Denne protokol forklarer, hvordan man forbereder og monterer bakterielle prøver til levende tredimensionel billeddannelse, og hvordan man rekonstruerer den tredimensionale form af E. coli fra disse billeder.
Formen af en bakterie er vigtig for sin fysiologi. Mange aspekter af celle fysiologi såsom celle motilitet, prædation, og biofilm produktion kan påvirkes af celle form. Bakterieceller er tredimensionale (3D) objekter, selv om de sjældent behandles som sådan. De fleste mikroskopi teknikker resulterer i to-dimensionelle (2D) billeder, hvilket fører til tab af data vedrørende den faktiske 3D-celle form og lokalisering af proteiner. Visse form parametre, såsom gaussiske krumning (produktet af de to vigtigste curvatures), kan kun måles i 3D, fordi 2D-billeder ikke måler både primære curvatures. Desuden ligger ikke alle celler fladt, når montering og 2D-billeddannelse af buede celler ikke kan repræsentere disse cellers former nøjagtigt. Præcis måling af protein lokalisering i 3D kan hjælpe med at bestemme den fysiske regulering og funktion af proteiner. Der er udviklet en Forward konvolution-teknik, som bruger mikroskopens udviskning til at rekonstruere 3D-celle former og til nøjagtigt at lokalisere proteiner. Her beskrives en protokol til klargøring og montering af prøver til levende celle billeder af bakterier i 3D både for at rekonstruere en nøjagtig celle form og for at lokalisere proteiner. Metoden er baseret på simpel prøveforberedelse, fluorescerende billed erhvervelse og MATLAB-baseret billedbehandling. Mange højkvalitets fluorescerende mikroskoper kan simpelthen ændres til at tage disse målinger. Disse celle rekonstruktioner er beregningsmæssigt intensive, og det anbefales at få adgang til beregningsressourcer med høj dataoverførselshastighed, selvom det ikke er nødvendigt. Denne metode er blevet anvendt med succes på flere bakteriearter og mutanter, fluorescerende billedbehandlings metoder, og mikroskop fabrikanter.
Celler af alle typer regulerer deres former for specifikke funktioner. For eksempel er neuroner formet anderledes end blodlegemer og har forskellige funktioner. Tilsvarende bakterieceller kommer i en række forskellige former og størrelser, selv om formålet med disse former ikke altid er kendt1,2. Derfor er det vigtigt, at formen af bakterieceller bestemmes nøjagtigt. Den beskrevne metode viser en let implementeret måde at indsamle data egnet til 3D-analyse af de fleste levende eller faste bakterieceller.
Den beskrevne metode gør det muligt for en at tage 3D-billeder af bakterieceller for præcist at repræsentere den 3D-celle form af prøven og til præcist at lokalisere proteiner inden for disse former. Traditionelle mikroskopi teknikker tage 2D billeder, hvilket er problematisk, når man studerer celler, der har unormale eller ikke-symmetriske former, såsom mutanter af Escherichia coli, eller buede bakterier såsom Vibrio cholerae og Helicobacter pylori. Mens 3D-billeder med høj opløsning er det vigtigste input til denne metode, returnerer metoden ikke et billede med forbedret opløsning. Snarere, denne metode rekonstruer 3D-overflade koordinater og form af cellen ved hjælp af en Forward konvolution algoritme ved hjælp af aktive konturer og den tilsyneladende sløring funktion af mikroskop3 (figur 1). Det er blevet brugt til at studere den bakterielle actin ligner MREB i E. coli4,5,6,7, romanen periskelet element crva i V. cholerae8, og den formodede bactofilin CcmA i Helicobacter pylori9 (figur 2).
Lokalisering af proteiner kan give indsigt i deres funktioner. For eksempel er proteiner, der er involveret i celledeling, normalt lokaliseret til midcell10,11. High-gennemløb undersøgelser er blevet foretaget for at lokalisere alle proteinerne i en bakterie i håb om at få indsigt i deres funktioner12. Desværre blev disse undersøgelser udført med 2D Imaging og 1D eller 2D analyse, hvilket gør det umuligt at måle specifikke aspekter af protein lokalisering, såsom lokalisering til cellulære geometriske funktioner.
For eksempel, MREB, et dynamisk protein, der kræves for stang form af mange bakterier, er en hypotese at arbejde ved at dirigere lokalisering af cellevæg syntese, og dens lokalisering spejle lokalisering af cellevæg syntese7,13. MREB fra flere arter viser geometrisk berigelse4,6,7,14,15. Dynamiske overflade polymerer, såsom MreB, kan par geometrien af overfladen til den tid gennemsnitlige berigelse profil16 og kan være i stand til at orientere til specifikke geometrier ved at minimere den energi, der er forbundet med binding til membranen17. Mens vigtigheden af at vride, pakke, bøje og dynamik ikke er blevet helt løst for MreB, er det vigtigt at bemærke, at nøjagtige målinger af begge primære krumninger af en overflade kræver en fuld 3D-repræsentation af cellen. Derfor, at mest præcist måle krumninger, som proteiner lokalisere, er det præferentiel at bruge 3D, snarere end 2D Imaging. 3D imaging eliminerer behovet for beregningsmæssigt anslå disse krumninger, som ikke kan måles i 2D, et skøn, der måske ikke er nøjagtige i asymmetriske celler18.
Selvom 2D billeddannelse af celler er hurtigere og ikke kræver så meget postimaging beregningsmæssige arbejde, 3D imaging giver en mere præcis gengivelse af cellen, samt evnen til at måle overflade funktioner, såsom krumning, som ikke kan måles i 2D. Derfor, som 3D imaging bliver mere hverdagskost, ny indsigt i celle form og protein lokalisering vil blive muligt.
Et kritisk skridt i denne protokol er erhvervelsen af billeder af høj kvalitet. For at rekonstruere cellerne korrekt skal der være nok sløring over og under cellen. Derfor er det bydende nødvendigt, at z-stakken taget dækker en stor nok afstand. Antallet af trin, der er taget under billed anskaffelsen, kan justeres for hver stamme. For eksempel, E. coli celler slettet for Rodz er bredere og kræver flere trin, og derfor en større afstand, end Wild type celler. Hvis eksemplet driver under billed anskaffelse, kan genopbygningen have store fejl. Derfor er det vigtigt at lade diaset komme til termisk ligevægt med mikroskopet før billeddannelse for at undgå drift under z-stack erhvervelse. Celler skal indrettes på puder med lav Auto luorescens. Mediekomponenter som dem, der findes i det fælles LB-medium, har Autofilter, der kan give problemer, når de forsøger at rekonstruere cellerne. Tætheden af celler på billed blokken er vigtig, fordi genopbygningsprocessen udføres uafhængigt på hver celle. For få celler vil øge den tid, det kræver at få billeder af et tilstrækkeligt antal celler, mens for mange celler vil resultere i billedbehandlings felter, der er for tætte til nemt at beskære individuelle celler. Da ikke alle celler rekonstruerer korrekt, bør ekstra celler imældes under anskaffelses trinnet, og alle udgange bør screenes, før de bevæger sig fremad med statistisk analyse (figur 3).
Mange af begrænsningerne for denne metode er tekniske. På mikroskopet, der skal anvendes, skal man have et mål, som har en høj numerisk blænde (typisk > 1.4), fordi dette muliggør optisk skæring på størrelsesskalaen af bakterier. Desuden mikroskop skal udstyres med en piezo fase, der kan tage små, præcise trin i z-retningen. Desuden, selv om det ikke er nødvendigt, adgang til high-gennemløb beregningsmæssige ressourcer til at køre billedanalyse software er stærkt anbefales, fordi det vil reducere behandlingstiden til at rekonstruere celler.
En begrebsmæssig begrænsning til metoden er, at den korrekte energi skalaer til vægtning af glathed af genopbygningen i forhold til signal-til-støj-forholdet af billederne skal vælges. For at validere et valg af parametre, skal størrelserne og formerne af celler måles ved hjælp af uafhængige metoder såsom transmission elektronmikroskopi (tem) eller atomic force mikroskopi (AFM). Som et princip bevis blev 3D-rekonstruktioner af celler udført enten på en AFM for at teste for z-nøjagtighed (< 50 nm) eller på et TEM-net for at teste for XY-nøjagtighed (< 30 nm)3. En sådan korreleret tilgang er tidskrævende og bekostelig. En enklere tilgang kan være at billed standard prøver såsom vildtype celler eller 1 μm sfæriske perler. Rekonstruktions diameteren og sfæiciteten kan anvendes til at sikre, at den størrelse og de energi skalaer, der anvendes i genopbygningen, er korrekte.
Dette er ikke den eneste metode, der søger at udtrække høj opløsning rumlige oplysninger fra fluorescens mikroskopi billeder. Mange review artikler beskriver de seneste fremskridt inden for Super-resolution mikroskopi24,25. Opløsnings fremmende teknikker såsom dekoncentrering mikroskopi26, spinning disk confokal mikroskopi27, pixel gentildeling28, og struktureret belysning mikroskopi (SIM)29 søger at forbedre opløsningen af billeder, som mikroskop har erhvervet. Disse metoder er ikke uforenelige med den fremlagte fremgangsmåde. For nylig blev denne metode tilpasset til at tillade SIM-baserede billeder som indgange9. Mens Forward konvolution-metoden deler nogle af dens funda heder med devolution mikroskopi, har den en helt anden udgang. Der henviser til, at tilgange såsom dekoncentrering mikroskopi søger at forbedre opløsningen af billedet, denne fremgangsmåde ikke genererer et billede, men snarere en celle form rekonstruktion med groft 50 nm præcision. Single-molekyle aktiv-Control mikroskopi teknikker baseret på tyndt mærkede prøver kan give endnu højere niveauer af rumlig præcision end denne metode. I mange tilfælde, disse enkelt molekyle tilgange kræver optimering af fluorescerende konstruktioner og kan kræve lange anskaffelses tider, hvilket gør dem vanskelige at bruge med levende eller dynamiske prøver. Hver af disse metoder kommer med en eller flere forbehold, at denne metode ikke. For eksempel, de fordele annonceret ved spinning disk confokal mikroskopi er ikke så anvendelig på monolag af bakterieceller, hvor der ikke er meget ud af flyet lys. Desuden giver denne metode en rørledning til at erhverve nøjagtige 3D-celle former og protein lokalisering uden behov for nogen specialiserede fluorophorer. Denne metode har minimal hardwarekrav (dvs., z piezo, høj NA mål) og kræver kun snesevis af billeder per tidspunkt, så man let kan undersøge dynamiske 3D-strukturer6.
Der har været et stigende antal tilgange til at studere organiseringen af bakterieceller i 3D-strukturer. Disse omfatter tilgange begrebsmæssigt ligner dette, at drage fordel af høj kvalitet, 3D fluorescensbilleder30,31,32. Denne fremgangsmåde kræver godt isolerede celler og gør ingen priori antagelser om cellulære geometri. Men for at bevæge sig ind i tætte cellulære aggregater eller biofilms, antages cellerne at være stang lignende. Denne visning med lavere opløsning gør det stadig muligt at undersøge paknings ordninger for cellerne, selv om den høje densitet af celler i biofilm forhindrer analyse af den subcellulære lokalisering af specifikke faktorer.
I fremtiden kan det være interessant at udvikle en ramme for at integrere det enkelte molekyle og brede felt tilgange med denne 3D-genopbygnings teknik. Desuden kan det være muligt at inkludere denne Forward konvolution tilgang med Machine vision segmenterings værktøjer32 for at muliggøre rekonstruktioner af mere tætte celle klynger.
Hvorfor celler udviklet sig til bestemte former er et komplekst spørgsmål, der skal afspejle det komplekse miljø, de lever. Forståelse af udvikling og funktion af celle former kræver at tage præcise og præcise målinger af disse former, hvilket er, hvad denne metode giver.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Jeffrey Nguyen og Joshua Shaevitz for at hjælpe med at udvikle denne metode.
Finansiering: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-Glenn centre for aging Research og National Science Foundation PHY-1734030.
50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
M63 medium | US Biological | M1015 | |
MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
NIS Elements | Nkon | ||
Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |