Denne protokollen forklarer hvordan å forberede og montere bakterielle prøver for Live tredimensjonal Imaging og hvordan å rekonstruere den tredimensjonale formen av E. coli fra disse bildene.
Formen på en bakterie er viktig for sin fysiologi. Mange aspekter av celle fysiologi som celle motilitet, predasjon, og biofilm produksjon kan påvirkes av celle form. Bakterielle celler er tredimensjonale (3D) objekter, selv om de sjelden behandles som sådan. De fleste mikroskopi teknikker resulterer i todimensjonale (2D) bilder som fører til tap av data knyttet til den faktiske 3D-celle form og lokalisering av proteiner. Visse form parametre, slik som Gaussian krumning (produktet av de to viktigste kurvaturer), kan bare måles i 3D fordi 2D-bilder ikke måler begge de viktigste kurvaturer. I tillegg, ikke alle celler ligge flatt når montering og 2D Imaging av buede celler kan ikke nøyaktig representerer figurer av disse cellene. Nøyaktig måling av protein lokalisering i 3D kan bidra til å bestemme romlig regulering og funksjon av proteiner. En framover convolution teknikk er utviklet som bruker uskarphet funksjon av mikroskopet til å rekonstruere 3D celle former og å nøyaktig lokalisere proteiner. Her er en protokoll for utarbeidelse og montering av prøver for levende celle bilde av bakterier i 3D både for å rekonstruere en nøyaktig celle form og lokalisere proteiner er beskrevet. Metoden er basert på enkle prøve forberedelser, fluorescerende bildeoppkjøp og MATLAB-basert bildebehandling. Mange høykvalitets fluorescerende mikroskop kan enkelt modifiseres for å ta disse målingene. Disse celle rekonstruksjoner er beregningsmessig intensive og tilgang til høy gjennomstrømming beregningsressurser er anbefalt, men ikke nødvendig. Denne metoden har blitt brukt på flere bakterielle arter og mutanter, fluorescerende Imaging modaliteter, og mikroskop produsenter.
Celler av alle typer regulerer sine figurer for bestemte funksjoner. For eksempel er neurons formet annerledes enn blodlegemer og har ulike funksjoner. På samme måte kommer bakterieceller i en rekke former og størrelser, selv om hensikten med disse formene ikke alltid er kjent som1,2. Derfor er det viktig at formen på bakterielle celler være nøyaktig bestemmes. Metoden skissert viser en lett implementert måte å samle inn data som passer for 3D-analyse av de fleste levende eller faste bakterielle celler.
Metoden beskrevet gjør det mulig å ta 3D-bilder av bakterielle celler for å nøyaktig representere 3D celle form av prøven og til nøyaktig lokalisere proteiner innenfor disse formene. Tradisjonelle mikroskopi teknikker tar 2D-bilder, noe som er problematisk når man studerer celler som har unormale eller nonsymmetrical former, slik som mutanter av Escherichia coli, eller buede bakterier som Vibrio cholerae og Helicobacter og pylori. Mens høyoppløselige 3D-bilder er nøkkelen input til denne metoden, returnerer metoden ikke en oppløsning-forbedret bilde. Denne metoden rekonstruerer 3D-koordinatene og formen på cellen ved hjelp av en fremover convolution algoritme som bruker aktive konturer og den tilsynelatende uskarpe funksjonen til mikroskopet3 (figur 1). Det har blitt brukt til å studere bakteriell utgangen homologe MreB i E. coli4,5,6,7, romanen periskeletal element CrvA i V. cholerae8, og antatte bactofilin CcmA i Helicobacter pylori9 (figur 2).
Lokalisering av proteiner kan gi innsikt i sine funksjoner. For eksempel er proteiner som er involvert i celledeling, vanligvis lokalisert til midcell10,11. Studier med høy gjennomstrømming har blitt gjennomført for å lokalisere alle proteiner av en bakterie i håp om å få innsikt i sine funksjoner12. Dessverre ble disse studiene utført med 2D-avbildning og 1D-eller 2D-analyse, noe som gjør det umulig å måle spesifikke aspekter ved protein lokalisering, for eksempel lokalisering til cellulære geometriske funksjoner.
For eksempel, MreB, en dynamisk protein som kreves for stangen form av mange bakterier, er hypotetisk gjennomsnitt å arbeide ved å dirigere lokalisering av celle veggen syntese, og lokalisering speil lokalisering av celle veggen syntese7,13. MreB fra flere arter viser geometrisk berikelse4,6,7,14,15. Dynamisk overflate polymerer, slik som MreB, kan par geometrien av overflaten til den tiden gjennomsnitt berikelse profil16 og kan være i stand til å orientere til bestemte geometri ved å minimere energien forbundet med binding til membranen17. Mens viktigheten av vridning, bunting, bøying og dynamikk ikke har vært helt løst for MreB, er det viktig å merke seg at nøyaktige målinger av både rektor kurvaturer av en overflate krever en full 3D representasjon av cellen. Derfor, for å mest nøyaktig måle kurvaturer som proteiner lokalisere, er det fortrinnsrett til å bruke 3D, snarere enn 2D Imaging. 3D Imaging eliminerer behovet for å beregningsmessig anslå de kurvaturer som ikke kan måles i 2D, et anslag som kanskje ikke er nøyaktig i asymmetriske celler18.
Selv om 2D-avbildning av celler er raskere og ikke krever så mye postimaging beregningsorientert arbeid, gir 3D-avbildning en mer nøyaktig representasjon av cellen, i tillegg til evnen til å måle overflate funksjoner, for eksempel krumning, som ikke kan måles i 2D. Derfor, som 3D Imaging blir mer vanlig, ny innsikt i celle form og protein lokalisering vil bli mulig.
Et kritisk trinn i denne protokollen er oppkjøpet av bilder av høy kvalitet. For å rekonstruere cellene riktig, må det være nok uskarphet over og under cellen. Derfor er det viktig at z-stakken tatt dekker en stor nok avstand. Antall skritt som er tatt under bilde anskaffelsen kan justeres for hver belastning. For eksempel E. coli celler slettet for rodZ er bredere og krever flere trinn, og derfor en større avstand, enn vill type celler. Hvis prøven driver under bilde anskaffelse, kan gjenoppbyggingen ha store feil. Derfor er det viktig å la lysbildet komme til termisk likevekt med mikroskopet før bildebehandling for å unngå drift under z-stakken oppkjøpet. Celler bør være avbildet på pads med lav autofluorescence. Medie komponenter, slik som de som finnes i Common LB medium, har autofluorescence som kan forårsake problemer når du prøver å rekonstruere cellene. Tettheten av celler på bilde blokken er viktig fordi gjenoppbyggingsprosessen utføres uavhengig på hver celle. For få celler vil øke tiden som trengs for å få bilder av et tilstrekkelig antall celler, mens for mange celler vil resultere i tenkelig felt som er for tette til enkelt å beskjære enkeltceller. Fordi ikke alle celler rekonstruere på riktig måte, bør ekstra celler bli avbildet under anskaffelses trinnet, og alle utganger bør undersøkes før de går fremover med statistisk analyse (Figur 3).
Mange av begrensningene for denne metoden er tekniske. På mikroskopet som skal brukes, må man ha et mål som har en høy numerisk blenderåpning (vanligvis > 1.4), fordi dette muliggjør optisk snitting på størrelses skala av bakterier. I tillegg må mikroskopet utstyres med et piezo trinn som kan ta små, presise trinn i z-retningen. Videre, mens det ikke er nødvendig, tilgang til høy gjennomstrømming beregningsorientert ressurser til å kjøre bildet analyseprogramvare er sterkt anbefalt fordi det vil redusere behandlingstiden å rekonstruere celler.
En konseptuell begrensning til metoden er at riktig energi skalaer for vekting glatthet av gjenoppbyggingen i forhold til signal-til-støy-forhold av bildene må velges. For å validere et valg av parametre, bør størrelser og former av celler måles ved hjelp av uavhengige metoder som overføring elektron mikroskopi (TEM) eller Atomic Force mikroskopi (AFM). Som et bevis på prinsippet ble 3D rekonstruksjoner av celler utført enten på en AFM å teste for z-nøyaktighet (< 50 NM) eller på en TEM rutenett for å teste for XY-nøyaktighet (< 30 NM)3. En slik korrelert tilnærming er tidkrevende og kostbart. En enklere tilnærming kan være å bilde standard prøver som ville type celler eller 1 μm sfæriske perler. Diameteren og sfærisitet til Rekonstruksjoner kan brukes for å sikre at størrelsen og energi vektene som brukes i gjenoppbyggingen, er korrekte.
Dette er ikke den eneste metoden som søker å trekke ut høy oppløsning romlig informasjon fra fluorescens mikroskopi bilder. Mange gjennomgang artikler beskriver nylige fremskritt innen super-oppløsning mikroskopi. Løsnings fremmende teknikker som deconvolution mikroskopi26, spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi27, pixel tildeling28og strukturert belysning mikroskopi (SIM)29 søke å forbedre oppløsningen av bilder som er kjøpt av mikroskopet. Disse metodene er ikke uforenlig med tilnærmingen presentert. Denne metoden ble nylig tilpasset for å muliggjøre SIM-baserte bilder som innganger9. Mens fremover convolution metoden deler noen av sine grunnlaget med deconvolution mikroskopi, den har en helt annen utgang. Mens tilnærminger som deconvolution mikroskopi søke å forbedre oppløsningen av bildet, denne tilnærmingen ikke genererer et bilde, men snarere en celle form rekonstruksjon med omtrent 50 NM presisjon. Single-molekyl Aktiv-kontroll mikroskopi teknikker basert på tynt merket prøver kan gi enda høyere nivåer av romlig presisjon enn denne metoden. I mange tilfeller er disse enkelt molekylet tilnærminger krever optimalisering av fluorescerende konstruksjoner og kan kreve lang oppkjøp ganger, noe som gjør dem vanskelige å bruke med levende eller dynamiske prøver. Hver av disse metodene kommer med en eller flere begrensninger som denne metoden ikke. For eksempel, fordelene annonseres av spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi er ikke så gjeldende for monolagere av bakterielle celler, der det ikke er mye ut av flyet lys. Videre gir denne metoden en rørledning for å tilegne seg nøyaktige 3D celle former og protein lokalisering uten behov for noen spesialiserte fluorophores. Denne metoden har minimal isenkram behov (i.e., z piezo, høy NA mål) og behøver bare spent av profilen per timepoint, tillater ettall å lett etterforske Drivkraft 3D strukturer6.
Det har vært et økende antall tilnærminger til å studere organiseringen av bakterielle celler i 3D-strukturer. Disse inkluderer tilnærminger konseptuelt ligner på dette som utnytter høy kvalitet, 3D fluorescens bilder30,31,32. Denne tilnærmingen krever godt isolerte celler og gir ingen a priori forutsetninger om mobilnettet geometri. Men for å flytte inn i tette cellulære aggregater eller biofilm, er cellene antas å være Rod-like. Denne nedre oppløsnings visningen gjør det fortsatt mulig å undersøke pakke arrangementer i cellene, selv om den høye tettheten av celler i biofilm hindrer analyse av subcellulære lokalisering av bestemte faktorer.
I fremtiden kan det være interessant å utvikle et rammeverk for å integrere enkelt molekylet og brede felt tilnærminger med denne 3D gjenoppbyggings teknikken. Videre kan det være mulig å inkludere dette fremover convolution tilnærming med maskin visjons segmentering verktøy32 for å tillate rekonstruksjoner av mer tett celle klynger.
Hvorfor celler utviklet seg til bestemte figurer er et komplekst problem som må gjenspeile det komplekse miljøet de lever i. Forstå utviklingen og funksjonen til celle figurer krever å ta presise og nøyaktige målinger av disse formene, som er hva denne metoden gir.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Jeffrey Nguyen og Joshua Shaevitz for å bidra til å utvikle denne metoden.
Finansiering: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-Glenn Centers for aldring forskning og National Science Foundation PHY-1734030.
50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
M63 medium | US Biological | M1015 | |
MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
NIS Elements | Nkon | ||
Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |