इस प्रोटोकॉल कैसे तैयार करने के लिए और जीने के लिए जीवाणु नमूने माउंट तीन आयामी इमेजिंग और कैसे उन छवियों से ई. कोलाई के तीन आयामी आकार के पुनर्निर्माण के लिए बताते हैं.
जीवाणु का आकार इसके शरीर क्रिया विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है। सेल फिजियोलॉजी के कई पहलुओं जैसे सेल गतिशीलता, predation, और biofilm उत्पादन सेल आकार से प्रभावित किया जा सकता है. जीवाणु कोशिकाओं तीन आयामी (3 डी) वस्तुओं रहे हैं, हालांकि वे शायद ही कभी इस तरह के रूप में इलाज कर रहे हैं. अधिकांश माइक्रोस्कोपी तकनीकों के परिणामस्वरूप दो आयामी (2 डी) छवियों का परिणाम वास्तविक 3 डी सेल आकार और प्रोटीन के स्थानीयकरण से संबंधित डेटा की हानि हो जाती है। कुछ आकार पैरामीटर, जैसे गाऊसी वक्रता (दो प्रमुख वक्रता के उत्पाद), केवल 3 डी में मापा जा सकता है क्योंकि 2 डी छवियों दोनों प्रमुख curvatures उपाय नहीं है. इसके अतिरिक्त, नहीं सभी कोशिकाओं फ्लैट झूठ जब बढ़ते और 2 डी घुमावदार कोशिकाओं की इमेजिंग सही इन कोशिकाओं के आकार का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है. 3 डी में प्रोटीन स्थानीयकरण को मापने से स्थानिक विनियमन और प्रोटीन के समारोह का निर्धारण करने में मदद मिल सकती है। एक आगे कनवल्शन तकनीक विकसित की गई है जो 3 डी सेल आकृतियों के पुनर्निर्माण और प्रोटीन को सही रूप से स्थानीयकृत करने के लिए माइक्रोस्कोप के धुंधला समारोह का उपयोग करती है। यहाँ, तैयार करने और 3 डी में बैक्टीरिया के लाइव सेल इमेजिंग के लिए नमूने बढ़ते दोनों एक सटीक सेल आकार के पुनर्निर्माण के लिए और प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. विधि सरल नमूना तैयारी, फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण, और MATLAB आधारित छवि प्रसंस्करण पर आधारित है. कई उच्च गुणवत्ता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप बस इन माप लेने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इन सेल पुनर्निर्माण computationally गहन कर रहे हैं और उच्च throughput कम्प्यूटेशनल संसाधनों के लिए उपयोग की सिफारिश की है, हालांकि आवश्यक नहीं है. इस विधि को सफलतापूर्वक कई जीवाणु प्रजातियों और उत्परिवर्ती, फ्लोरोसेंट इमेजिंग रूपरेखा, और माइक्रोस्कोप निर्माताओं के लिए लागू किया गया है।
सभी प्रकार के कोशिकाएँ विशिष्ट कार्यों के लिए उनकी आकृतियों को विनियमित करती हैं। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स रक्त कोशिकाओं की तुलना में अलग आकार के होते हैं और विभिन्न कार्य किया है. इसी प्रकार, जीवाणु कोशिकाएं विभिन्न आकारों और आकारों में आती हैं, यद्यपि इन आकृतियों का उद्देश्य हमेशा 1,2ज्ञातनहीं होता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि जीवाणु कोशिकाओं के आकार को सही ढंग से निर्धारित किया जाए। उल्लिखित विधि सबसे लाइव या निश्चित जीवाणु कोशिकाओं के 3 डी विश्लेषण के लिए उपयुक्त डेटा एकत्र करने के लिए एक आसानी से लागू करने का तरीका दिखाती है।
विधि वर्णित एक सही नमूना के 3 डी सेल आकार का प्रतिनिधित्व करने के लिए और ठीक इन आकृतियों के भीतर प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए आदेश में जीवाणु कोशिकाओं के 3 डी छवियों लेने के लिए सक्षम बनाता है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीक 2 डी छवियों को ले, जो समस्याग्रस्त है जब कोशिकाओं है कि असामान्य या nonsymmetrical आकार है, इस तरह के Escherichia कोलाईके उत्परिवर्ती के रूप में अध्ययन, या ऐसे Vibrio हैजे और Helicobacter के रूप में घुमावदार बैक्टीरिया पिलोरी| उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी छवियाँ इस विधि के लिए कुंजी इनपुट हैं, जबकि विधि एक संकल्प-एन्हांस्ड छवि वापस नहीं करता है। इसके बजाय, यह विधि सक्रिय आकृति और सूक्ष्मदर्शी3 (चित्र 1)के स्पष्ट धुंधला फलन का उपयोग करके आगे कनवल्शन एल्गोरिथ्म का उपयोग करके 3D सतह निर्देशांकों और आकार का पुनर्निर्माण करती है। यह ई. कोलाई4,5,6,7, वी हैजा 8में उपन्यास periskeletal तत्व CrvA में जीवाणु actin homolog MreB अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है , और putative हेलिकोबैक्टर पाइलोरी9 मेंबैक्टोफिलिन सी.सी.एम.ए.
प्रोटीन के स्थानीयकरण उनके कार्यों में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. उदाहरण के लिए कोशिका विभाजन में लगे प्रोटीनों को सामान्यतः मध्य कोशिका10,11में स्थानीयबनाया जाता है। जीवाणु के सभी प्रोटीनों को अपने कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की आशा में उच्च-थ्रूपुट अध्ययन किए गएहैं. दुर्भाग्य से, इन अध्ययनों 2 डी इमेजिंग और 1 डी या 2 डी विश्लेषण के साथ प्रदर्शन किया गया, यह असंभव प्रोटीन स्थानीयकरण के विशिष्ट पहलुओं को मापने के लिए कर रही है, इस तरह सेलुलर ज्यामितीय सुविधाओं के लिए स्थानीयकरण के रूप में.
उदाहरण के लिए, MreB, एक गतिशील प्रोटीन कई बैक्टीरिया की छड़ आकार के लिए आवश्यक है, कोशिका दीवार संश्लेषण के स्थानीयकरण निर्देशन द्वारा काम करने के लिए hypothesized है, और इसके स्थानीयकरण सेल दीवार संश्लेषण के स्थानीयकरण दर्पण7,13. कई प्रजातियों से MreB ज्यामितीय संवर्धन4,6,7,14,15से पता चलता है . गतिशील सतह बहुलक, जैसे MreB, समय औसत संवर्धन प्रोफ़ाइल16 करने के लिए सतह की ज्यामिति जोड़ी और झिल्ली17के लिए बाध्यकारी के साथ जुड़े ऊर्जा को कम करके विशिष्ट geometries के लिए उन्मुख करने में सक्षम हो सकता है. जबकि घुमा, बंडलिंग, झुकने, और गतिशीलता के महत्व को पूरी तरह से MreB के लिए हल नहीं किया गया है, यह ध्यान दें कि एक सतह के दोनों प्रमुख curvatures के सटीक माप सेल का एक पूर्ण 3 डी प्रतिनिधित्व की आवश्यकता है महत्वपूर्ण है. इसलिए, सबसे सही curvatures जो प्रोटीन स्थानीयकरण को मापने के लिए, यह 3 डी का उपयोग करने के लिए अधिमानी है, बजाय 2 डी इमेजिंग. 3 डी इमेजिंग computationally उन curvatures जो 2 डी में मापा नहीं जा सकता है का अनुमान लगाने की जरूरत समाप्त, एक अनुमान है कि असममित कोशिकाओं में सही नहीं हो सकताहै 18.
हालांकि कोशिकाओं की 2 डी इमेजिंग तेज है और के रूप में ज्यादा postimaging कम्प्यूटेशनल काम की आवश्यकता नहीं है, 3 डी इमेजिंग सेल का एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, साथ ही इस तरह के वक्रता के रूप में सतह सुविधाओं को मापने की क्षमता, जो 2 डी में नहीं मापा जा सकता है. इसलिए, के रूप में 3 डी इमेजिंग और अधिक आम हो जाता है, सेल आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण में नई अंतर्दृष्टि संभव हो जाएगा.
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम उच्च गुणवत्ता वाले छवियों के अधिग्रहण है. कोशिकाओं को ठीक से पुनर्निर्माण करने के लिए, सेल के ऊपर और नीचे पर्याप्त धुंधला होना चाहिए। इसलिए, यह जरूरी है कि z-स्टैक लिया एक बड़ी पर्याप्त दूरी को शामिल किया गया है. छवि अधिग्रहण के दौरान उठाए गए कदमों की संख्या प्रत्येक तनाव के लिए समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रॉड के लिए नष्ट कर दी गई ई. कोलाई कोशिकाएं व्यापक होती हैं और उन्हें अधिक चरणों की आवश्यकता होती है, और इसलिए, जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में अधिक दूरी होती है। यदि नमूना छवि अधिग्रहण के दौरान drifts, पुनर्निर्माण प्रमुख त्रुटियाँ हो सकती है. इसलिए, स्लाइड को ज़-स्टैक अधिग्रहण के दौरान बहाव से बचने के लिए इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप के साथ थर्मल संतुलन में आने देना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को कम autofluorscence के साथ पैड पर छवि की जानी चाहिए. मीडिया घटकों, जैसे कि आम LB माध्यम में पाए जाने वाले घटकों में ऑटोफ्लोरेसेंस होता है जो कोशिकाओं के पुनर्निर्माण का प्रयास करते समय समस्याएं पैदा कर सकता है. इमेजिंग पैड पर कोशिकाओं का घनत्व महत्वपूर्ण है क्योंकि पुनर्निर्माण की प्रक्रिया प्रत्येक सेल पर स्वतंत्र रूप से किया जाता है. बहुत कम कोशिकाओं को कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी, जबकि बहुत सारे कोशिकाओं इमेजिंग क्षेत्रों है कि आसानी से व्यक्तिगत कोशिकाओं फसल के लिए बहुत घने हैं में परिणाम होगा. क्योंकि सभी कोशिकाओं को ठीक से पुनर्निर्माण नहीं, अतिरिक्त कोशिकाओं के अधिग्रहण कदम के दौरान छवि की जानी चाहिए और सभी outputs सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले जांच की जानी चाहिए (चित्र 3).
इस विधि के लिए सीमाओं के कई तकनीकी हैं. माइक्रोस्कोप पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए, एक एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर है कि एक उद्देश्य होना चाहिए (आमतौर पर gt; 1.4), क्योंकि यह बैक्टीरिया के आकार के पैमाने पर ऑप्टिकल अनुभागीय न्यर्द सक्षम बनाता है. इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप एक piezo चरण है कि z-दिशा में छोटे, सटीक कदम ले जा सकते हैं के साथ सुसज्जित करने की जरूरत है. इसके अलावा, जबकि यह आवश्यक नहीं है, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए उच्च थ्रूपुट अभिकलनीय संसाधनों तक पहुंच अत्यधिक अनुशंसित है क्योंकि यह कोशिकाओं के पुनर्निर्माण के लिए प्रसंस्करण समय को कम कर देगा।
विधि के लिए एक वैचारिक सीमा यह है कि छवियों के संकेत से शोर अनुपात के सापेक्ष पुनर्निर्माण की चिकनाई वजन के लिए सही ऊर्जा तराजू चुना जाना चाहिए. पैरामीटर के एक विकल्प को मान्य करने के लिए, आकार और कोशिकाओं के आकार ऐसे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) के रूप में स्वतंत्र तरीकों का उपयोग कर मापा जाना चाहिए. सिद्धांत के एक सबूत के रूप में, कोशिकाओं के 3 डी पुनर्निर्माण या तो एक AFM पर प्रदर्शन किया गया z-accuracy के लिए परीक्षण करने के लिए (और lt;50 एनएम) या एक TEM ग्रिड पर xy-accuracy के लिए परीक्षण करने के लिए (और lt;30 एनएम)3. इस तरह के एक सहसंबद्ध दृष्टिकोण समय लगता है और महंगा है. एक सरल दृष्टिकोण छवि मानक नमूने जैसे जंगली प्रकार की कोशिकाओं या 1 डिग्री मीटर गोलाकार मोती के लिए हो सकता है. पुनर्निर्माण के व्यास और गोलाकार का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि पुनर्निर्माण में उपयोग किए जाने वाले आकार और ऊर्जा पैमाने सही हैं।
यह एकमात्र तरीका है कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से उच्च संकल्प स्थानिक जानकारी निकालने के लिए करना चाहता है नहीं है। कई समीक्षा लेख सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी24,25के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति का वर्णन . संकल्प बढ़ाने की तकनीक जैसे deconvolution माइक्रोस्कोपी26, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी27, पिक्सेल पुन: असाइन28, और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम)29 के संकल्प में सुधार करने की तलाश माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत चित्र। इन विधियों प्रस्तुत प्रकिया के साथ असंगत नहीं हैं। हाल ही में इस विधि के लिए आदानों9के रूप में सिम आधारित छवियों के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था. जबकि आगे कनवल्शन विधि deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ अपने underpinnings के कुछ शेयरों, यह एक पूरी तरह से अलग उत्पादन किया है. जबकि इस तरह के deconvolution माइक्रोस्कोपी के रूप में दृष्टिकोण छवि के संकल्प में सुधार करने के लिए चाहते हैं, इस दृष्टिकोण एक छवि उत्पन्न नहीं करता है बल्कि लगभग 50 एनएम परिशुद्धता के साथ एक सेल आकार पुनर्निर्माण. विरल लेबल नमूनों के आधार पर एकल अणु सक्रिय नियंत्रण माइक्रोस्कोपी तकनीक इस विधि की तुलना में स्थानिक परिशुद्धता के भी उच्च स्तर प्रदान कर सकते हैं। कई मामलों में, इन एकल अणु दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट constructs के अनुकूलन की आवश्यकता होती है और लंबे समय से अधिग्रहण बार की आवश्यकता कर सकते हैं, उन्हें जीना या गतिशील नमूने के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल बना. इन विधियों में से प्रत्येक एक या अधिक चेतावनी है कि इस विधि नहीं करता है के साथ आता है. उदाहरण के लिए, डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा विज्ञापित लाभ के रूप में जीवाणु कोशिकाओं के monolayers के लिए लागू नहीं हैं, जहां विमान प्रकाश से बाहर ज्यादा नहीं है. इसके अलावा, इस विधि किसी भी विशेष fluorores की आवश्यकता के बिना सटीक 3 डी सेल आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण प्राप्त करने के लिए एक पाइप लाइन प्रदान करता है। इस विधि में न्यूनतम हार्डवेयर आवश्यकताएं हैं (यानी, z piezo, उच्च NA उद्देश्य) और केवल प्रति timepoint छवियों के दसियों की आवश्यकता है, एक आसानी से गतिशील 3 डी संरचनाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है6.
3 डी संरचनाओं में जीवाणु कोशिकाओं के संगठन का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण की संख्या में वृद्धि हुई है। इनमें संकल्पनात्मक दृष्टिकोण भी शामिल हैं जो उच्च गुणवत्ता , 3 डी फ्लोरोसेंट छवियों30,31,32का लाभ उठाते हैं . इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से अलग कोशिकाओं की आवश्यकता है और सेलुलर ज्यामिति के बारे में कोई एक प्राथमिकता मान्यताओं बनाता है. तथापि, सघन कोशिकीय समुच्चय अथवा जैव-फिल्मों में जाने के लिए कोशिकाओं को छड़ की तरह माना जाता है। यह कम संकल्प दृश्य अभी भी कोशिकाओं की पैकिंग व्यवस्था की जांच में सक्षम बनाता है, हालांकि biofilm में कोशिकाओं के उच्च घनत्व विशिष्ट कारकों के subcellular स्थानीयकरण के विश्लेषण को रोकता है.
भविष्य में, यह इस 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक के साथ एकल अणु और व्यापक क्षेत्र दृष्टिकोण को एकीकृत करने के लिए एक रूपरेखा विकसित करने के लिए दिलचस्प हो सकता है. इसके अलावा, अधिक घने सेल समूहों के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए मशीन दृष्टि विभाजन उपकरण32 के साथ इस आगे कनवल्शन दृष्टिकोण को शामिल करना संभव हो सकता है।
क्यों कोशिकाओं विशिष्ट आकार में विकसित एक जटिल मुद्दा है कि जटिल वातावरण में वे रहते हैं प्रतिबिंबित करना चाहिए है. विकास और सेल आकार के समारोह को समझना उन आकृतियों का सटीक और सटीक माप लेने की आवश्यकता है, जो है कि इस विधि क्या प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
हम इस विधि को विकसित करने में मदद करने के लिए Jeffrey Nguyen और यहोशू Shaevitz शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
अनुदान: RMM – NIH F32 GM103290-01A1, BPB – ग्लेन उम्र बढ़ने अनुसंधान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन PHY-1734030 के लिए केंद्र.
50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
M63 medium | US Biological | M1015 | |
MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
NIS Elements | Nkon | ||
Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |