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Immunology and Infection

सटीक सेलुलर प्रतिनिधित्व और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं के तीन आयामी इमेजिंग

doi: 10.3791/60350 Published: October 29, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल कैसे तैयार करने के लिए और जीने के लिए जीवाणु नमूने माउंट तीन आयामी इमेजिंग और कैसे उन छवियों से ई. कोलाई के तीन आयामी आकार के पुनर्निर्माण के लिए बताते हैं.

Abstract

जीवाणु का आकार इसके शरीर क्रिया विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है। सेल फिजियोलॉजी के कई पहलुओं जैसे सेल गतिशीलता, predation, और biofilm उत्पादन सेल आकार से प्रभावित किया जा सकता है. जीवाणु कोशिकाओं तीन आयामी (3 डी) वस्तुओं रहे हैं, हालांकि वे शायद ही कभी इस तरह के रूप में इलाज कर रहे हैं. अधिकांश माइक्रोस्कोपी तकनीकों के परिणामस्वरूप दो आयामी (2 डी) छवियों का परिणाम वास्तविक 3 डी सेल आकार और प्रोटीन के स्थानीयकरण से संबंधित डेटा की हानि हो जाती है। कुछ आकार पैरामीटर, जैसे गाऊसी वक्रता (दो प्रमुख वक्रता के उत्पाद), केवल 3 डी में मापा जा सकता है क्योंकि 2 डी छवियों दोनों प्रमुख curvatures उपाय नहीं है. इसके अतिरिक्त, नहीं सभी कोशिकाओं फ्लैट झूठ जब बढ़ते और 2 डी घुमावदार कोशिकाओं की इमेजिंग सही इन कोशिकाओं के आकार का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है. 3 डी में प्रोटीन स्थानीयकरण को मापने से स्थानिक विनियमन और प्रोटीन के समारोह का निर्धारण करने में मदद मिल सकती है। एक आगे कनवल्शन तकनीक विकसित की गई है जो 3 डी सेल आकृतियों के पुनर्निर्माण और प्रोटीन को सही रूप से स्थानीयकृत करने के लिए माइक्रोस्कोप के धुंधला समारोह का उपयोग करती है। यहाँ, तैयार करने और 3 डी में बैक्टीरिया के लाइव सेल इमेजिंग के लिए नमूने बढ़ते दोनों एक सटीक सेल आकार के पुनर्निर्माण के लिए और प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. विधि सरल नमूना तैयारी, फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण, और MATLAB आधारित छवि प्रसंस्करण पर आधारित है. कई उच्च गुणवत्ता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप बस इन माप लेने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इन सेल पुनर्निर्माण computationally गहन कर रहे हैं और उच्च throughput कम्प्यूटेशनल संसाधनों के लिए उपयोग की सिफारिश की है, हालांकि आवश्यक नहीं है. इस विधि को सफलतापूर्वक कई जीवाणु प्रजातियों और उत्परिवर्ती, फ्लोरोसेंट इमेजिंग रूपरेखा, और माइक्रोस्कोप निर्माताओं के लिए लागू किया गया है।

Introduction

सभी प्रकार के कोशिकाएँ विशिष्ट कार्यों के लिए उनकी आकृतियों को विनियमित करती हैं। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स रक्त कोशिकाओं की तुलना में अलग आकार के होते हैं और विभिन्न कार्य किया है. इसी प्रकार, जीवाणु कोशिकाएं विभिन्न आकारों और आकारों में आती हैं, यद्यपि इन आकृतियों का उद्देश्य हमेशा 1,2ज्ञातनहीं होता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि जीवाणु कोशिकाओं के आकार को सही ढंग से निर्धारित किया जाए। उल्लिखित विधि सबसे लाइव या निश्चित जीवाणु कोशिकाओं के 3 डी विश्लेषण के लिए उपयुक्त डेटा एकत्र करने के लिए एक आसानी से लागू करने का तरीका दिखाती है।

विधि वर्णित एक सही नमूना के 3 डी सेल आकार का प्रतिनिधित्व करने के लिए और ठीक इन आकृतियों के भीतर प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए आदेश में जीवाणु कोशिकाओं के 3 डी छवियों लेने के लिए सक्षम बनाता है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीक 2 डी छवियों को ले, जो समस्याग्रस्त है जब कोशिकाओं है कि असामान्य या nonsymmetrical आकार है, इस तरह के Escherichia कोलाईके उत्परिवर्ती के रूप में अध्ययन, या ऐसे Vibrio हैजे और Helicobacter के रूप में घुमावदार बैक्टीरिया पिलोरी| उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी छवियाँ इस विधि के लिए कुंजी इनपुट हैं, जबकि विधि एक संकल्प-एन्हांस्ड छवि वापस नहीं करता है। इसके बजाय, यह विधि सक्रिय आकृति और सूक्ष्मदर्शी3 (चित्र 1)के स्पष्ट धुंधला फलन का उपयोग करके आगे कनवल्शन एल्गोरिथ्म का उपयोग करके 3D सतह निर्देशांकों और आकार का पुनर्निर्माण करती है। यह ई. कोलाई4,5,6,7, वी हैजा 8में उपन्यास periskeletal तत्व CrvA में जीवाणु actin homolog MreB अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है , और putative हेलिकोबैक्टर पाइलोरी9 मेंबैक्टोफिलिन सी.सी.एम.ए.

प्रोटीन के स्थानीयकरण उनके कार्यों में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. उदाहरण के लिए कोशिका विभाजन में लगे प्रोटीनों को सामान्यतः मध्य कोशिका10,11में स्थानीयबनाया जाता है। जीवाणु के सभी प्रोटीनों को अपने कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की आशा में उच्च-थ्रूपुट अध्ययन किए गएहैं. दुर्भाग्य से, इन अध्ययनों 2 डी इमेजिंग और 1 डी या 2 डी विश्लेषण के साथ प्रदर्शन किया गया, यह असंभव प्रोटीन स्थानीयकरण के विशिष्ट पहलुओं को मापने के लिए कर रही है, इस तरह सेलुलर ज्यामितीय सुविधाओं के लिए स्थानीयकरण के रूप में.

उदाहरण के लिए, MreB, एक गतिशील प्रोटीन कई बैक्टीरिया की छड़ आकार के लिए आवश्यक है, कोशिका दीवार संश्लेषण के स्थानीयकरण निर्देशन द्वारा काम करने के लिए hypothesized है, और इसके स्थानीयकरण सेल दीवार संश्लेषण के स्थानीयकरण दर्पण7,13. कई प्रजातियों से MreB ज्यामितीय संवर्धन4,6,7,14,15से पता चलता है . गतिशील सतह बहुलक, जैसे MreB, समय औसत संवर्धन प्रोफ़ाइल16 करने के लिए सतह की ज्यामिति जोड़ी और झिल्ली17के लिए बाध्यकारी के साथ जुड़े ऊर्जा को कम करके विशिष्ट geometries के लिए उन्मुख करने में सक्षम हो सकता है. जबकि घुमा, बंडलिंग, झुकने, और गतिशीलता के महत्व को पूरी तरह से MreB के लिए हल नहीं किया गया है, यह ध्यान दें कि एक सतह के दोनों प्रमुख curvatures के सटीक माप सेल का एक पूर्ण 3 डी प्रतिनिधित्व की आवश्यकता है महत्वपूर्ण है. इसलिए, सबसे सही curvatures जो प्रोटीन स्थानीयकरण को मापने के लिए, यह 3 डी का उपयोग करने के लिए अधिमानी है, बजाय 2 डी इमेजिंग. 3 डी इमेजिंग computationally उन curvatures जो 2 डी में मापा नहीं जा सकता है का अनुमान लगाने की जरूरत समाप्त, एक अनुमान है कि असममित कोशिकाओं में सही नहीं हो सकताहै 18.

हालांकि कोशिकाओं की 2 डी इमेजिंग तेज है और के रूप में ज्यादा postimaging कम्प्यूटेशनल काम की आवश्यकता नहीं है, 3 डी इमेजिंग सेल का एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, साथ ही इस तरह के वक्रता के रूप में सतह सुविधाओं को मापने की क्षमता, जो 2 डी में नहीं मापा जा सकता है. इसलिए, के रूप में 3 डी इमेजिंग और अधिक आम हो जाता है, सेल आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण में नई अंतर्दृष्टि संभव हो जाएगा.

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. इमेजिंग के लिए ई. कोलाई फ्लोरोसेंट बनाएं या तो उन्हें साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन6 व्यक्त करने या एक झिल्ली डाई5का उपयोग करने के लिए इंजीनियरिंग द्वारा . ई. कोलाईके स्थान पर अन्य जीवाणु प्रजातियों का प्रयोग किया जा सकता है .
    1. एक प्लाज्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोट्रेशन के माध्यम से कोशिकाओं को रूपांतरण जो कोशिकाद्रव्यी मक्सी फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है।
      नोट: के अन्य रंगों के विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ एक LB प्लेट पर transformants हो जाना। एकल कालोनियों प्राप्त करें और माइक्रोस्कोपी द्वारा सकारात्मक क्लोन की पहचान करें। माइक्रोस्कोप के नीचे लाल दिखाई देने वाली एंटीबायोटिक प्रतिरोधी कालोनियों में प्लाज्मिड ले जाने वाले मक्की होते हैं।
  2. एक मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी तरल मीडिया में रात भर की संस्कृति के 2 एमएल हो जाना। या तो एक थाली से एक कॉलोनी या inoculum के रूप में एक फ्रीजर स्टॉक की एक छोटी राशि का उपयोग करें.
    नोट: प्रयोग के लिए चयनित जीवाणु कोशिकाओं के लिए आवश्यक मीडिया का उपयोग करें.
  3. उपकृषि रात भर संस्कृति 1:1,000 ताजा LB मीडिया के 5 एमएल में और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस में घातीय चरण में बढ़ने के लिए 3 "4 ज के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में. कोशिकाओं के OD600 उपाय पुष्टि करने के लिए वे घातीय चरण में हैं (यानी. , OD600 [ 0.2]0.4).
    नोट: इमेजिंग प्रदर्शन किया जा रहा प्रयोग के आधार पर किसी भी विकास के स्तर पर किया जा सकता है.

2. स्लाइड तैयारी

नोट: यह मीडिया है कि कम autofluorence है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. किसी भी माध्यम है जो कम autofluorscence है इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रयोग में, 1% agarose M63 न्यूनतम मीडिया पैड और VaLaP19 के साथ सील 3 डी में छवि कोशिकाओं के लिए आवश्यक है.

  1. न्यूनतम मीडिया के 20 एमएल में agarose का एक 1% समाधान तैयार करें.
    1. एग्रोस पूरी तरह से भंग होने तक समाधान को माइक्रोवेव करें और समाधान स्पष्ट दिखाई देता है।
    2. उपयोग करने के लिए तैयार होने तक समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
      नोट: इस समाधान को आवश्यक के रूप में ठोस और पिघलाया जा सकता है या आवश्यकतानुसार पिघले हुए छोटी मात्रा में लगाया जा सकता है। कई का उपयोग करता है के बाद मीडिया फीका हो सकता है और बदला जाना चाहिए.
  2. 80 डिग्री 100 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर मेल्ट VaLaP सीलेंट।
    नोट: VaLaP तैयार, एक सीलेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, 50 ग्राम पेट्रोलियम जेली, लैनोलिन, और पैराफिन के प्रत्येक एक साथ एक गर्म थाली पर एक बीकर में पिघलने से 80 डिग्री 100 डिग्री सेल्सियस. VaLaP की यह बड़ी राशि अनिश्चित काल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और के लिए पर्याप्त हो जाएगा gt;500 स्लाइड. पर हीटिंग 100 डिग्री सेल्सियस यह नीचा करने के लिए कारण होगा और इसका रंग गहरा हो जाएगा।
  3. एक स्लाइड (छह कुल coverslips) के विपरीत छोर पर तीन 20 मिमी x 20 मिमी कवर फिसल जाता है में से प्रत्येक दो ढेर रखें।
  4. स्लाइड पर agarose पैड समाधान के Pipette 200 $L.
    नोट: यदि एक इंजीनियर फ्लोरोसेंट दाग का उपयोग नहीं, एक झिल्ली डाई इस कदम से पहले agarose पैड समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है. पानी में डाई को पुन: निलंबित करें और 5 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए अगारोस पैड विलयन के 1 एमएल में डाई जोड़ें।
  5. तुरंत और मजबूती से कवर पर्चियों के ढेर पर एक दूसरी स्लाइड नीचे रखने के लिए agar समतल और यह कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए ठोस.
  6. शीर्ष स्लाइड को सावधानीपूर्वक स्लाइड करें.
  7. स्लाइड पर जेल (व्यास में $ 5 मिमी) से अलग-अलग पैड में कटौती करने के लिए एक 200 $L पिपेट टिप के बड़े अंत का उपयोग करें और विकृत या अनावश्यक जेल को त्यागें।
    नोट: यदि एकाधिक उपभेदों या शर्तों इमेजिंग, एक अलग पैड हर एक के लिए की आवश्यकता होगी. केवल एक तनाव छवि होना है, तो coverslip का समर्थन करने में मदद करने के लिए 3 "4 पैड बनाने के लिए।
  8. Pipette कोशिकाओं को ऊपर और नीचे कई बार सेल clumps को बाधित करने और सुनिश्चित करें कि संस्कृति अच्छी तरह से मिश्रित है. एक पैड पर कदम 1.3 से subculture के Pipette 1 $L.
    नोट: सेल आकार पुनर्निर्माण अलग-अलग कोशिकाओं है कि अन्य कोशिकाओं को छू नहीं रहे हैं की आवश्यकता है। यदि स्थिर चरण या उच्च सेल घनत्व संस्कृतियों का उपयोग कर, यह नमूना पतला करने के लिए आवश्यक हो सकता है 1:10 यह पैड पर रखने से पहले.
  9. नमूना हवा को 5 डिग्री 10 मिनट के लिए सूखने दें। यह सुनिश्चित करें कि छोटी बूंद पूरी तरह से पैड में अवशोषित हो जाती है। यदि कोई तरल रहता है, कोशिकाओं के चारों ओर तरल में कदम होगा और छवि नहीं किया जा सकता है.
  10. पैड के शीर्ष पर एक कवर पर्ची रखें.
  11. धीरे एक कपास झाड़ू के साथ कवर पर्ची के किनारे के आसपास brushing द्वारा पिघल VaLaP के साथ कवर पर्ची सील. इसे कवर स्लिप के शीर्ष से दूर रखना सुनिश्चित करें जहां उद्देश्य स्पर्श करेगा। VaLaP सेकंड के एक मामले में कठोर हो जाएगा, नमूना सील.
  12. तुरंत नमूना छवि.
    नोट: स्लाइड तैयार होते ही नमूना छवि बनाया जाना चाहिए। कोशिकाओं पैड पर विकसित कर सकते हैं, और अगर वे पुनर्निर्माण विभाजित और अधिक कठिन हो जाएगा.

3. इमेजिंग आवश्यकताएँ

  1. सुनिश्चित करें कि z या माइक्रोस्कोप के ध्यान केंद्रित अक्ष कम से कम 50 एनएम की सटीक आंदोलनों कर सकते हैं. z piezo चरणों का प्रयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें), अनुसंधान ग्रेड माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध है, क्योंकि ठेठ motorized फोकस उपकरणों को इस परिशुद्धता प्रदान करने में असमर्थ हैं.
    नोट: यह मानते हुए NyQuist-Shannon नमूना मापदंड20, एक 0.5x सबसे छोटी वांछित कदम आकार, या 2x वांछित स्थानिक आवृत्ति स्थानांतरित करने की क्षमता की जरूरत है. इस प्रोटोकॉल में आवश्यक 100 एनएम चरणों के लिए, 50 एनएम या उससे कम की परिशुद्धता के साथ एक चरण की आवश्यकता है।
  2. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप 1.45 की एक न्यूनतम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ एक 100x उद्देश्य शामिल हैं।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त कक्ष प्राप्त किए जाते हैं, 200$400 विभिन्न कक्षों के बीच के z-स्टैक एकत्रित करें.
      नोट: आवश्यक कोशिकाओं की संख्या ब्याज के नमूने के अंतर्निहित परिवर्तनशीलता पर निर्भर करता है. इस बिंदु पर एकत्र कोशिकाओं में से कुछ यह पुनर्निर्माण चरणों के माध्यम से नहीं कर देगा.
  3. सुनिश्चित करें कि यदि कोई द्वितीयक फ्लोरोसेंट चैनल (प्रोटीन, चयापचय लेबल, आदि) मापा जाता है, तो z-स्टैक आकृति चैनल के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स से मेल खाता है.

4. इमेजिंग

  1. सील स्लाइड को माइक्रोस्कोप पर डालें और इसे 5 मिनट के लिए बैठने के लिए परिवेश के साथ तापमान को बराबर करने की अनुमति दें, क्योंकि माइक्रोस्कोप कमरे नमूना तैयारी कक्ष की तुलना में एक अलग तापमान पर हो सकता है।
  2. नमूने की एक फ्लोरोसेंट z-स्टैक ले लो.
    नोट:
    z-स्टैक पूरी तरह से एक z-spacing फ़ील्ड की गहराई से कम के साथ नमूना कवर करना चाहिए। एक 1.45 एनए 100x उद्देश्य और $1 डिग्री मीटर मोटी ई. कोलाई कोशिकाओं के लिए, 100 एनएम प्रति कदम पर 40 कदम अच्छी तरह से काम करते हैं। बड़े कोशिकाओं या कोशिकाओं है कि सतह पर पूरी तरह से फ्लैट झूठ नहीं है के लिए, 50 या अधिक कदम आवश्यक हो सकता है. पर्याप्त चरण शामिल करें और सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से ऊपर और नीचे धुंधला है.
    1. सूक्ष्मदर्शी को नियंत्रित करने के लिए सूक्ष्मदर्शी से संबद्ध सॉफ्टवेयर का प्रयोग कीजिए ( सामग्री की सारणीदेखें)
    2. सूक्ष्मदर्शी फोकस पहियों का उपयोग करसेल के मध्य पर ध्यान केंद्रित करें। ND प्राप्ति के अंतर्गत एक z-स्टैक लेने के लिए बॉक्स की जाँच करें। कक्ष के मध्य को प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेट करने के लिए होम बटन क्लिक करें. चरण आकार को 0.1 $m पर सेट करें और श्रेणी को 4 $उ पर सेट करें. सुनिश्चित करें कि पाइजो अवस्था में $ डिवाइस सेट है.
    3. फ्लोरोसेंट अणुओं छवि जा रहा है के लिए सेटिंग्स के लिए Lambda विंडो के तहत फ्लोरोसेंट चैनलसेट करें। इस प्रयोग में GFP और mCherry इस्तेमाल किया गया.
      नोट: एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट चैनल के 3 डी वितरण वांछित है, तो दूसरे रंग चैनल में एक ही चरण आकार और रेंज के साथ एक अतिरिक्त z-स्टैक ले लो. इस प्रयोग में, कोशिकाद्रव्यी मचेरी का उपयोग कोशिका आकार निर्धारित करने के लिए किया जाता था और MreB-GFP का उपयोग दूसरे रंग चैनल21के रूप में किया जाता था।
    4. सुनिश्चित करें कि प्रयोग का क्रम lambda (z श्रृंखला) के लिए सेट किया गया है ताकि यह स्विच करने से पहले प्रत्येक रंग चैनल में एक पूर्ण z-स्टैक ले जाएगा।
    5. छवि प्राप्ति प्रारंभ करें और फ़ाइल onece onece एक या दोनों z-stacks पूर्ण हैं सहेजने के लिए अभी चलाएँ क्लिक करें।
    6. पैड पर एक नए क्षेत्र में ले जाएँ और चरण दोहराएँ 4.2.2-4.2.5.

5. सेल पुनर्निर्माण

  1. अलग-अलग कक्षों को क्रॉप करें और छवियों को स्टैक्ड टिफ़ फ़ाइल के रूप में सहेजें ताकि प्रति फ़ाइल केवल एक कक्ष हो. सुनिश्चित करें कि यह कक्ष किसी भी अन्य कक्ष से अच्छी तरह से अलग है (यानी, लगभग 5x पूर्ण-चौड़ाई आधा-अधिकतम xy में धुंधला फ़ंक्शन का।
    नोट:
    यह स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें).
    1. किसी व्यक्तिगत कक्ष के चारों ओर एक बॉक्स आरेखित करें और प्रत्येक चैनल के लिए एक बार उस कक्ष 2x को डुप्लिकेट करें. सुनिश्चित करें कि डुप्लिकेट हाइपरस्टैक बॉक्स चेक किया गया है और चैनल को 1 या 2 में परिवर्तित करें, सुनिश्चित करें कि स्लाइस में संपूर्ण z-स्टैक शामिल हैं.
      नोट: यदि इमेजिंग केवल कोशिकाओं के आकार और नहीं एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन, केवल एक चैनल मौजूद होगा.
    2. एक बार दोनों स्टैक उपलब्ध हैं छवियाँ करने के लिए जाना ] ढेर ] उपकरण ] पहले प्रोटीन चैनल और आकार चैनल दूसरे के साथ छवियों गठबंधन करने के लिए Concatenate.
    3. नई छवि को टिफ़ फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  2. उपडिफ्रक्शन सीमित फ्लोरोसेंट मोती22का उपयोग करके सूक्ष्मदर्शी के धुंधला कार्य को मापें। यह प्रत्येक माइक्रोस्कोप और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन पहले या ब्याज के नमूने इमेजिंग के बाद किया जा सकता है.
    1. उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कुछ मैनुअल हस्तक्षेप के साथ एक साथ एक साथ औसत एकाधिक स्वतंत्र मोती (सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: अंतिम उत्पाद ब्याज के नमूने के रूप में एक ही xyz रिक्ति के साथ धुंधला समारोह की एक 3 डी छवि होना चाहिए.
  3. उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आगे कनवल्शन सेल आकार पुनर्निर्माण लिपियों चलाते हैं। इन लिपियों के नवीनतम संस्करण स्वतंत्र रूप से https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public से डाउनलोड किया जा सकता है.
    1. डेस्कटॉप पर किसी फ़ोल्डर के अंदर कोई फ़ोल्डर बनाएँ जिसमें क्रॉप की गई छवियाँ और shae-cellshape-public/exampleData]tri से cell[shape]settings]tri.txt फ़ाइल हो.
    2. रुचि के प्रयोग के लिए सही सेटिंग करने के लिए cell[shape]setting]tri.txt संपादित करें. इस प्रयोग के लिए, सेटिंग्स फ़ाइल में निम्न पंक्तियाँ शामिल हैं:
      एनएम[per]पिक्सेल 70
      $स्केल 0.65
      स्टैक-z-size 41
      स्टैक-t-आकार 1
      Fstack[z]size 41
      Fstack[t]आकार 1
      स्टैक-सेपरेशन[nm 100]
      Fstack[seperation]nm 100
      psfScript -999 osuPSF20180726
      प्रवणता 1

      नोट: यह पाठ फ़ाइल अनुभागों में व्यवस्थित है और प्रत्येक अनुभाग अपने चर में पार्स है। जबकि कई सेटिंग्स को प्रयोग से प्रयोग में परिवर्तित करने की आवश्यकता नहीं है, एक को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि z-स्टैक का आकार (आकार के लिएstack]z-size, ब्याज के प्रोटीन के लिए Fstack[z]size), z-stack की रिक्ति(stack]seperation] nm, Fstack[seperation]nm), माइक्रोस्कोप के सापेक्ष फोकल शिफ्ट ($ स्केल)23, xy में पिक्सेल आकार (nm$per]pixel), और स्क्रिप्ट का नाम है कि माइक्रोस्कोप के धुंधला समारोह लोड (psfScript ) प्रयोग से मेल खाते हैं। यदि आकृति चैनल कोशिकाद्रव्यी भरा हुआ है और 0 यदि यह एक झिल्ली से सना हुआ वस्तु है तो ग्रेडिएंट फ़ील्ड को 1 पर सेट किया जाना चाहिए.
    3. चलाने के लिए Cell]shape]detector3dConvTriFolder फ़ंक्शन (शे-सेलशेप-सार्वजनिक/CellShapeDetectorTri/) फ़ोल्डर स्थान पर स्ट्रिंग के साथ शुरू करने के लिए सेल की संख्या के बाद, और आप चलाना चाहते हैं कक्षों की संख्या।
      नोट: इनपुट के लिए एक उदाहरण निम्नानुसार दिखेगा: Cell]shape]detector3dConvTriFolder ('फसली छवियों के साथ फ़ोल्डर के लिए पथ', फ़ोल्डर में सूचकांक शुरू, ] कोशिकाओं की). एक ठेठ सेल के पुनर्निर्माण के लिए 5 डिग्री 20 मिनट के बीच लेने के लिए एकाग्र और खत्म हो सकता है.
  4. वे किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले सही हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए सेल पुनर्निर्माण स्क्रीन.
    1. भागो ScreenFits (शे-सेलशेप-सार्वजनिक/शे-fitViewerGui/) नेत्रहीन व्यक्तिगत सेल पुनर्निर्माण स्क्रीन करने के लिए।
    2. चित्रमय यूजर इंटरफेस (GUI) खुलता है जब फ़ोल्डर का चयन करें बटन पर क्लिक करें, तो चरण 5.3 में बनाई गई पुनर्निर्माण डेटा फ़ाइलों (TRI.mat) के साथ फ़ोल्डर का चयन करें।
    3. यदि कोई सेल मिसहैपेन प्रकट होता है या पूर्ण रूप से अभिसरित नहीं होता है (चित्र 3) तो कक्ष पुनर्निर्माण के आगे वाले बॉक्स का चयन करें. यह एक छेद, एक फ्लैट पक्ष, या एक शाखा से बाहर आने के साथ एक सेल की तरह लग सकता है. यह किसी भी downstream विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता ताकि फ़ाइल नाम करने के लिए 'FLAG' परिपुग होगा।
      नोट: पुनर्निर्माण सेल मूल छवियों की तुलना में किया जा सकता है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है अगर आपकी कोशिकाओं को आकार के एक विभिन्न विषमजात आबादी से आते हैं.
  5. भागो EnrichmentSmothsmothSpline (शे-सेलहाप-सार्वजनिक/) सतह पर गाऊसी वक्रता के एक समारोह के रूप में ब्याज की प्रोटीन के सापेक्ष एकाग्रता के एक संवर्धन प्रोफ़ाइल बनाने के लिए।
    1. चरण 5.3.3 में बनाई गई TRI.mat फ़ाइलों के साथ प्रत्येक फ़ोल्डर का चयन करें।
    2. नव निर्मित (5.5.1) curve.mat फ़ाइल का चयन करें।
      नोट: 5.5.1 में चयनित प्रत्येक फ़ोल्डर के लिए एक curve.mat फ़ाइल बनाई जाएगी. संवर्धन प्रोफाइल के सभी एक ग्राफ पर प्रस्तुत किया जाएगा. अलग-अलग रेखांकन प्रत्येक फ़ोल्डर के लिए 5.5 चलाने से आवश्यक हैं।
      नोट: एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के सटीक ज्यामितीय स्थानीयकरण के अलावा, वहाँ कई अन्य तरीकों से माध्यमिक चैनल से डेटा का विश्लेषण कर रहे हैं, संख्या की गिनती सहित, आकार, और वस्तुओं के अभिविन्यास4.

Representative Results

जीवाणु विभिन्न प्रकार के आकार और आकार में आते हैं जो उनके कार्यों कोप्रकृति1 में निर्धारित कर सकते हैं . इस प्रक्रिया का परिणाम छवियों के एक z-स्टैक के आगे convolution से कोशिकाओं का एक सटीक 3 डी प्रतिनिधित्व है (चित्र 1)। घुमावदार कोशिकाओं (चित्र 2) या असामान्य रूप से आकार की कोशिकाओं (चित्र 4) के साथ , क्योंकि 2D प्रतिनिधित्व कोशिकाओं की वक्रता को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं करता है , तो यह विधि विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अग्रकन संवलन विधि (चित्र 1) का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को या तो परिधीय रूप से दागदार होना चाहिए या एक साइटोप्लाज्मिक दाग होना चाहिए (चित्र 2बी बाएं बनाम दाएँ)।

चित्र 4 कक्ष में MreB स्थानीयकरण दिखाता है। एक GFP संलयन जीवाणु actin प्रोटीन MreB21 के लिए बनाया गया था ताकि दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ई. कोलाई कोशिकाओं में अपने सटीक स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए4. क्योंकि MreB झिल्ली के साथ जुड़ा हुआ है, 3 डी इमेजिंग ईमानदारी से सेल में अपनी स्थिति को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक है. 3 डी में इन माप बनाने के द्वारा, हम दोनों जंगली प्रकार और छड़ उत्परिवर्ती कोशिकाओं के आकार का पुनर्निर्माण करने में सक्षम थे (चित्र 4). MreB के स्थानीयकरण छोटे गॉसियन curvatures, एक ज्यामितीय सुविधा है कि केवल 3 डी में मापा जा सकता है पर समृद्ध होना दिखाया गया था, एक रॉड पर निर्भर तरीके से (चित्र 4बी).

Figure 1
चित्र 1: आगे कनवल्शन विधि कोशिका आकार का कोई पूर्व ज्ञान के साथ कोशिकाओं का पुनर्निर्माण करती है। (ए)विधि का अंतिम निर्गत एक 3D सेल पुनर्निर्माण है जो सूक्ष्मदर्शी के अंशांकित धुंधला फलन के साथ परीक्षण आकार की तुलना करके व्युत्पन्न होता है। यह मनाया z-स्टैक के साथ तुलना की है जब तक मनाया 3 डी छवि काल्पनिक एक से मेल खाता है. यहाँ दिखाया छवि एक सी वर्धमान सेल के पुनर्निर्माण का एक प्रतिपादन है. (ख)पुनर्निर्माण पाइप लाइन पुन: प्रेक्षित छवि स्टैक के आधार पर सतह तत्वों की अनुमानित स्थितियों को अद्यतन करता है। विधि की पूर्ण एल्गोरिथम विवरण के लिए, Nguyen3देखें. (ग)पुनर्निर्माण पाइपलाइन सेल के आकार की कोई प्राथमिकता ज्ञान के साथ शुरू होती है और प्रेक्षित z-स्टैक से मेल खाने के लिए सतह वर्टिक्स की स्थिति और संख्या को अपडेट करती है। 3 डी पुनर्निर्माण के दौरान हर 30 कदम से प्रतिनिधि छवियों एक वी हैजे सेल के तीन अलग अलग कोणों से दिखाया गया है. इस आकृति की सतह की स्थिति नकली और मनाया ढेर के बीच अंतर को कम करने के लिए अद्यतन किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि तीन अलग अलग आकार जीवाणु प्रजातियों के पुनर्निर्माण. तीन आयामी पुनर्निर्माण उनकी झिल्ली दाग (बाएं) के साथ कोशिकाओं से बनाया जा सकता है या एक साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोफोर (दाएं) से भरा. प्रारंभिक कोशिका का आकार और वक्रता महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि एक मुड़ी हुई छड़, मुड़ी हुई छड़, या सीधी छड़ सभी सही ढंग से पुनर्निर्माण करने में सक्षम हैं। पुनर्निर्माण सतहों सतह के स्थानीय गाऊसी वक्रता के आधार पर रंग का कर रहे हैं। स्केल बार ] 1 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Reconstructions एकाधिक कारणों के लिए विफल कर सकते हैं। कोशिकाओं को यह सुनिश्चित करने के लिए जांच की जानी चाहिए कि पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म एक उचित परिणाम के लिए अभिसरित। बाएँ - प्रतिनिधि जंगली प्रकार (ऊपर) और रॉड] उत्परिवर्ती (नीचे) ई. कोलाई कोशिकाओं है कि गुणवत्ता नियंत्रण पारित कर दिया है. राइटजेड सेल जो ठीक से पुनर्निर्माण करने में विफल रहे और गुणवत्ता नियंत्रण पास नहीं कर पाए। विफल अभिसरण के पांच वर्गों दिखाया जाता है: (i) कोशिकाओं है कि फसल क्षेत्र के किनारे के बहुत करीब हैं एक तेज सीमांकन के लिए अग्रणी, (ii) कोशिकाओं है कि बहुत एक और सेल के करीब हैं, (iii) कोशिकाओं है कि एक divot का उत्पादन किया, (iv) कोशिकाओं है कि पिछले प्रारंभिक s आगे बढ़ना नहीं था tarting बिंदु, और (v) अन्य अज्ञात त्रुटियाँ. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: विशिष्ट सेलुलर geometries के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण दिखा प्रतिनिधि डेटा. (ए)जंगली प्रकार और छड़ ई. कोलाई कोशिकाओं की तीन आयामी पुनर्निर्माण कोशिकाओं को गाऊसी वक्रता और MreB फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ प्रदर्शित किया. स्केल बार ] 1 डिग्री मी. (बी) जंगली प्रकार और रॉड से MreB के संवर्धन भूखंडों ई. कोलाई कोशिकाओं. मान और मूल्य संवर्धन और मूल्यों को दिखाते हैं;1 सेल के समान कवरेज के सापेक्ष इन सेलुलर क्षेत्रों से MreB की कमी दिखाते हैं। छायादार क्षेत्रों मतलब मतलब से संकेत मिलता है $90% बूटस्ट्रैप विश्वास अंतराल मतलब है. प्रत्येक विकृति के लिए वक्र एक घन मसृणन spline है और p gt; 5 x 10-3के चरम वक्रता के लिए एक प्रायिकता सीमा का उपयोग कर काट दिया है. यह आंकड़ा से संशोधित किया गया है (Bratton एट अल.) 4. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम उच्च गुणवत्ता वाले छवियों के अधिग्रहण है. कोशिकाओं को ठीक से पुनर्निर्माण करने के लिए, सेल के ऊपर और नीचे पर्याप्त धुंधला होना चाहिए। इसलिए, यह जरूरी है कि z-स्टैक लिया एक बड़ी पर्याप्त दूरी को शामिल किया गया है. छवि अधिग्रहण के दौरान उठाए गए कदमों की संख्या प्रत्येक तनाव के लिए समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रॉड के लिए नष्ट कर दी गई ई. कोलाई कोशिकाएं व्यापक होती हैं और उन्हें अधिक चरणों की आवश्यकता होती है, और इसलिए, जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में अधिक दूरी होती है। यदि नमूना छवि अधिग्रहण के दौरान drifts, पुनर्निर्माण प्रमुख त्रुटियाँ हो सकती है. इसलिए, स्लाइड को ज़-स्टैक अधिग्रहण के दौरान बहाव से बचने के लिए इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप के साथ थर्मल संतुलन में आने देना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को कम autofluorscence के साथ पैड पर छवि की जानी चाहिए. मीडिया घटकों, जैसे कि आम LB माध्यम में पाए जाने वाले घटकों में ऑटोफ्लोरेसेंस होता है जो कोशिकाओं के पुनर्निर्माण का प्रयास करते समय समस्याएं पैदा कर सकता है. इमेजिंग पैड पर कोशिकाओं का घनत्व महत्वपूर्ण है क्योंकि पुनर्निर्माण की प्रक्रिया प्रत्येक सेल पर स्वतंत्र रूप से किया जाता है. बहुत कम कोशिकाओं को कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी, जबकि बहुत सारे कोशिकाओं इमेजिंग क्षेत्रों है कि आसानी से व्यक्तिगत कोशिकाओं फसल के लिए बहुत घने हैं में परिणाम होगा. क्योंकि सभी कोशिकाओं को ठीक से पुनर्निर्माण नहीं, अतिरिक्त कोशिकाओं के अधिग्रहण कदम के दौरान छवि की जानी चाहिए और सभी outputs सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले जांच की जानी चाहिए (चित्र 3).

इस विधि के लिए सीमाओं के कई तकनीकी हैं. माइक्रोस्कोप पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए, एक एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर है कि एक उद्देश्य होना चाहिए (आमतौर पर gt; 1.4), क्योंकि यह बैक्टीरिया के आकार के पैमाने पर ऑप्टिकल अनुभागीय न्यर्द सक्षम बनाता है. इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप एक piezo चरण है कि z-दिशा में छोटे, सटीक कदम ले जा सकते हैं के साथ सुसज्जित करने की जरूरत है. इसके अलावा, जबकि यह आवश्यक नहीं है, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए उच्च थ्रूपुट अभिकलनीय संसाधनों तक पहुंच अत्यधिक अनुशंसित है क्योंकि यह कोशिकाओं के पुनर्निर्माण के लिए प्रसंस्करण समय को कम कर देगा।

विधि के लिए एक वैचारिक सीमा यह है कि छवियों के संकेत से शोर अनुपात के सापेक्ष पुनर्निर्माण की चिकनाई वजन के लिए सही ऊर्जा तराजू चुना जाना चाहिए. पैरामीटर के एक विकल्प को मान्य करने के लिए, आकार और कोशिकाओं के आकार ऐसे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) के रूप में स्वतंत्र तरीकों का उपयोग कर मापा जाना चाहिए. सिद्धांत के एक सबूत के रूप में, कोशिकाओं के 3 डी पुनर्निर्माण या तो एक AFM पर प्रदर्शन किया गया z-accuracy के लिए परीक्षण करने के लिए (और lt;50 एनएम) या एक TEM ग्रिड पर xy-accuracy के लिए परीक्षण करने के लिए (और lt;30 एनएम)3. इस तरह के एक सहसंबद्ध दृष्टिकोण समय लगता है और महंगा है. एक सरल दृष्टिकोण छवि मानक नमूने जैसे जंगली प्रकार की कोशिकाओं या 1 डिग्री मीटर गोलाकार मोती के लिए हो सकता है. पुनर्निर्माण के व्यास और गोलाकार का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि पुनर्निर्माण में उपयोग किए जाने वाले आकार और ऊर्जा पैमाने सही हैं।

यह एकमात्र तरीका है कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से उच्च संकल्प स्थानिक जानकारी निकालने के लिए करना चाहता है नहीं है। कई समीक्षा लेख सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी24,25के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति का वर्णन . संकल्प बढ़ाने की तकनीक जैसे deconvolution माइक्रोस्कोपी26, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी27, पिक्सेल पुन: असाइन28, और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम)29 के संकल्प में सुधार करने की तलाश माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत चित्र। इन विधियों प्रस्तुत प्रकिया के साथ असंगत नहीं हैं। हाल ही में इस विधि के लिए आदानों9के रूप में सिम आधारित छवियों के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था. जबकि आगे कनवल्शन विधि deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ अपने underpinnings के कुछ शेयरों, यह एक पूरी तरह से अलग उत्पादन किया है. जबकि इस तरह के deconvolution माइक्रोस्कोपी के रूप में दृष्टिकोण छवि के संकल्प में सुधार करने के लिए चाहते हैं, इस दृष्टिकोण एक छवि उत्पन्न नहीं करता है बल्कि लगभग 50 एनएम परिशुद्धता के साथ एक सेल आकार पुनर्निर्माण. विरल लेबल नमूनों के आधार पर एकल अणु सक्रिय नियंत्रण माइक्रोस्कोपी तकनीक इस विधि की तुलना में स्थानिक परिशुद्धता के भी उच्च स्तर प्रदान कर सकते हैं। कई मामलों में, इन एकल अणु दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट constructs के अनुकूलन की आवश्यकता होती है और लंबे समय से अधिग्रहण बार की आवश्यकता कर सकते हैं, उन्हें जीना या गतिशील नमूने के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल बना. इन विधियों में से प्रत्येक एक या अधिक चेतावनी है कि इस विधि नहीं करता है के साथ आता है. उदाहरण के लिए, डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा विज्ञापित लाभ के रूप में जीवाणु कोशिकाओं के monolayers के लिए लागू नहीं हैं, जहां विमान प्रकाश से बाहर ज्यादा नहीं है. इसके अलावा, इस विधि किसी भी विशेष fluorores की आवश्यकता के बिना सटीक 3 डी सेल आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण प्राप्त करने के लिए एक पाइप लाइन प्रदान करता है। इस विधि में न्यूनतम हार्डवेयर आवश्यकताएं हैं (यानी, z piezo, उच्च NA उद्देश्य) और केवल प्रति timepoint छवियों के दसियों की आवश्यकता है, एक आसानी से गतिशील 3 डी संरचनाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है6.

3 डी संरचनाओं में जीवाणु कोशिकाओं के संगठन का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण की संख्या में वृद्धि हुई है। इनमें संकल्पनात्मक दृष्टिकोण भी शामिल हैं जो उच्च गुणवत्ता , 3 डी फ्लोरोसेंट छवियों30,31,32का लाभ उठाते हैं . इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से अलग कोशिकाओं की आवश्यकता है और सेलुलर ज्यामिति के बारे में कोई एक प्राथमिकता मान्यताओं बनाता है. तथापि, सघन कोशिकीय समुच्चय अथवा जैव-फिल्मों में जाने के लिए कोशिकाओं को छड़ की तरह माना जाता है। यह कम संकल्प दृश्य अभी भी कोशिकाओं की पैकिंग व्यवस्था की जांच में सक्षम बनाता है, हालांकि biofilm में कोशिकाओं के उच्च घनत्व विशिष्ट कारकों के subcellular स्थानीयकरण के विश्लेषण को रोकता है.

भविष्य में, यह इस 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक के साथ एकल अणु और व्यापक क्षेत्र दृष्टिकोण को एकीकृत करने के लिए एक रूपरेखा विकसित करने के लिए दिलचस्प हो सकता है. इसके अलावा, अधिक घने सेल समूहों के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए मशीन दृष्टि विभाजन उपकरण32 के साथ इस आगे कनवल्शन दृष्टिकोण को शामिल करना संभव हो सकता है।

क्यों कोशिकाओं विशिष्ट आकार में विकसित एक जटिल मुद्दा है कि जटिल वातावरण में वे रहते हैं प्रतिबिंबित करना चाहिए है. विकास और सेल आकार के समारोह को समझना उन आकृतियों का सटीक और सटीक माप लेने की आवश्यकता है, जो है कि इस विधि क्या प्रदान करता है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इस विधि को विकसित करने में मदद करने के लिए Jeffrey Nguyen और यहोशू Shaevitz शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
अनुदान: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - ग्लेन उम्र बढ़ने अनुसंधान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन PHY-1734030 के लिए केंद्र.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 nm fluorescent beads Invitrogen F8795 these are used to measure the blurring function of the microscope
Agarose sigma-Aldrich A9539
Cotton Swab Puritan Medical Products Company LLC S304659 used to appy VaLaP
Cover Slips VWR 16004-302
Fiji ImageJ https://fiji.sc used to cro cells
FM4-64 Invitrogen LST3166 membrane dye used to stain cells
Huygens Software Scientific Volume Imaging Huygens essential or professional Use to measure blurring function of microscope
Lanolin Sigma-Aldrich L7387 combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP
LB growth medium BD Difco DF0446173
M63 medium US Biological M1015
MATLAB Mathworks Needed to run forward convolution scripts
Microscope Slides Fisher 12-550-133
NIS Elements Nkon
Paraffin Sigma-Aldrich 327212
Petroleum Jelly Equate 49035-038-27
Piezo z stage Nikon 77011589
Pipet tips -p200 USA Scientific 1111-0730
Pipet tips- p10 USA Scientific 1111-3730

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References

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सटीक सेलुलर प्रतिनिधित्व और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं के तीन आयामी इमेजिंग
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Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization. J. Vis. Exp. (152), e60350, doi:10.3791/60350 (2019).More

Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization. J. Vis. Exp. (152), e60350, doi:10.3791/60350 (2019).

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