Kontusion ryggmärgsskada via en mikrokirurgisk laminektomi i regenerativ axolotl
Summary
Detta manuskript presenterar protokoll för kirurgiskt tillfogar kontrollerade trubbiga och skarpa ryggmärgsskador till en regenerativ axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Syftet med denna studie är att etablera en standardiserad och reproducerbar regenerativ trubbig ryggmärgsskada modell i axolotl (Ambystoma mexicanum). De flesta kliniska ryggmärgsskador uppstår som hög energi trubbiga trauman, inducera kontusion skador. Emellertid, de flesta studier i axolotl ryggmärgen har utförts med vassa trauman. Därför syftar denna studie till att producera en mer kliniskt relevant regenerativ modell. På grund av deras imponerande förmåga att regenerera nästan alla vävnader, axolotien används ofta som modeller i regenerativ studier och har använts i stor utsträckning i ryggmärgsskada (SCI) studier. I detta protokoll är axolotien sövda genom nedsänkning i en bensokain lösning. Under mikroskopet, ett vinkel snitt görs bilateralt på en nivå bara caudal till bakbenen. Från detta snitt, är det möjligt att dissekera och exponera spinösa processer. Med hjälp av pincett och sax, en två-nivå laminektomi utförs, utsätta ryggmärgen. En anpassad trauma enhet bestående av en fallande stav i en cylinder är konstruerad, och denna enhet används för att framkalla en kontusion skada på ryggmärgen. Snitten sys sedan, och djuret återhämtar sig från anestesi. Den kirurgiska metoden är framgångsrik i att exponera ryggmärgen. Den trauma mekanismen kan ge kontusion skador på ryggmärgen, som bekräftas av histologi, MRI, och neurologiska undersökning. Slutligen, ryggmärgen regenererar från skadan. Det kritiska steget i protokollet är att avlägsna spinösa processer utan att orsaka skador på ryggmärgen. Detta steg kräver utbildning för att säkerställa ett säkert förfarande. Dessutom är såret stängning mycket beroende av att inte tillfoga onödig skada på huden under snittet. Protokollet utfördes i en randomiserad studie av 12 djur.
Introduction
Det övergripande målet med denna studie var att etablera en kontrollerad och reproducerbar mikrokirurgisk metod för att tillfoga trubbig och skarp SCI till axolotl (Ambystoma mexicanum), som producerar en regenerativ ryggmärgsskada modell.
Sci är ett allvarligt tillstånd som, beroende på nivån och omfattningen, tillfogar neurologiska funktionshinder till extremiteterna tillsammans med nedsatt urinblåsa och tarm kontroll1,2,3. De flesta Sci är resultatet av hög energi trubbiga trauma såsom trafikolyckor och faller4,5. Skarpa skador är mycket sällsynta. Därför, den vanligaste makroskopisk skada typ är kontusioner.
Den däggdjurs centralanervsystemet (CNS) är en icke-regenerativ vävnad, därav ingen restaurering av neurologisk vävnad efter Sci ses6,7,8. Å andra sidan, vissa djur har en spännande förmåga att regenerera vävnader, inklusive CNS vävnad. Ett av dessa djur är axolotl. Det används ofta i studier av regenerativ biologi och är av intresse för ryggmärgs förnyelse, eftersom det är en ryggradsdjur9,10,11,12.
De flesta Sci studier i axolotl utförs som antingen amputation av hela svansen eller ablation av en större del av ryggmärgen9,10,11,12. Nyligen publicerades en ny studie om trubbiga skador13 som härmar kliniska situationer bättre. Medan fullständig bihang amputation i axolotl resulterar i fullständig förnyelse, vissa icke-amputation-baserade regenerativ fenomen är beroende av den kritiska storleks fel (CSD)14,15. Detta innebär att skador som överskrider en kritisk tröskel inte regenereras. För att utveckla en regenerativ modell med ett högre kliniskt translationell värde undersökte denna studie om ett 2 mm trubbigt trauma skulle överskrida gränsvärdet för CSD.
Denna metod är relevant för forskare som arbetar med ryggmärgs förnyelse i små djurmodeller, särskilt i axolotl. Dessutom kan det vara av mer allmänt intresse, eftersom det uppvisar ett sätt att använda standard laboratorieutrustning för att utveckla en trubbig trauma mekanism som är lämplig för användning i små djur i allmänhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom risken för skador på ryggmärgen är betydande, de kritiska stegen i protokollet tar bort spinösa processer och breddning av beniga tillgång till ryggmärgskanalen om det behövs. Som nämnts i protokollet, ta bort den mest kraniala processen först rekommenderas starkt. Detta kommer att innebära att de mer kaudala processer skydda ryggmärgen från att drabbas av saxen. Det rekommenderas att säkerställa tillräcklig kirurgisk tillgång, vilket innebär att inte göra för litet ett primärt snitt. Också…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michael Pedersen, Århus universitet för sin expertis och tid på att utveckla MRI-protokoll och inrätta hela projektet. Peter Agger, Århus universitet för sin expertis och tid på att utveckla MRI-protokollen. Steffen Ringgard, Århus universitet för sin expertis och tid på att utveckla MRI-protokollen. Utvecklingen av SCI-modellen i axolotl stöddes vänligt av A.P. Møller Maersk Foundation, Riisfort Foundation, linex Foundation och ELRO Foundation.
Materials
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g – 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| kimwipes | |||
| microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. . Principles of Regeneration. , (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
