Questo protocollo spiega come preparare e montare campioni batterici per l’imaging tridimensionale dal vivo e come ricostruire la forma tridimensionale di E. coli da queste immagini.
La forma di un batterio è importante per la sua fisiologia. Molti aspetti della fisiologia cellulare come la motilità cellulare, la predazione e la produzione di biofilm possono essere influenzati dalla forma delle cellule. Le cellule batteriche sono oggetti tridimensionali (3D), anche se raramente sono trattati come tali. La maggior parte delle tecniche di microscopia genera immagini bidimensionali (2D) che portano alla perdita di dati relativi alla forma effettiva delle cellule 3D e alla localizzazione delle proteine. Alcuni parametri di forma, come la curvatura gaussiana (il prodotto delle due curvature principali), possono essere misurati solo in 3D perché le immagini 2D non misurano entrambe le curvature principali. Inoltre, non tutte le celle sono piatte durante il montaggio e l’imaging 2D di celle curve potrebbe non rappresentare con precisione le forme di queste cellule. Misurare accuratamente la localizzazione delle proteine in 3D può aiutare a determinare la regolazione spaziale e la funzione delle proteine. È stata sviluppata una tecnica di convoluzione in avanti che utilizza la funzione di sfocatura del microscopio per ricostruire le forme delle cellule 3D e per localizzare con precisione le proteine. Qui, viene descritto un protocollo per la preparazione e il montaggio di campioni per l’imaging di cellule vive di batteri in 3D sia per ricostruire una forma cellulare accurata che per localizzare le proteine. Il metodo si basa su una semplice preparazione di campioni, sull’acquisizione di immagini fluorescenti e sull’elaborazione delle immagini basata su MATLAB. Molti microscopi fluorescenti di alta qualità possono essere semplicemente modificati per prendere queste misure. Queste ricostruzioni cellulari sono computazionalmente intensive e l’accesso a risorse computazionali ad alto throughput è raccomandato, anche se non è necessario. Questo metodo è stato applicato con successo a più specie batteriche e mutanti, modalità di imaging fluorescente e produttori di microscopi.
Le celle di tutti i tipi regolano le loro forme per funzioni specifiche. Per esempio, i neuroni sono modellati in modo diverso rispetto alle cellule del sangue e hanno funzioni diverse. Allo stesso modo, le cellule batteriche sono disponibili in una varietà di forme e dimensioni, anche se lo scopo di queste forme non è sempre noto1,2. Pertanto, è importante che la forma delle cellule batteriche sia determinata con precisione. Il metodo delineato mostra un modo facilmente implementato per raccogliere dati adatti per l’analisi 3D della maggior parte delle cellule batteriche vive o fisse.
Il metodo descritto consente di scattare immagini 3D di cellule batteriche per rappresentare con precisione la forma delle cellule 3D del campione e localizzare con precisione le proteine all’interno di queste forme. Le tecniche di microscopia tradizionali prendono immagini 2D, il che è problematico quando si studiano cellule che hanno forme anormali o non simmetriche, come mutanti di Escherichia coli, o batteri curvi come Vibrio cholerae e Helicobacter pylori. Mentre le immagini 3D ad alta risoluzione sono l’input chiave di questo metodo, il metodo non restituisce un’immagine con risoluzione avanzata. Piuttosto, questo metodo ricostruisce le coordinate della superficie 3D e la forma della cella utilizzando un algoritmo di convoluzione in avanti utilizzando contorni attivi e l’apparente funzione di sfocatura del microscopio3 (Figura 1). E ‘stato utilizzato per studiare l’atto batterico omolog MreB in E. coli4,5,6,7, il nuovo elemento periskeletale CrvA in V. colerae8, e il putativo bactofilin CcmA in Helicobacter pylori9 (Figura 2).
La localizzazione delle proteine può dare una visione delle loro funzioni. Ad esempio, le proteine coinvolte nella divisione cellulare sono normalmente localizzate alla cella media10,11. Sono stati intrapresi studi ad alto contenuto di velocità sono stati intrapresi per localizzare tutte le proteine di un batterio nella speranza di ottenere informazioni sulle loro funzioni12. Sfortunatamente, questi studi sono stati eseguiti con imaging 2D e analisi 1D o 2D, rendendo impossibile misurare aspetti specifici della localizzazione delle proteine, come la localizzazione alle caratteristiche geometriche cellulari.
Ad esempio, MreB, una proteina dinamica necessaria per la forma dell’asta di molti batteri, è ipotizzata per indirizzare la localizzazione della sintesi della parete cellulare, e la sua localizzazione rispecchia la localizzazione della sintesi della parete cellulare7,13. MreB da più specie mostra arricchimento geometrico4,6,7,14,15. I polimeri di superficie dinamici, come MreB, possono accoppiare la geometria della superficie al profilo di arricchimento mediotempo 16 e possono essere in grado di orientarsi a geometrie specifiche minimizzando l’energia associata al legame alla membrana17. Mentre l’importanza della torsione, dell’aggregazione, della piegatura e della dinamica non è stata completamente risolta per MreB, è importante notare che misurazioni accurate di entrambe le curvature principali di una superficie richiedono una rappresentazione 3D completa della cella. Pertanto, per misurare in modo più accurato le curve a cui le proteine si localizzano, è preferibile utilizzare l’imaging 3D, piuttosto che 2D. L’imaging 3D elimina la necessità di stimare computazionalmente quelle curvature che non possono essere misurate in 2D, una stima che potrebbe non essere accurata nelle cellule asimmetriche18.
Sebbene l’imaging 2D delle cellule sia più rapido e non richieda tanto lavoro computazionale di postimaging, l’imaging 3D fornisce una rappresentazione più accurata della cella, nonché la capacità di misurare le caratteristiche superficiali, come la curvatura, che non può essere misurata in 2D. Pertanto, man mano che l’imaging 3D diventa più comune, nuove intuizioni sulla forma delle cellule e sulla localizzazione delle proteine diventeranno possibili.
Un passaggio critico in questo protocollo è l’acquisizione di immagini di alta qualità. Per ricostruire correttamente le cellule, ci deve essere abbastanza sfocatura sopra e sotto la cellula. Pertanto, è imperativo che lo z-stack preso copre una distanza sufficientemente grande. Il numero di passi effettuati durante l’acquisizione dell’immagine può essere regolato per ogni deformazione. Ad esempio, le cellule E. coli cancellate per l’asta sono più larghe e richiedono più passaggi e, di conseguenza, una distanza maggiore rispetto alle cellule di tipo selvatico. Se il campione si sposta durante l’acquisizione dell’immagine, la ricostruzione può avere errori gravi. Pertanto, è importante lasciare che la diapositiva arrivi all’equilibrio termico con il microscopio prima dell’imaging per evitare deriva durante l’acquisizione dello z-stack. Le celle devono essere visualizzate su rilievi con bassa autofluorescenza. I componenti multimediali, come quelli che si trovano nel comune supporto LB, hanno autofluorescenza che può causare problemi quando si tenta di ricostruire le cellule. La densità delle cellule sul pad di imaging è importante perché il processo di ricostruzione viene eseguito in modo indipendente su ogni cellula. Troppo poche cellule aumenteranno il tempo necessario per ottenere immagini di un numero sufficiente di cellule, mentre troppe cellule si tradurranno in campi di imaging troppo densi per ritagliare facilmente singole cellule. Poiché non tutte le cellule vengono ricostruite correttamente, le celle aggiuntive devono essere visualizzate durante la fase di acquisizione e tutte le uscite devono essere esaminate prima di procedere con l’analisi statistica (Figura 3).
Molte delle limitazioni per questo metodo sono tecniche. Sul microscopio da utilizzare, si deve avere un obiettivo che ha un’alta apertura numerica (in genere >1.4), perché questo consente la sezionamento ottico sulla scala delle dimensioni dei batteri. Inoltre, il microscopio deve essere dotato di uno stadio piezo che può fare piccoli e precisi passi nella direzione z. Inoltre, anche se non è necessario, l’accesso alle risorse di calcolo ad alta velocità effettiva per eseguire il software di analisi delle immagini è altamente raccomandato perché ridurrà il tempo di elaborazione per ricostruire le celle.
Una limitazione concettuale al metodo è che devono essere scelte le scale di energia corrette per ponderare la levigatezza della ricostruzione rispetto al rapporto segnale-rumore delle immagini. Per convalidare una scelta di parametri, le dimensioni e le forme delle cellule devono essere misurate utilizzando metodi indipendenti come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o la microscopia a forza atomica (AFM). Come prova di principio, le ricostruzioni 3D delle celle sono state eseguite su un’AFM per verificare la precisione z (<50 nm) o su una griglia TEM per verificare la precisione xy (<30 nm)3. Un approccio così correlato richiede molto tempo e denaro. Un approccio più semplice può essere quello di immagini di campioni standard come celle di tipo selvaggio o 1 m di perline sferiche. Il diametro e la sferità delle ricostruzioni possono essere utilizzati per garantire che le dimensioni e le scale energetiche utilizzate nella ricostruzione siano corrette.
Questo non è l’unico metodo che cerca di estrarre informazioni spaziali ad alta risoluzione dalle immagini di microscopia a fluorescenza. Molti articoli di revisione descrivono i recenti progressi nel campo della microscopia a super-risoluzione24,25. Tecniche di miglioramento della risoluzione come la microscopia di deconvoluzione26, la microscopia confocale del disco rotante27, la riassegnazione dei pixel28e la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM)29 cercano di migliorare la risoluzione del immagini acquisite dal microscopio. Questi metodi non sono incompatibili con l’approccio presentato. Recentemente questo metodo è stato adattato per consentire immagini basate su SIM come ingressi9. Mentre il metodo di convoluzione in avanti condivide alcune delle sue basi con la microscopia di deconvoluzione, ha un output completamente diverso. Mentre approcci come la microscopia di deconvoluzione cercano di migliorare la risoluzione dell’immagine, questo approccio non genera un’immagine, ma piuttosto una ricostruzione della forma cellulare con una precisione di circa 50 nm. Tecniche di microscopia a controllo attivo a singola molecola basate su campioni scarsamente etichettati possono fornire livelli ancora più elevati di precisione spaziale rispetto a questo metodo. In molti casi, questi approcci a singola molecola richiedono l’ottimizzazione dei costrutti fluorescenti e possono richiedere lunghi tempi di acquisizione, rendendoli difficili da usare con campioni vivi o dinamici. Ognuno di questi metodi viene fornito con uno o più avvertimenti che questo metodo non. Ad esempio, i benefici pubblicizzati dalla microscopia confocale del disco rotante non sono applicabili ai monostrati di cellule batteriche, dove non c’è molta luce fuori dalla luce del piano. Inoltre, questo metodo fornisce una pipeline per acquisire forme cellulari 3D accurate e localizzazione delle proteine senza la necessità di fluorofori specializzati. Questo metodo ha requisiti hardware minimi (ad esempio, z piezo, obiettivo NA elevato) e richiede solo decine di immagini per punto temporale, consentendo di esaminare facilmente le strutture 3D dinamiche6 .
Ci sono stati un numero crescente di approcci per studiare l’organizzazione delle cellule batteriche in strutture 3D. Questi includono approcci concettualmente simili a questo che sfruttano le immagini di alta qualità, a fluorescenza 3D30,31,32. Questo approccio richiede cellule ben isolate e non fa supposizioni a priori sulla geometria cellulare. Tuttavia, per passare ad aggregati cellulari densi o biofilm, si presume che le cellule siano simili ad aste. Questa visione a bassa risoluzione consente ancora di studiare le disposizioni di imballaggio delle cellule, anche se l’alta densità di cellule nel biofilm impedisce l’analisi della localizzazione subcellulare di fattori specifici.
In futuro, potrebbe essere interessante sviluppare un quadro per integrare la singola molecola e gli approcci ad ampio campo con questa tecnica di ricostruzione 3D. Inoltre, potrebbe essere possibile includere questo approccio di convoluzione in avanti con gli strumenti di segmentazione della visione artificiale32 per consentire ricostruzioni di ammassi cellulari più densi.
Perché le cellule si sono evolute in forme specifiche è una questione complessa che deve riflettere l’ambiente complesso in cui vivono. Comprendere l’evoluzione e la funzione delle forme cellulari richiede di prendere misure precise e accurate di quelle forme, che è ciò che questo metodo fornisce.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Jeffrey Nguyen e Joshua Shaevitz per aver contribuito a sviluppare questo metodo.
Finanziamento: RMM – NIH F32 GM103290-01A1, BPB – Glenn Centers for Aging Research and National Science Foundation PHY-1734030.
50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
M63 medium | US Biological | M1015 | |
MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
NIS Elements | Nkon | ||
Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |