Summary
Denne protokollen forklarer hvordan å forberede og montere bakterielle prøver for Live tredimensjonal Imaging og hvordan å rekonstruere den tredimensjonale formen av E. coli fra disse bildene.
Abstract
Formen på en bakterie er viktig for sin fysiologi. Mange aspekter av celle fysiologi som celle motilitet, predasjon, og biofilm produksjon kan påvirkes av celle form. Bakterielle celler er tredimensjonale (3D) objekter, selv om de sjelden behandles som sådan. De fleste mikroskopi teknikker resulterer i todimensjonale (2D) bilder som fører til tap av data knyttet til den faktiske 3D-celle form og lokalisering av proteiner. Visse form parametre, slik som Gaussian krumning (produktet av de to viktigste kurvaturer), kan bare måles i 3D fordi 2D-bilder ikke måler begge de viktigste kurvaturer. I tillegg, ikke alle celler ligge flatt når montering og 2D Imaging av buede celler kan ikke nøyaktig representerer figurer av disse cellene. Nøyaktig måling av protein lokalisering i 3D kan bidra til å bestemme romlig regulering og funksjon av proteiner. En framover convolution teknikk er utviklet som bruker uskarphet funksjon av mikroskopet til å rekonstruere 3D celle former og å nøyaktig lokalisere proteiner. Her er en protokoll for utarbeidelse og montering av prøver for levende celle bilde av bakterier i 3D både for å rekonstruere en nøyaktig celle form og lokalisere proteiner er beskrevet. Metoden er basert på enkle prøve forberedelser, fluorescerende bildeoppkjøp og MATLAB-basert bildebehandling. Mange høykvalitets fluorescerende mikroskop kan enkelt modifiseres for å ta disse målingene. Disse celle rekonstruksjoner er beregningsmessig intensive og tilgang til høy gjennomstrømming beregningsressurser er anbefalt, men ikke nødvendig. Denne metoden har blitt brukt på flere bakterielle arter og mutanter, fluorescerende Imaging modaliteter, og mikroskop produsenter.
Introduction
Celler av alle typer regulerer sine figurer for bestemte funksjoner. For eksempel er neurons formet annerledes enn blodlegemer og har ulike funksjoner. På samme måte kommer bakterieceller i en rekke former og størrelser, selv om hensikten med disse formene ikke alltid er kjent som1,2. Derfor er det viktig at formen på bakterielle celler være nøyaktig bestemmes. Metoden skissert viser en lett implementert måte å samle inn data som passer for 3D-analyse av de fleste levende eller faste bakterielle celler.
Metoden beskrevet gjør det mulig å ta 3D-bilder av bakterielle celler for å nøyaktig representere 3D celle form av prøven og til nøyaktig lokalisere proteiner innenfor disse formene. Tradisjonelle mikroskopi teknikker tar 2D-bilder, noe som er problematisk når man studerer celler som har unormale eller nonsymmetrical former, slik som mutanter av Escherichia coli, eller buede bakterier som Vibrio cholerae og Helicobacter og pylori. Mens høyoppløselige 3D-bilder er nøkkelen input til denne metoden, returnerer metoden ikke en oppløsning-forbedret bilde. Denne metoden rekonstruerer 3D-koordinatene og formen på cellen ved hjelp av en fremover convolution algoritme som bruker aktive konturer og den tilsynelatende uskarpe funksjonen til mikroskopet3 (figur 1). Det har blitt brukt til å studere bakteriell utgangen homologe MreB i E. coli4,5,6,7, romanen periskeletal element CrvA i V. cholerae8, og antatte bactofilin CcmA i Helicobacter pylori9 (figur 2).
Lokalisering av proteiner kan gi innsikt i sine funksjoner. For eksempel er proteiner som er involvert i celledeling, vanligvis lokalisert til midcell10,11. Studier med høy gjennomstrømming har blitt gjennomført for å lokalisere alle proteiner av en bakterie i håp om å få innsikt i sine funksjoner12. Dessverre ble disse studiene utført med 2D-avbildning og 1D-eller 2D-analyse, noe som gjør det umulig å måle spesifikke aspekter ved protein lokalisering, for eksempel lokalisering til cellulære geometriske funksjoner.
For eksempel, MreB, en dynamisk protein som kreves for stangen form av mange bakterier, er hypotetisk gjennomsnitt å arbeide ved å dirigere lokalisering av celle veggen syntese, og lokalisering speil lokalisering av celle veggen syntese7,13. MreB fra flere arter viser geometrisk berikelse4,6,7,14,15. Dynamisk overflate polymerer, slik som MreB, kan par geometrien av overflaten til den tiden gjennomsnitt berikelse profil16 og kan være i stand til å orientere til bestemte geometri ved å minimere energien forbundet med binding til membranen17. Mens viktigheten av vridning, bunting, bøying og dynamikk ikke har vært helt løst for MreB, er det viktig å merke seg at nøyaktige målinger av både rektor kurvaturer av en overflate krever en full 3D representasjon av cellen. Derfor, for å mest nøyaktig måle kurvaturer som proteiner lokalisere, er det fortrinnsrett til å bruke 3D, snarere enn 2D Imaging. 3D Imaging eliminerer behovet for å beregningsmessig anslå de kurvaturer som ikke kan måles i 2D, et anslag som kanskje ikke er nøyaktig i asymmetriske celler18.
Selv om 2D-avbildning av celler er raskere og ikke krever så mye postimaging beregningsorientert arbeid, gir 3D-avbildning en mer nøyaktig representasjon av cellen, i tillegg til evnen til å måle overflate funksjoner, for eksempel krumning, som ikke kan måles i 2D. Derfor, som 3D Imaging blir mer vanlig, ny innsikt i celle form og protein lokalisering vil bli mulig.
Protocol
1. prøveforberedelse
- Gjør E. coli fluorescerende for bildebehandling enten ved å konstruere dem til å uttrykke en cytoplasmatiske fluorescerende protein6 eller ved hjelp av en membran fargestoff5. Andre bakterielle arter kan brukes i stedet for E. coli.
- Transformer celler via electroporation med en plasmider som koder cytoplasmatiske mCherry fluorescerende protein.
Merk: Ulike fluorescerende proteiner av andre farger kan brukes. - Vokse transformants på en LB plate med riktig antibiotika ved 37 ° c. Skaff deg enkelt kolonier og Identifiser positive kloner etter mikroskopi. Antibiotika resistente kolonier som vises rødt under mikroskopet inneholder plasmider bærer mCherry.
- Transformer celler via electroporation med en plasmider som koder cytoplasmatiske mCherry fluorescerende protein.
- Grow 2 mL av natten kulturen i LB flytende Media med riktig antibiotika ved 37 ° c i en risting inkubator. Bruk enten en koloni fra en tallerken eller en liten mengde av en fryseboks lager som inokulum.
Merk: Bruk mediene som er nødvendige for Bakteriecellene som er valgt for eksperimentet. - Under kultur den over natten kulturen 1:1000 i 5 mL av ferske LB Media og la cellene vokse til eksponentiell fase ved 37 ° c i en risting inkubator for 3-4 h. mål OD600 av cellene for å bekrefte at de er i eksponentiell fase (dvs. , OD600 = 0,2 − 0.4).
Merk: Imaging kan utføres i alle vekst trinn avhengig av eksperimentet som utføres.
2. klargjøring av lysbilde
Merk: Det er viktig å bruke medier som har lav autofluorescence. Ethvert medium som har lav autofluorescence kan brukes. I dette eksperimentet kreves 1% agarose M63 minimale medie puter og forsegling med VaLaP19 for å avbilde celler i 3D.
-
Forbered en 1% løsning av agarose i 20 mL minimal Media.
- Mikrobølgeovn løsningen til agarose er helt oppløst og løsningen vises klar.
- Oppbevar løsningen i et vannbad på 60 ° c til den er klar til bruk.
Merk: Denne løsningen kan være befestet og smeltet etter behov eller kan aliquoted i mindre mengder som er smeltet etter behov. Etter flere bruksområder kan mediene bli misfarget og bør skiftes ut.
- Smelt VaLaP tetningsmasse på en kokeplate ved 80 − 100 ° c.
Merk: Forbered VaLaP, som skal brukes som tetningsmiddel, ved å smelte 50 g hver av vaselin, lanolin og parafin sammen i et beger på en varm plate ved 80 − 100 ° c. Denne store mengden VaLaP kan lagres ved romtemperatur på ubestemt tid og vil være nok for > 500 lysbilder. Oppvarming ved > 100 ° c vil føre til dårligere, og fargen vil bli mørkere. - Plasser to stabler hver på 3 20 mm x 20 mm deksel slips på den motsatte enden av et lysbilde (seks totalt coverslips).
- Pipetter 200 μL av agarose pad-løsning på lysbildet.
Merk: Hvis ikke bruker en konstruert fluorescerende beis, en membran fargestoff kan legges til agarose pad løsningen før dette trinnet. Resuspend fargestoffet i vann og tilsett fargestoff til 1 mL av agarose pad løsningen til en endelig konsentrasjon på 5 μg/mL. - Umiddelbart og fast sted en andre skyver ned på bunken av dekselet slips å flate agar og la det stivne i 1 min ved romtemperatur.
- Skyv forsiktig av det øverste lysbildet.
- Bruk den store enden av 200 μL pipette for å skjære ut individuelle puter fra gelen (~ 5 mm i diameter) på lysbildet og forkaste misformet eller unødvendig gel.
Merk: Hvis Imaging flere belastninger eller forhold, en egen pute vil være nødvendig for hver enkelt. Hvis bare én stamme skal bli avbildet, må du lage 3 − 4 pads for å støtte dekkglass. - Pipetter celler opp og ned flere ganger for å forstyrre celle klumper og sikre at kulturen er godt blandet. Pipetter 1 μL av under kultur fra trinn 1,3 på en pute.
Merk: Celle figur rekonstruksjoner krever individuelle celler som ikke berører andre celler. Hvis du bruker stasjonær fase eller høy celle tetthet kulturer, kan det være nødvendig å fortynne prøven 1:10 før du plasserer den på puten. - La prøve luften tørke i 5 − 10 min. Sørg for at dråpe er fullstendig absorbert inn i puten. Hvis noen væske er igjen, vil cellene bevege seg rundt i væsken og kan ikke bli avbildet.
- Plasser en cover slip på toppen av putene.
- Forsegle dekselet slip med smeltet VaLaP ved forsiktig børsting rundt kanten av dekselet slip med en bomullsdott. Sørg for å holde den borte fra toppen av dekselet slip der målet vil berøre. Den VaLaP vil stivne i løpet av sekunder, tetting prøven.
- Umiddelbart image prøven.
Merk: Prøven skal være avbildet så snart lysbildet er klargjort. Cellene kan vokse på pads, og hvis de deler rekonstruksjoner vil bli vanskeligere.
3. ImagingRequirements
- Sørg for at z-eller fokuserings aksen i mikroskopet kan foreta presise bevegelser på mindre enn 50 NM. Bruk z piezo stadier (se tabell over materialer), tilgjengelig på forskning grade mikroskop, fordi typiske motoriserte fokus enheter ikke kan gi denne presisjonen.
Merk: Forutsatt at Nyquist-Shannon prøvetaking kriterium20, må man ha muligheten til å flytte 0,5 x den minste ønskede trinn størrelse, eller 2x ønsket romlig frekvens. For 100 NM trinnene som trengs i denne protokollen, en scene med en presisjon på 50 NM eller mindre er nødvendig. -
Sørg for at mikroskopet inneholder et 100-mål med minimum numerisk blenderåpning (NA) på 1,45.
- Samle z-stabler av mellom 200 − 400 forskjellige celler for å sikre at nok celler er oppnådd for nedstrøms applikasjoner.
Merk: Antallet celler som trengs, avhenger av den underliggende variasjonen i utvalget av interesse. Noen av cellene som samles på dette punktet vil ikke gjøre det gjennom gjenoppbygging trinnene.
- Samle z-stabler av mellom 200 − 400 forskjellige celler for å sikre at nok celler er oppnådd for nedstrøms applikasjoner.
- Kontroller at z-stakken samsvarer med innstillingene som brukes for figuren kanal hvis en sekundær fluorescerende kanal (protein, metabolsk etikett, etc.) måles.
4. bildebehandling
- Sett det forseglede lysbildet inn i mikroskopet og la det sitte i 5 min for å likevekt temperaturen med omgivelsene, fordi mikroskop rommet kan ha en annen temperatur enn testrommet.
-
Ta en fluorescerende z-stabel av prøven.
Merk: z-stakken skal fullstendig dekke prøven med en z-avstand som er mindre enn dybdeskarpheten. For en 1,45 NA 100% objektiv og ~ 1 μm tykke E. coli celler, 40 trinn på 100 NM per trinn fungerer godt. For større celler eller celler som ikke ligger helt flatt på overflaten, kan 50 eller flere trinn være nødvendig. Ta med nok trinn, og sørg for at prøven er fullstendig uskarp over og under.- Bruk programvaren som er knyttet til mikroskopet (se tabell over materialer) for å kontrollere mikroskopet.
- Fokuser på midten av cellen ved hjelp av fokus hjulene på mikroskopet. Under nd oppkjøp sjekk z-boksen til å ta en Z-stack. Klikk på hjem -knappen for å sette midten av cellen som utgangspunkt. Sett trinn størrelsen til 0,1 μm og sett området til 4 μm. Kontroller at Z-enheten er satt til piezo stadiet.
- Still inn fluorescerende kanaler under lambda-vinduet til innstillingene for de fluorescerende molekylene som blir avbildet. I dette eksperimentet GFP og mCherry ble brukt.
Merk: Ta en ekstra z-stabel med samme trinn størrelse og rekkevidde i den andre fargekanalen hvis 3D-distribusjonen av en ekstra fluorescerende kanal er ønsket. I dette eksperimentet ble cytoplasmatiske mCherry brukt til å bestemme celle form og MreB-GFP ble brukt som en andre fargekanal21. - Kontroller at rekkefølgen for eksperimentet er satt til lambda (z-serie), slik at det tar en fullstendig z-stabel i hver fargekanal før du bytter.
- Klikk på Kjør nå for å starte bilde anskaffelsen og lagre filen onece én eller begge z-stakker er fullført.
- Flytt til et nytt område på puten og gjenta trinn 4.2.2-4.2.5.
5. celle rekonstruksjon
- Beskjær enkeltceller og lagre bildene som en stablet TIFF-fil, slik at det bare er én celle per fil. Sørg for at denne cellen er godt isolert fra andre celler (dvs. omtrent 5x den full-bredde halv-maksimum av uskarphet funksjon i XY.
Merk: dette kan gjøres ved hjelp av fritt tilgjengelig bildeanalyse programvare (se tabell over materialer).- Tegn en boks rundt en enkelt celle, og Dupliser cellen 2x, én gang for hver kanal. Kontroller at det er merket av for duplikat hyperstack boksen, og endre kanalen til enten 1 eller 2, og pass på at sektorene inneholder hele z-stakken.
Merk: Hvis Imaging bare formen på cellene og ikke et ekstra fluorescerende protein, bare én kanal vil være til stede. - Når begge stabler er tilgjengelige gå til bilder | Stabler | Verktøy | Sammenkoble å kombinere bildene med proteinet kanalen først og figuren kanalen andre.
- Lagre det nye bildet som en TIFF-fil.
- Tegn en boks rundt en enkelt celle, og Dupliser cellen 2x, én gang for hver kanal. Kontroller at det er merket av for duplikat hyperstack boksen, og endre kanalen til enten 1 eller 2, og pass på at sektorene inneholder hele z-stakken.
- Mål uskarphet funksjon av mikroskopet ved hjelp av subdiffraction begrenset fluorescerende perler22. Dette må gjøres for hvert mikroskop og mikroskop objektiv, men kan utføres før eller etter Imaging de prøver av interesse.
- Gjennomsnitt sammen flere uavhengige perler med noen manuelle inngrep ved hjelp av tilgjengelig programvare (se tabell over materialer).
Merk: Det endelige produktet bør være et 3D-bilde av uskarphet funksjon med samme XYZ avstand som prøver av interesse.
- Gjennomsnitt sammen flere uavhengige perler med noen manuelle inngrep ved hjelp av tilgjengelig programvare (se tabell over materialer).
- Kjør videre convolution celle form rekonstruksjon skript ved hjelp av tilgjengelig programvare. Den nyeste versjonen av disse skriptene kan fritt lastes ned fra https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
- Lag en mappe i en mappe på skrivebordet som inneholder de beskjæres bildene og cell_shape_settings_tri. txt -filen fra Shae-cellshape-Public/exampleData_tri.
- Rediger cell_shape_setting_tri. txt å ha de riktige innstillingene for eksperimentet av interesse. For dette eksperimentet inneholder innstillingsfilen følgende linjer:
nm_per_pixel 70
Z_scale 0,65
stack_z_size 41
stack_t_size 1
Fstack_z_size 41
Fstack_t_size 1
stack_seperation_nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript-999 osuPSF20180726
gradering 1
Merk: Denne tekstfilen er ordnet i inndelinger, og hver inndeling analyseres til sin egen variabel. Mens mange av innstillingene ikke trenger å bli endret fra eksperiment til eksperiment, bør man sørge for at størrelsen på z-stakken (stack_z_size for form, Fstack_z_size for protein av interesse), avstand av z-stakken (stack_seperation_ NM, Fstack_seperation_nm), relativ fokal forskyvning av mikroskopet (Z_scale)23, pikselstørrelsen i xy (nm_per_pixel), og navnet på skriptet som laster uskarphet funksjonen til mikroskopet (psfScript ) samsvarer med eksperimentet. Gradient -feltet bør settes til 1 Hvis figuren kanalen er cytoplasmically fylt og 0 hvis det er en membran-farget objekt. - Kjør Cell_shape_detector3dConvTriFolder -funksjonen (Shae-cellshape-Public/CellShapeDetectorTri/) med strengen til mappeplasseringen etterfulgt av nummeret på cellen som skal begynne, og antall celler du vil kjøre.
Merk: Et eksempel på innspill vil se slik ut: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (' bane til mappe med beskjæres bilder ', starter indeksen i mappen, # av celler). En typisk celle kan ta mellom 5 − 20 min for gjenoppbyggingen til sammen og avslutte.
- Screen cellen rekonstruksjoner for å sikre at de er riktige før du bruker cellene for en statistisk analyse.
- Løpe ScreenFits (Shae-cellshape-offentligheten/Shae-fitViewerGui/) å synlig skjermen individ cellen rekonstruksjoner.
- Klikk på Velg mappe-knappen når det grafiske brukergrensesnittet (GUI) åpnes, og velg deretter mappen med gjenoppbyggings datafiler (TRI. mat) opprettet i trinn 5,3.
- Merk av i boksen ved siden av celle gjenoppbyggingen hvis en celle vises misdannede eller ikke helt sammen (Figur 3). Dette kan se ut som en celle med et hull, en flat side, eller en gren som kommer ut av det. Dette vil tilføye "flagg" til filnavnet slik at det kan utelukkes fra alle nedstrøms analyse.
Merk: Den rekonstruert celle kan sammenlignes med de opprinnelige bildene. Dette kan være spesielt viktig hvis cellene kommer fra en ulike heterogene populasjon av figurer.
- Kjør enrichmentSmoothingSpline (Shae-cellshape-Public/) for å skape en berikelse profil av den relative konsentrasjonen av protein av interesse som en funksjon av Gaussian krumning på overflaten.
- Velg hver mappe med TRI. mat-filer som er opprettet i trinn 5.3.3.
- Velge det ny-skapt (5.5.1) kurven. mat arkiv.
Merk: En kurve. mat-fil vil bli opprettet for hver mappe som ble valgt i 5.5.1. Alle de berikelse profilene vil bli presentert på en graf. Hvis det kreves individuelle grafer enn kjøre 5,5 for hver mappe.
Merk: I tillegg til presis geometrisk lokalisering av et fluorescerende protein, er det mange andre måter å analysere data fra den sekundære kanalen, inkludert telling av antall, størrelse og orientering av objekter4.
Representative Results
Bakterier kommer i en rekke former og størrelser som kan bestemme deres funksjoner i naturen1. Utfallet av denne fremgangsmåte er en akkurat 3D representasjon av celler fra det videresende convolution av en z-stabel av profilen (skikkelsen 1). Denne metoden er spesielt viktig når du arbeider med buede celler (figur 2), eller med unormalt formede celler (Figur 4A), som en 2D-representasjon ikke reflekterer krumning av cellene nøyaktig. For å bruke Forward convolution metode (figur 1A), celler må enten perifert beiset eller har en cytoplasmatiske beis (figur 2B venstre vs. høyre).
Figur 4 viser MreB lokalisering i cellen. En GFP fusjon ble gjort til bakteriell utgangen protein MreB21 for å studere sin presise lokalisering i både vill og mutert E. coli celler4. Fordi MreB er knyttet til membranen, er 3D-avbildning nødvendig for å gjengi sin posisjon i cellen. Ved å gjøre disse målingene i 3D, var vi i stand til å rekonstruere formene av både vill og rodZ mutant celler (Figur 4A). Lokalisering av MreB ble vist å være beriket ved små Gaussian kurvaturer, en geometrisk funksjon som bare kan måles i 3D, i en RodZ avhengig måte (Figur 4B).
Figur 1: Videresend convolution metode rekonstruerer celler uten forkunnskaper av celle form. (A) det endelige resultatet av metoden er en 3D-celle rekonstruksjon avledet ved å sammenligne en test form med kalibrert uskarphet funksjon av mikroskopet. Dette sammenlignes med den observerte z-stakken inntil det observerte 3D-bildet samsvarer med den hypotetiske en. Bildet som vises her er en gjengivelse av gjenoppbyggingen av en C. crescentus celle. (B) gjenoppbygging pipeline-iteratively oppdaterer de anslåtte posisjonene til overflate elementene basert på den observerte bildes takken. For fullstendige algoritmer for metoden, se Nguyen3. (C) gjenoppbygging rørledningen starter med ingen a priori kjennskap til formen på cellen og oppdaterer posisjon og antall overflate hjørner for å matche den observerte z-stakken. Representative bilder fra hver 30-trinn under 3D-gjenoppbyggingen vises fra tre forskjellige vinkler av en V. cholerae -celle. Overflate posisjonene til denne figuren oppdateres for å minimere forskjellen mellom de simulerte og observerte bunkene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative 3D-rekonstruksjoner av tre ulike formede bakteriearter. Tredimensjonale Rekonstruksjoner kan gjøres fra celler med membran farget (venstre) eller fylt med en cytoplasmatiske fluoroforen (høyre). Formen og krumning av startcellen er ikke viktig, som en bøyd stang, vridd stang, eller rett stang er alle i stand til å være nøyaktig rekonstruert. De rekonstruert overflater er farget basert på den lokale Gaussian krumning av overflaten. Skala bar = 1 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Rekonstruksjoner kan mislykkes av flere grunner. Celler må være vist for å sikre at rekonstruksjon algoritmen løpe til et rimelig resultat. Venstre = representant vill type (øverst) og rodZ mutant (nederst) E. coli celler som har passert kvalitetskontroll. Høyre = celler som ikke klarte å rekonstruere riktig og ikke bestått kvalitetskontroll. Fem klasser av mislykkede konvergens vises: (i) celler som er for nær kanten av beskjæringsområdet som fører til en skarp avgrensning, (II) celler som er for nær en annen celle, (III) celler som produserte en Divot, (IV) celler som ikke fortsetter forbi den første s tarting punkt, og (v) andre ukjente feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative data som viser protein lokalisering til spesifikke cellulære geometri. (A) tre-dimensjonale rekonstruert celler av vill type og rodZ E. coli celler med Gaussian krumning og MreB fluorescens intensitet vises. Scale bar = 1 μm. (B) berikelse plott av MreB fra vill type og rodZ E. coli celler. Verdier > 1 viser berikelse og verdier < 1 viser tømming av MreB fra disse celleområdene i forhold til ensartet dekning av cellen. Skyggelagte områder indikerer bety ± 90% bootstrap tillit intervall av gjennomsnittet. Kurven for hver belastning er en kubikk utjevnings kurve og avkortes ved hjelp av en Sannsynlighets terskel for ekstrem kurvaturer av p > 5 x 10-3. Dette tallet er endret fra (Bratton et al.) 4. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Et kritisk trinn i denne protokollen er oppkjøpet av bilder av høy kvalitet. For å rekonstruere cellene riktig, må det være nok uskarphet over og under cellen. Derfor er det viktig at z-stakken tatt dekker en stor nok avstand. Antall skritt som er tatt under bilde anskaffelsen kan justeres for hver belastning. For eksempel E. coli celler slettet for rodZ er bredere og krever flere trinn, og derfor en større avstand, enn vill type celler. Hvis prøven driver under bilde anskaffelse, kan gjenoppbyggingen ha store feil. Derfor er det viktig å la lysbildet komme til termisk likevekt med mikroskopet før bildebehandling for å unngå drift under z-stakken oppkjøpet. Celler bør være avbildet på pads med lav autofluorescence. Medie komponenter, slik som de som finnes i Common LB medium, har autofluorescence som kan forårsake problemer når du prøver å rekonstruere cellene. Tettheten av celler på bilde blokken er viktig fordi gjenoppbyggingsprosessen utføres uavhengig på hver celle. For få celler vil øke tiden som trengs for å få bilder av et tilstrekkelig antall celler, mens for mange celler vil resultere i tenkelig felt som er for tette til enkelt å beskjære enkeltceller. Fordi ikke alle celler rekonstruere på riktig måte, bør ekstra celler bli avbildet under anskaffelses trinnet, og alle utganger bør undersøkes før de går fremover med statistisk analyse (Figur 3).
Mange av begrensningene for denne metoden er tekniske. På mikroskopet som skal brukes, må man ha et mål som har en høy numerisk blenderåpning (vanligvis > 1.4), fordi dette muliggjør optisk snitting på størrelses skala av bakterier. I tillegg må mikroskopet utstyres med et piezo trinn som kan ta små, presise trinn i z-retningen. Videre, mens det ikke er nødvendig, tilgang til høy gjennomstrømming beregningsorientert ressurser til å kjøre bildet analyseprogramvare er sterkt anbefalt fordi det vil redusere behandlingstiden å rekonstruere celler.
En konseptuell begrensning til metoden er at riktig energi skalaer for vekting glatthet av gjenoppbyggingen i forhold til signal-til-støy-forhold av bildene må velges. For å validere et valg av parametre, bør størrelser og former av celler måles ved hjelp av uavhengige metoder som overføring elektron mikroskopi (TEM) eller Atomic Force mikroskopi (AFM). Som et bevis på prinsippet ble 3D rekonstruksjoner av celler utført enten på en AFM å teste for z-nøyaktighet (< 50 NM) eller på en TEM rutenett for å teste for XY-nøyaktighet (< 30 NM)3. En slik korrelert tilnærming er tidkrevende og kostbart. En enklere tilnærming kan være å bilde standard prøver som ville type celler eller 1 μm sfæriske perler. Diameteren og sfærisitet til Rekonstruksjoner kan brukes for å sikre at størrelsen og energi vektene som brukes i gjenoppbyggingen, er korrekte.
Dette er ikke den eneste metoden som søker å trekke ut høy oppløsning romlig informasjon fra fluorescens mikroskopi bilder. Mange gjennomgang artikler beskriver nylige fremskritt innen super-oppløsning mikroskopi. Løsnings fremmende teknikker som deconvolution mikroskopi26, spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi27, pixel tildeling28og strukturert belysning mikroskopi (SIM)29 søke å forbedre oppløsningen av bilder som er kjøpt av mikroskopet. Disse metodene er ikke uforenlig med tilnærmingen presentert. Denne metoden ble nylig tilpasset for å muliggjøre SIM-baserte bilder som innganger9. Mens fremover convolution metoden deler noen av sine grunnlaget med deconvolution mikroskopi, den har en helt annen utgang. Mens tilnærminger som deconvolution mikroskopi søke å forbedre oppløsningen av bildet, denne tilnærmingen ikke genererer et bilde, men snarere en celle form rekonstruksjon med omtrent 50 NM presisjon. Single-molekyl Aktiv-kontroll mikroskopi teknikker basert på tynt merket prøver kan gi enda høyere nivåer av romlig presisjon enn denne metoden. I mange tilfeller er disse enkelt molekylet tilnærminger krever optimalisering av fluorescerende konstruksjoner og kan kreve lang oppkjøp ganger, noe som gjør dem vanskelige å bruke med levende eller dynamiske prøver. Hver av disse metodene kommer med en eller flere begrensninger som denne metoden ikke. For eksempel, fordelene annonseres av spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi er ikke så gjeldende for monolagere av bakterielle celler, der det ikke er mye ut av flyet lys. Videre gir denne metoden en rørledning for å tilegne seg nøyaktige 3D celle former og protein lokalisering uten behov for noen spesialiserte fluorophores. Denne metoden har minimal isenkram behov (i.e., z piezo, høy NA mål) og behøver bare spent av profilen per timepoint, tillater ettall å lett etterforske Drivkraft 3D strukturer6.
Det har vært et økende antall tilnærminger til å studere organiseringen av bakterielle celler i 3D-strukturer. Disse inkluderer tilnærminger konseptuelt ligner på dette som utnytter høy kvalitet, 3D fluorescens bilder30,31,32. Denne tilnærmingen krever godt isolerte celler og gir ingen a priori forutsetninger om mobilnettet geometri. Men for å flytte inn i tette cellulære aggregater eller biofilm, er cellene antas å være Rod-like. Denne nedre oppløsnings visningen gjør det fortsatt mulig å undersøke pakke arrangementer i cellene, selv om den høye tettheten av celler i biofilm hindrer analyse av subcellulære lokalisering av bestemte faktorer.
I fremtiden kan det være interessant å utvikle et rammeverk for å integrere enkelt molekylet og brede felt tilnærminger med denne 3D gjenoppbyggings teknikken. Videre kan det være mulig å inkludere dette fremover convolution tilnærming med maskin visjons segmentering verktøy32 for å tillate rekonstruksjoner av mer tett celle klynger.
Hvorfor celler utviklet seg til bestemte figurer er et komplekst problem som må gjenspeile det komplekse miljøet de lever i. Forstå utviklingen og funksjonen til celle figurer krever å ta presise og nøyaktige målinger av disse formene, som er hva denne metoden gir.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Jeffrey Nguyen og Joshua Shaevitz for å bidra til å utvikle denne metoden.
Finansiering: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-Glenn Centers for aldring forskning og National Science Foundation PHY-1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C.
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H.
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E.
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S.
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
