizzati negli studi sulle lesioni del midollo spinale (SCI). In questo protocollo, gli assilotls sono anestesizzati da un’immersione in una soluzione di benzocaina. Al microscopio, un’incisione angolare viene fatta bilateralmente ad un livello semplicemente caudale agli arti posteriori. Da questa incisione, è possibile sezionare ed esporre i processi spinosi. Utilizzando pinze e forbici, viene eseguita una laminectomia a due livelli, esponendo il midollo spinale. Viene costruito un dispositivo traumatologico personalizzato costituito da una canna che cade in un cilindro, e questo dispositivo viene utilizzato per indurre una lesione di contusione al midollo spinale. Le incisioni vengono poi suturate e l’animale recupera dall’anestesia. L’approccio chirurgico è riuscito a esporre il midollo spinale. Il meccanismo del trauma può produrre lesioni da contusione al midollo spinale, come confermato da istologia, risonanza magnetica, ed esame neurologico. Infine, il midollo spinale si rigenera dalla lesione. La fase critica del protocollo è la rimozione dei processi spinosi senza infliggere danni al midollo spinale. Questo passaggio richiede una formazione per garantire una procedura sicura. Inoltre, la chiusura delle ferite dipende fortemente dal non infliggere danni inutili alla pelle durante l’incisione. Il protocollo è stato eseguito in uno studio randomizzato di 12 animali.
Introduction
L’obiettivo generale di questo studio era quello di stabilire un metodo microchirurgico controllato e riproducibile per infliggere SCI contundente e tagliente all’axolotl (Ambystoma mexicanum), producendo un modello di lesione del midollo spinale rigenerativo.
La SCI è una condizione grave che, a seconda del livello e dell’estensione, infligge disabilità neurologiche alle estremità insieme a un controllo alterato della vescica e dell’intestino1,2,3. La maggior parte delle SCI sono il risultato di traumi contundenti ad alta energia come incidenti stradali e cadute4,5. Le lesioni taglienti sono molto rare. Pertanto, il tipo di lesione macroscopica più comune è contusioni.
Il sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) è un tessuto non rigenerativo, quindi nessun ripristino del tessuto neurologico seguito a SCI è visto6,7,8. D’altra parte, alcuni animali hanno un’intrigante capacità di rigenerare i tessuti, tra cui il tessuto CNS. Uno di questi animali è l’axolotl. È ampiamente usato negli studi di biologia rigenerativa ed è di interesse nella rigenerazione del midollo spinale, perché è un vertebrato9,10,11,12.
La maggior parte degli studi SCI nell’axolotl vengono eseguiti come amputazione dell’intera coda o ablazione di una parte più grande del midollo spinale9,10,11,12. Recentemente, è stato pubblicato un nuovo studio sulle lesioni contundenti13 che imitano meglio le situazioni cliniche. Mentre l’amputazione completa dell’appendice nell’axolotl comporta una rigenerazione completa, alcuni fenomeni rigenerativi non basati sull’amputazione dipendono dal difetto di dimensione critica (CSD)14,15. Ciò significa che le lesioni che superano una soglia critica non vengono rigenerate. Per sviluppare un modello rigenerativo con un valore traslazionale clinico più elevato, questo studio ha studiato se un trauma contundente di 2 mm supererebbe il limite di CSD.
Questo metodo è rilevante per i ricercatori che lavorano sulla rigenerazione del midollo spinale in piccoli modelli animali, in particolare nell’axolotl. Inoltre, può essere di interesse più generale, perché presenta un modo di utilizzare attrezzature di laboratorio standard per sviluppare un meccanismo di trauma contundente che è adatto per l’uso in piccoli animali in generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poiché il rischio di lesioni al midollo spinale è significativo, le fasi critiche del protocollo sono la rimozione dei processi spinosi e l’allargamento dell’accesso osseo al canale spinale, se necessario. Come accennato nel protocollo, si raccomanda vivamente di rimuovere il processo più cranico. Ciò significa che i processi più caudali proteggono il midollo spinale da essere colpiti dalle forbici. Si raccomanda di garantire un accesso chirurgico sufficiente, il che significa non fare troppo piccolo un’incisione pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Università di Aarhus per la sua esperienza e il tempo sullo sviluppo di protocolli di risonanza magnetica e la creazione dell’intero progetto. Peter Agger, Università di Aarhus per la sua esperienza e il tempo sullo sviluppo dei protocolli di risonanza magnetica. Steffen Ringgard, Università di Aarhus per la sua esperienza e il tempo sullo sviluppo dei protocolli di risonanza magnetica. Lo sviluppo del modello SCI nell’axolotl è stato gentilmente sostenuto dalla Fondazione A.P. Maersk, dalla Fondazione Riisfort, dalla Fondazione Linex e dalla Fondazione ELRO.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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