Detta protokoll förklarar hur man förbereder och monterar bakteriella prover för levande tredimensionell avbildning och hur man rekonstruera den tredimensionella formen av E. coli från dessa bilder.
Formen på en bakterie är viktig för dess fysiologi. Många aspekter av cellfysiologi såsom cellmotilitet, predation och biofilm produktion kan påverkas av cell formen. Bakterieceller är tredimensionella (3D) objekt, även om de sällan behandlas som sådana. De flesta mikroskopi tekniker resultera i tvådimensionella (2D) bilder som leder till förlust av data som rör den faktiska 3D-cellform och lokalisering av proteiner. Bestämda formar parametrar, liksom Gaussian krökning (produkten av de två främsta krökningar), kan endast mätas i 3D, därför att 2D-avbildar inte mäter båda huvudsakliga kurva. Dessutom, inte alla celler ligga plant när montering och 2D-avbildning av böjda celler kan inte exakt representera formerna av dessa celler. Noggrann mätning av protein lokalisering i 3D kan hjälpa till att bestämma rumslig reglering och funktion av proteiner. En framåt faltning teknik har utvecklats som använder oskärpa funktion mikroskopet att rekonstruera 3D-cellformer och att noggrant lokalisera proteiner. Här beskrivs ett protokoll för beredning och montering av prover för levande cell avbildning av bakterier i 3D både för att rekonstruera en korrekt cell form och för att lokalisera proteiner. Metoden är baserad på enkel provberedning, fluorescerande bild förvärv och MATLAB-baserad bildbehandling. Många högkvalitativa fluorescerande Mikroskop kan enkelt modifieras för att ta dessa mätningar. Dessa cell rekonstruktioner är beräkningsmässigt intensiva och tillgång till stora dataflöden beräkningsresurser rekommenderas, men inte nödvändigt. Denna metod har tillämpats framgångsrikt på flera bakteriearter och mutanter, fluorescerande avbildning modaliteter, och Mikroskop tillverkare.
Celler av alla typer reglerar formerna för specifika funktioner. Till exempel, neuroner formas annorlunda än blodkroppar och har olika funktioner. Likaså bakterieceller finns i en mängd olika former och storlekar, även om syftet med dessa former är inte alltid känd1,2. Därför är det viktigt att formen på bakterieceller bestäms exakt. Den metod som beskrivs visar ett enkelt genomfört sätt att samla in data som lämpar sig för 3D-analys av de flesta levande eller fasta bakterieceller.
Metoden som beskrivs gör det möjligt att ta 3D-bilder av bakterieceller för att exakt representera 3D-cellformen av provet och att exakt lokalisera proteiner i dessa former. Traditionella mikroskopi tekniker ta 2D-bilder, vilket är problematiskt när man studerar celler som har onormala eller icke-symmetriska former, såsom mutanter av Escherichia coli, eller böjda bakterier som Vibrio cholerae och Helicobacter pylori. Medan högupplösta 3D-bilder är nyckeln indata till den här metoden, returnerar metoden inte en upplösning bättre bild. I stället rekonstruerar denna metod 3D-ytans koordinater och form av cellen med hjälp av en framåtfaltningsalgoritm med aktiva konturer och den skenbara suddigt funktion av mikroskopet3 (figur 1). Det har använts för att studera den bakteriella aktin homolog mreb i E. coli4,5,6,7, den nya periskeletala elementet crva i V. cholerae8, och den förmodade bactofilin CcmA i Helicobacter pylori9 (figur 2).
Lokaliseringen av proteiner kan ge insikt i deras funktioner. Till exempel, proteiner som är involverade i celldelning är normalt lokaliserade till midcell10,11. Höggenomflödestudier har gjorts för att lokalisera alla proteiner i en bakterie i hopp om att få insikt i deras funktioner12. Tyvärr, dessa studier utfördes med 2D-avbildning och 1D eller 2D-analys, vilket gör det omöjligt att mäta specifika aspekter av protein lokalisering, såsom lokalisering till cellulära geometriska funktioner.
Till exempel, mreb, ett dynamiskt protein som krävs för spö formen av många bakterier, är en hypotes om att arbeta genom att styra lokalisering av cellväggen syntes, och dess lokalisering speglar lokalisering av cellväggsyntes7,13. Mreb från flera arter visar geometrisk berikning4,6,7,14,15. Dynamisk yta polymerer, såsom MreB, kan par geometrin på ytan till den tid som genomsnitt anrikning profil16 och kan orientera sig till specifika geometrier genom att minimera den energi som förknippas med bindning till membranet17. Även om vikten av att vrida, bunta, böja och dynamik inte har lösts helt för MreB, är det viktigt att notera att noggranna mätningar av både huvudsakliga krökningar av en yta kräver en fullständig 3D-representation av cellen. Därför, för att mest exakt mäta krökningar som proteiner lokalisera, är det preferens att använda 3D, snarare än 2D-avbildning. 3D Imaging eliminerar behovet av att beräkningsmässigt uppskatta de krökningar som inte kan mätas i 2D, en uppskattning som kanske inte är korrekt i asymmetriska celler18.
Även 2D-avbildning av celler är snabbare och inte kräver så mycket postimaging Computational arbete, ger 3D-avbildning en mer exakt representation av cellen, samt förmågan att mäta ytan funktioner, såsom krökning, som inte kan mätas i 2D. Eftersom 3D-avbildning blir vanligare kommer därför nya insikter om cell form och protein lokalisering att bli möjliga.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är förvärvet av bilder av hög kvalitet. För att korrekt rekonstruera cellerna måste det finnas tillräckligt med oskärpa över och under cellen. Därför är det viktigt att z-stacken tas täcker ett tillräckligt stort avstånd. Antalet steg som tas under bild anskaffningen kan justeras för varje stam. Till exempel E. coli -celler som tagits bort för Rodz är bredare och kräver fler steg, och därför ett större avstånd, än vilda typ celler. Om provet driver under bild förvärv, kan återuppbyggnaden ha stora fel. Därför är det viktigt att låta bilden komma till termisk jämvikt med mikroskopet före avbildning för att undvika avdrift under z-stacken förvärvet. Celler bör avbildas på kuddar med låg autofluorescence. Media komponenter, såsom de som finns i common LB medium, har autofluorescence som kan orsaka problem när man försöker rekonstruera cellerna. Tätheten av celler på Imaging pad är viktigt eftersom återuppbyggnadsprocessen utförs självständigt på varje cell. För få celler kommer att öka den tid som behövs för att få bilder av ett tillräckligt antal celler, medan alltför många celler kommer att resultera i bild fält som är för täta för att enkelt beskära enskilda celler. Eftersom inte alla celler rekonstruera ordentligt, extra celler bör avbildas under förvärvet steg och alla utgångar bör granskas innan du går vidare med statistisk analys (figur 3).
Många av begränsningarna för denna metod är tekniska. På mikroskopet som ska användas, måste man ha ett mål som har en hög numerisk bländare (typiskt > 1.4), eftersom detta möjliggör optisk snittning på storleks skalan av bakterier. Dessutom måste mikroskopet utrustas med en piezo skede som kan ta små, exakta steg i z-riktning. Dessutom, även om det inte är nödvändigt, tillgång till hög datakapacitet beräkningsresurser för att köra bildanalysprogram vara rekommenderas starkt eftersom det kommer att minska bearbetningstiden att rekonstruera celler.
En begreppsmässig begränsning av metoden är att de korrekta energi skalor för vägning av jämnhet i återuppbyggnaden i förhållande till signal-brus förhållandet av bilderna måste väljas. För att validera ett val av parametrar bör cellernas storlek och form mätas med hjälp av oberoende metoder som transmissionselektronmikroskopi (TEM) eller Atom krafts Mikroskop (AFM). Som ett bevis på princip, 3D rekonstruktioner av celler utfördes antingen på en AFM att testa för z-noggrannhet (< 50 nm) eller på ett TEM rutnät för att testa för XY-noggrannhet (< 30 Nm)3. Ett sådant korrelerat tillvägagångssätt är tidskrävande och kostsamt. Ett enklare tillvägagångssätt kan vara att avbilda standardprover såsom vilda typ celler eller 1 μm sfäriska pärlor. De rekonstruktioners diameter och sfäricitet kan användas för att säkerställa att den storlek och de energi skalor som används i återuppbyggnaden är korrekta.
Detta är inte den enda metod som syftar till att extrahera högupplöst rumslig information från fluorescens mikroskopi bilder. Många översyn artiklar beskriver de senaste framstegen inom området super-resolution mikroskopi24,25. Upplösningsförbättrande tekniker som deconvolution mikroskopi26, spinning disk konfokalmikroskopi27, pixel omställning28, och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM)29 sträva efter att förbättra upplösningen av bilder förvärvade av mikroskopet. Dessa metoder är inte oförenliga med den metod som presenteras. Denna metod har nyligen anpassats för att möjliggöra SIM-baserade bilder som ingångar9. Medan Forward faltning metoden delar några av dess underbyggnad med deconvolution mikroskopi, den har en helt annan utgång. Medan metoder som defaltningsmikroskopi försöker förbättra bildens upplösning, genererar denna metod inte en bild utan snarare en cell form rekonstruktion med ungefär 50 nm precision. Single-molekylen Active-Control mikroskopi tekniker baserade på glest märkta prover kan ge ännu högre nivåer av rumslig precision än denna metod. I många fall, dessa enda molekyl metoder kräver optimering av fluorescerande konstruktioner och kan kräva långa förvärvs tider, vilket gör dem svåra att använda med levande eller dynamiska prover. Var och en av dessa metoder levereras med en eller flera varningar som den här metoden inte. Till exempel, de fördelar som annonseras av spinning disk konfokalmikroskopi är inte lika tillämpliga på enskiktslager av bakterieceller, där det inte finns mycket ur planet ljus. Dessutom ger denna metod en pipeline för att förvärva exakta 3D-cellformer och protein lokalisering utan behov av några specialiserade fluoroforer. Denna metod har minimala hårdvarukrav (dvs z piezo, högt NA mål) och kräver bara tiotals bilder per timepoint, vilket gör att man enkelt kan undersöka dynamiska 3D-strukturer6.
Det har skett ett ökande antal metoder för att studera organisationen av bakterieceller i 3D-strukturer. Dessa inkluderar metoder begreppsmässigt liknar detta som utnyttjar hög kvalitet, 3D-fluorescens bilder30,31,32. Detta tillvägagångssätt kräver väl isolerade celler och gör ingen a priori antaganden om cellulära geometri. Men för att flytta in i täta cellulära aggregat eller biofilmer, cellerna antas vara Rod-liknande. Denna lägre upplösning gör det fortfarande möjligt att undersöka förpacknings arrangemang av cellerna, även om den höga densiteten av celler i biofilmen förhindrar analys av den subcellulära lokalisering av specifika faktorer.
I framtiden kan det vara intressant att utveckla en ram för att integrera den enda molekyl och Wide-fält metoder med denna 3D-rekonstruktion teknik. Dessutom kan det vara möjligt att inkludera denna Forward faltning strategi med Machine vision segmentering verktyg32 för att möjliggöra rekonstruktioner av tätare cell kluster.
Varför celler utvecklats till specifika former är ett komplext problem som måste återspegla den komplexa miljö som de lever i. Att förstå cell formernas evolution och funktion kräver noggranna och noggranna mätningar av dessa former, vilket är vad den här metoden ger.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka Jeffrey Nguyen och Joshua Shaevitz för att hjälpa till att utveckla denna metod.
Finansiering: RMM-NIH F32 GM103290-01A1, BPB-Glenn Centers för åldrande forskning och National Science Foundation PHY-1734030.
50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
M63 medium | US Biological | M1015 | |
MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
NIS Elements | Nkon | ||
Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |