Summary
İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.
Abstract
Yetişkin kök hücre araştırmalarında gelişmelere rağmen, doku örneklerinden kök hücrelerin tanımlanması ve izole edilmesi büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Yerleşik kök hücreler yetişkin dokularda niş kısıtlamalar ile nispeten quiescent iken, onlar çapa içermeyen üç boyutlu (3D) kültür hücre döngüsü girmek ve hem simetrik hem de asimetrik hücre bölünmesi geçmesi, hem kök ve ata yol açan Hücre. İkincisi hızla çoğalır ve heterojen sferoidler oluşturan, soy taahhüdü çeşitli aşamalarında büyük hücre popülasyonuvardır. Primer normal insan prostat epitel hücreleri (HPrEC) kullanılarak, küresel tabanlı, etiket tutma testi, tek bir hücre çözümünde spheroid başlatan kök hücrelerin tanımlanmasına ve işlevsel olarak izole edilmesine izin veren geliştirilmiştir.
HPrEC veya hücre hatları, brdu ile 10 gün boyunca iki boyutlu (2D) kültürlü dürveterek, kendi kendini yenileyen kök hücreler de dahil olmak üzere tüm bölücü hücrelerin DNA'sına dahil edilmesine izin verir. Yıkama, 3D kültürüne aktarılmasıyla 5 gün boyunca başlar ve bu süre zarfında kök hücreler asimetrik bölünme yoluyla kendini yeniler ve küresel oluşumu başlatır. Nispeten quiescent kızı kök hücreleri BrdU etiketli ebeveyn DNA korumak iken, kız ataları hızla çoğalır, BrdU etiketi kaybetme. BrdU CFSE veya Far Red pro-boyalar ile değiştirilebilir, hangi FACS tarafından canlı kök hücre izolasyonu izin. Kök hücre özellikleri in vitro küresel formasyon, in vivo doku rejenerasyon uyrukları ve simetrik/asimetrik hücre bölünmelerini belgeleyerek doğrulanır. İzole etiket istinat kök hücreleri, RNA-seq, ChIP-seq, tek hücre yakalama, metabolik aktivite, proteom profilleme, immünositokimya, organoid oluşumu ve in vivo doku rejenerasyonu gibi moleküler ve biyolojik çalışmalarla titizlikle sorgulanabilir. Daha da önemlisi, bu marker-free fonksiyonel kök hücre izolasyon yaklaşımı taze kanser örnekleri ve birden fazla organdan kanser hücre hatları kök benzeri hücreleri tanımlar, geniş uygulanabilirlik düşündüren. Bu kanser kök benzeri hücre biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir, kanser kök benzeri hücreleri hedefleyen ekran ilaç, ve kanserlerde yeni tedavi hedefleri keşfetmek.
Introduction
İnsan prostat bezi salgı fonksiyonu ve bazal hücreleri alışılmadık bir nöroendokrin hücre bileşeni ile birlikte altında yatan luminal epitel içerir. Epitel hücreleri, Bu durumda, vivo nispeten quiescent prostat kök hücrelerinin nadir bir popülasyondan oluşturulur ve yaşam boyunca glandüler homeostaz korumak için bir onarım sistemi olarak hareket1. Birçok ilerlemeye rağmen, prostat kök hücrelerinin tanımlanması ve fonksiyonel izolasyonu bu alanda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Kök hücre biyobelirteçleri, akış sitometrisi ile birlikte hücre yüzeyi marker tabanlı metodolojiler de dahil olmak üzere yaygın kök hücre araştırma 2içinkullanılır2,3,4. Ancak, zenginleştirme ve izolasyon sonuçları marker kombinasyonları ve antikor özgüllüğü bir fonksiyonu olarak büyük ölçüde değişir5,6, izole hücrelerin kimliği hakkında sorular yükselterek. Kök benzeri hücre zenginleştirme için başka bir yaygın olarak kullanılan yaklaşım üç boyutlu (3D) küresel kültür2,3,4. Yerleşik kök hücreler niş kısıtlamalar ile vivo nispeten quiescent iken, onlar 3D matris kültüründe hücre bölünmesi geçmesi (hem simetrik ve asimetrik), hızla soy taahhüdü doğru çoğaltmak hem kök ve progenitor hücreleri üreten7,8. Oluşan küresel oidler, erken ve geç evre progenitor hücreleri de dahil olmak üzere, soy bağlılığının çeşitli aşamalarında hem kök hücreleri hem de progenitor hücreleri içeren heterojen bir karışımdır. Böylece, tüm küreseloidler kullanarak tahliller kök hücre özel değildir, benzersiz kök hücre özelliklerinin belirlenmesi sonuçsuz hale. Bu nedenle, kız larının atalarından prostat kök hücrelerini tanımlamak ve ayırmak için tahliller oluşturmak çok önemlidir. Bu doğrultuda, mevcut protokolün amacı, insan prostat dokularından kök hücrelerin etkin bir şekilde tanımlanmasıve izole edilmesine ve ardından biyolojik fonksiyonlarının sağlam downstream analizine olanak sağlayan bir tahlil sistemi kurmaktır.
Uzun süreli 5-bromo-2'-deoksiürinin (BrdU) etiket tutma yaygın olarak in vivo ve in vitro soy onların uzun katlama süresi 9 dayalı kök hücrelerin izlenmesi için kullanılır9,10. Burada tanımlanan prostat kök hücre tanımlama ve izolasyonu için mevcut yaklaşım, karışık epitel popülasyondaki göreceli kuskus karakteristiklerine ve etiket tutma özelliklerine dayanmaktadır. Ayrıca, ölümsüz iplikçik DNA hipotezine dayanarak, sadece kök hücreler asimetrik hücre bölünmesi geçirebilir. Kök hücre, büyük ebeveyn DNA'sını içeren kız hücresini temsil ederken, kendini adamış bir kız hücresi olan ata hücresi yeni sentezlenen DNA'yı alır. Yukarıda açıklanan benzersiz kök hücre özelliği birincil kültürlerde ebeveyn kök hücrelerinde BrdU etiketleme gerçekleştirmek ve daha sonra 3D çapa ücretsiz küresel kültüre transfer üzerine BrdU-washout aşağıdaki etiket izlemek için istismar edilir. Primer prostat epitel hücrelerinin çoğunluğu 2D kültürde bazal ve transit yükseltici fenotip korurken, aynı zamanda multipotent kök hücrelerin nadir bir popülasyon ulaştırır ve epitel homeostazı korumak gibi sferoidler veya 3Dsistemleretransferi üzerine ilgili kültür medya ile tam farklılaşmış organoidler oluşumu ile kanıtlandı12. Mevcut protokolümüzde, HPrEC prostat küreseloidleri veya prostasphere tabanlı BrdU, CFSE veya Uzak Kırmızı retansiyon testlerini ve ardından floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) kullanarak, tek bir hücre düzeyinde sferoidlerde etiket tutucu kök hücreleri tanımlıyoruz13.
Daha da önemlisi, erken evre küresel hücrelerdeki etiket tutucu hücrelerin kök hücre özelliklerini soy taahhüdü ne göre daha da doğruladık. Bunlar arasında kök hücre asimetrik bölünmesi, in vitro küresel formasyon yeteneği ve in vivo doku rejenerasyon kapasitesi, yüksek otofaji aktivitesi, artırılmış ribozom biyogenezi ve azalmış metabolik aktivite sayılabilir. Daha sonra RNAseq analizi yapıldı. Etiket-istinat küresel hücrelerinde farklı olarak ifade edilen genlerin insan prostat kök hücreleri için yeni biyobelirteçler olarak hizmet edebileceği gözlenmiştir. Bu sheroid tabanlı etiket tutma yaklaşımı benzer kanser kök benzeri hücrelerin az sayıda belirlemek için kanser örnekleri için geçerli olabilir, böylece terapötik dirençli popülasyonları yönetmek için çeviri fırsatları sağlayan13. Aşağıda sunulan prostasphere tabanlı etiket tutma testi insan primer prostat epitel hücreleri kullanarak (HPrEC) bir örnek olarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hücre kullanımı ve ortam preparatları Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde (BSC) aseptik teknikle yapılmalıdır.
1. 2D HPrEC Hücrelerinin Kültürü ve Bakımı
- Oda sıcaklığında (RT) 2 mL 2,5 g/cm2 fibronectin çözeltisi ile 100 mm kültür yemekleri. Çözeltiyi aspire edin ve bsc'de 45 dk. Fibronektin kaplı kültür yemekleri 4 °C'de 2-4 hafta saklanabilir.
- 100 mm'lik fibronektin kaplı bir kültür kabına prostat epitel hücresi büyüme ortamının 9 mL'sini (örneğin PrEGM) ekleyin ve 37 °C'de co2 kuluçka makinesinde yemeği sıcak tutun.
- 37 °C'lik bir su banyosunda bir şişe donmuş HPrEC hücresini (2 x 105/mL) eritin ve 10 mL ılık ortamda hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonuna 500 x g'de RT. Aspire edin ve süpernatantatın.
- Sıcak kültür ortamının 1 mL'sinde hücreleri iyice yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini doğrudan önceden ısıtılmış ortamın 9 mL'sini içeren fibronektin kaplı 100 mm kültür kabına boru ile tutarak tohum hücreleri (orta ve hücrelerin toplam hacmi 10 mL'dir). Kültür yemeklerini 37 °C'de co2 kuluçka makinesine yerleştirin.
- Her 2 günde bir orta yi yeniler. Bunu yapmak için, dikkatle tüm medya aspire ve taze sıcak orta 10 mL ekleyin.
- Yaklaşık 5 gün içinde, kültürlerin ~ 70-80% confluent olduğundan emin olun. Hücreleri 3 mL %0,05 Tripsin/EDTA ile 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatarak enzimatik sindirimi gerçekleştirin.
- % 10 FBS içeren 3 mL sıcak PBS ekleyerek sindirimi durdurun.
- Hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve 500 x g'de RT. Aspire edin ve süpernatantatın.
- 30 mL ılık ortamda hücre peletrerere resuspend ve bir sonraki geçiş için üç yeni fibronektin kaplı 100 mm kültür yemekleri içine eşit dağıtmak.
NOT: Primer HPrEC hücreleri bazal epitel hücre özelliklerini değiştirmeden ~3-5x olarak geçiş yapılabilir. Epitel fenotip, immünositokimya/immünüfüorescent (ICC/IF) testleri ile bazal epitel hücre belirteçleri sitokeratin 5 ve p63 ifadeleri ile test edilir.
2. BrdU, CFSE veya Far Red pro-boyalar ile HPrEC etiketleme
NOT: Hücreler adım 2.1 veya adım 2.2'ye ve ardından 3.1 adımda açıklandığı gibi 3D prostasphere kültürüne aktarılabilir.
-
BrdU'lu hücrelerin tek etiketlemi
- Kültür 2 x 105 HPrEC hücreleri fibronektin kaplı 100 mm kültür yemekleri ile 10 mL sıcak ortam brdU 1 μM içeren. Kültür 10 gün boyunca hücreleri (iki pasajlar üzerinde) prostat kökü ve ata hücreleri de dahil olmak üzere tüm hücrelerin etiketleme sağlamak için.
- 10 gün sonra BrdU içeren PrEGM ortamını dikkatlice aspire edin ve hücreleri 5 mL sıcak PBS ile yıkayın. 1x'i tekrarlayın.
- 1.7-1.8 adımlarında açıklandığı gibi %0.05 tripsin/EDTA kullanarak enzimatik sindirimi gerçekleştirin. Hücreleri 500 x g'de 5 dk.'da 5 dk. Aspire edin ve süpernatantatın.
- BrdU etiketli peletli hücreleri (5 x 104) 500 μL buz-soğuk (1:1) bazal membran matris/orta ve 3D prostasphere kültüre transfer (adım 3.1 açıklanan) için 5 gün boyunca brdU yıkama izin için sferoid oluşumu sırasında (~ 6 hücre döngüleri).
-
BrdU ve CFSE veya Far Red pro-boyalı hücrelerin çift etiketlemesi
- Canlı hücreler için ortak etiketleme isteniyorsa, BrdU ile birlikte kuluçkaya yatırılan hücreleri adım 2.1'den 10 gün süreyle alın ve 30 dakika boyunca 5 μM CFSE veya Far Red canlı hücre floresan pro-boyalarıyla birlikte etiketleyin.
- BrdU ve CFSE veya Far Red pro-boyaları içeren ortamı dikkatlice aspire edin. Hücreleri 5 mL sıcak PBS ile yıkayın. Yıkama 1x tekrarlayın.
- 1.7-1.8 adımlarında açıklandığı gibi %0.05 tripsin/EDTA kullanarak enzimatik sindirim gerçekleştirin. Hücreleri 500 x g'de 5 dk'da sentrifuge.
- 500 μL buz-soğuk (1:1) bazal membran matris/orta ve 3D prostasphere kültür (bölüm 3.1 açıklanan) transfer 5 gün boyunca brdU ve CFSE veya Far Red washout sferoid oluşumu sırasında (~ 6 hücre döngüleri) izin için ortak etiketli hücreleri (5 x 104)askıya alın.
- 4.1, 4.2, 4.3 veya 5 adımlarında açıklandığı gibi kürelerde (Gün 5 prostaspheres) etiket tutma hücrelerinin algılanmasını gerçekleştirin.
NOT: Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) ve Far Red uzun ömürlü floresan pro-boyalar ve iyi etiketli hücreler içinde tutulur. Canlı hücrelerdeki hücre içi esteraz, şimdi membran imperkast olan yeşil veya kırmızı floresan molekülleri aktive eden asetat gruplarını yarık.
3. 3D bazal membran kültür sisteminde prostasphere oluşumu
-
3D bazal membran matris sisteminde prostasphere kültürü
- Bir gecede 4 °C'de temel membran matrisini eritin ve kullanmadan önce buzda tutun.
- Buz gibi kültür ortamının eşit hacmine 1 mL buz gibi bodrum membran matrisini hafifçe ekleyin. Kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme yavaş yavaş karıştırın.
NOT: Bu çözeltinin 100 μL'si ile 12 kuyu nun alt kısmını ön katlayın. Bu matris üzerinden düşmek ve bir monolayer olarak büyümek hücrelerin sayısını en aza indirecektir. - 5 x 104 HPrEC hücreleri buz gibi (1:1) bazal membran matris/kültür orta karışımında toplam 500 μL hacimde yeniden askıya alın.
- Pipet 500 μL bu hücre çözeltisi her kuyunun alt kenarı etrafında.
- Eşit kuyunun kenarı etrafında karışımı dağıtmak için plaka girdap. Matrisin katılaması için plakayı 37 °C'de 30 dk'da co2 kuluçka makinesine yerleştirin.
- Matris katıladıktan sonra, kuyu başına 1 mL sıcak kültür ortamı ile kaplayın. Bodrum membran matris halkasını rahatsız etmeyin. Pipet ucunu dikkatlice nişananın ve kültür ortamını kuyunun merkezine dağıtın.
NOT: Katılaşmış bazal membran matrisine eklendiğinde kültür ortamı 37 °C'ye ısıtılmalıdır. Bazal membran matrisi bütünlüğünü kaybeder ve soğuk/serin ortama maruz kaldığında çözünür. - Her 2 günde bir ortam yeniler. Dikkatlice ~ 500 μL harcanan orta aspire ve taze sıcak kültür orta 500 μL ekleyin.
- Ters bir mikroskop kullanarak prostasphere oluşumunu ve büyümesini 5-7 gün boyunca izleyin.
-
Prostaspheres passaging
- Mümkün olduğunca çok ortam azarlayarak matristen prostaspheres hasat. Katılaşmış matrisin yüzen parçalarını rahatsız etmekten veya toplamaktan kaçının.
- 1 mL dispase çözeltisi ekleyin (1:2 oranında insa lı membran matrisi:dispase). Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın.
- Kültür plakalarını 37 °C'de 30 dakika boyunca CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- Küre sayısı sayma ve boyut ölçümleri için kültür çanağının en altında yer alan prostaspheres görüntüleri alın.
- Küre karışımını 15 mL'lik bir tüpe toplayın. Küreleri peletlemek için 5 00 x g'de süspansiyonu 5 dk RT'de santrifüj edin. Aspire ve supernatant atın.
- 500 μL ılık 0.05% trypsin/EDTA ile sindirerek ve süspansiyonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktararak küreleri tek hücrelere ayırın.
- Mikrosentrifuge tüpünü 37 °C'de 5 dakika boyunca CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- %10 FBS içeren 500 μL sıcak PBS ile tripsin eylemini durdurun. Sindirilmiş küre süspansiyonu, küreleri tek hücrelere ayırmak için 26 G iğne 5x ile 1 mL şırıngadan geçirin.
- 5 dk için 500 x g süspansiyon santrifüj RT. Aspirate supernatant ve atmak hücreleri pelet.
- Hücre peletini 1 mL sıcak kültür ortamında yeniden askıya alın ve 40 μm gözenek boyutunaylon hücresüzden süzün.
- Hücre süspansiyonuna 500 x g'de 5 dk'lık bir süre yle RT.Aspire'deki hücreleri atın ve süpernatantatın atın.
- Hücre peletini 1 mL buz gibi (1:1) bazal membran matrisi/kültür ortasında ve prostaspherein ikinci geçişi için 3Boyutlu bir bazal membran matrisinde alt kültürde yeniden askıya alın.
4. BrdU-istinat prostat kök hücrelerinin immünofloresan boyama ile belirlenmesi
- Prostat kök hücresi 2D görüntüleme için immünofloresan (IF) boyama takip bağlı prostaspheres outgrow.
- 3.2.1-3.2.3 adımlarında açıklandığı gibi sindirime karşı dispase ile hasat prostaspheres. 5 dk. 5 00x g'de 1,5 mL mikrosantrifüj tüpteki küreleri santrifüj edin.
- 1 mL sıcak kültür ortamında küreleri yeniden askıya alın.
- Bir gecede 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 200°L kültür ortamında 8 kuyu odasında kuyu başına ~50 prostaspheres incubate ~ 50 prostaspheres ek ve kürelerin büyüme sağlamak için bir gecede.
- 2. gün, aspire ve kültür ortamı atın. Büyümüş küreleri 200 μL PBS ile 5 dakika yıkayın.
- Küreleri 200 μL/kuyudaki buz gibi metanolleri -20 °C'de 20 dk boyunca sabitler.
- Küreleri 200 μL/well pbs ile 5 dk. Tekrar2x yıkayın.
- RT'de 30 dk için 200 μL/kuyu2N HCl ile asit yıkama küreleri.
- Küreleri 200 μL/well pbs ile 5 dk. Tekrarlayın 3x.
- PBST'de %5 normal keçi serumu içeren 100 μL blokaj solüsyonu (PBS % 0,25 Triton X-100 ile) ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Engelleme çözeltisini aspire edin ve her kuyuya %2 normal keçi serumu ve birincil fare anti-insan BrdU antikor (1:200) içeren 100 μL PBST ekleyin ve bir gecede 4 °C'de nemlendirilmiş bir kutuda kuluçkaya yatırın.
NOT: Fare IgG antikornegatif kontrol olarak kullanılır. - Aspire ve birincil antikor çözeltisi çıkarın. Küreleri 200 μL PBS ile 5 dk. Tekrarlayın 2x.
- Her kuyuya %2 normal keçi serumu ve sekonder keçi anti-fare Alexa Fluor 488 antikor (1: 500) içeren 100 μL PBST ekleyin ve 2 saat boyunca karanlıkta RT'de kuluçkaya yatırın.
- Aspire ve ikincil antikor çözeltisi çıkarın. Küreleri 5 dk. Tekrar3x için 200 μL PBS ile yıkayın.
- Slaytları DAPI içeren sulu montaj ortamının ~25-40 μL'si ile monte edin.
- Floresan mikroskop ve renkli dijital fotoğraf makinesi ile lekeli kürelerin/hücrelerin görüntülerini alın.
- Prostat kök hücresi 3D görüntüleme için prostaspheres tüm montaj IF boyama
NOT: Tüm montaj IF boyama için prostaspheres 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler kullanılarak işlenir.- 3.2.1-3.2.3 adımlarında açıklandığı gibi protez sindirimini dispase ile hasat edin. 5 dk. Aspire 500 x g 1,5 mL mikrosantrifüj tüp küreler santrifüj ve atmak.
- 20 dk. 5 00 x g.'da küreleri 5 00 0 0 000'de sentrifuge.
- Peleti 1 mL PBS'de yeniden sulayarak küreleri yıkayın. 5 dk. Aspire supernatant ve atmak için 500 x g küreler santrifüj. 1x'i tekrarlayın.
- Asit 30 dakika boyunca 2N HCl 1 mL pelet resuspend tarafından küreler yıkayın.
- Küreleri 5 dk için 1 mL PBS ve 5 dk. 5 00 x g santrifüj ile yıkayın. 3x'i tekrarlayın.
- PBST'de %5 normal keçi serumu içeren 100 μL blokaj çözeltisinde ~15-30 küreleri yeniden askıya alın (PBS % 0.25 Triton X-100 ile PBS) ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Engelleme çözeltisini çıkarmak için küreleri 5 dk. Aspire etmek için 500 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı atın.
- %2 normal keçi serumu ve birincil fare anti-insan BrdU antikor (1:200) içeren PBST'nin 100 μL'lik kürelerini yeniden askıya alın ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Peleti 1 mL PBS'de yeniden sulayarak küreleri yıkayın. 5 dk. Aspire supernatant ve atmak için 500 x g küreler santrifüj. 1x'i tekrarlayın.
- %2 normal keçi serumu ve sekonder keçi anti-fare Alexa Fluor 488 antikor (1:1.000) içeren PBST'nin 100 μL'lik kürelerini yeniden askıya alın ve RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Peleti 1 mL PBS'de yeniden sulayarak küreleri yıkayın. 5 dk. Aspire supernatant ve atmak için 500 x g küreler santrifüj. 1x'i tekrarlayın.
- DAPI içeren sulu montaj ortamının 30-50 μL'lik kürelerini yeniden askıya alın. Kürelerin düzlemesini önlemek için, onları kapak cam altlı 35 mm'lik kaplamasız kültür çanaktan oluşturulmuş bir kuyuya dağıtın. Sonra iyi kapsayan, kültür çanak bir coverslip ekleyin.
- Aktarılan ışık ters floresan konfokal mikroskobu kullanarak tüm küre Z-yığın görüntüleri elde edin. Bu Z-stack görüntülerini, serbest biçimçizim özelliklerine sahip bir görüntüleme yazılımı kullanarak 3B görüntülere dönüştürün.
NOT: Fare IgG antikornegatif kontrol olarak kullanılır.
- Eşleştirilmiş hücre analizi (4 günlük protokol)
- Kültür Gün 5 BrdU etiketli küreler.
- 1. Gün: 1 mL dispase sindirim ile bir bodrum membran matris küreler hasat. 3.2.1-3.2.11 adımlarında açıklandığı gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte %500°L ılık %0,05 tripsin/EDTA ile tek hücrelere dağılın.
- 1 mL sıcak kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
- Plaka dağılmış tek hücreleri (~ 300-500 kuyu başına) 8 iyi oda slaytlar ve kültür 200 μL / iyi kültür orta gecede eki izin vermek için.
- 2. Gün: Kültür ortamında 200 μL 2μL sitokasin D ile kültür ortamını değiştirin ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırArak geç metafazda duraklayan bir hücre bölünmesine izin verin.
- 3-4. Gün: Aspire ve orta atın. Hücreleri 200 μL/well buz gibi metanol20 dakika -20 °C'de düzeltin.
- Floresan mikroskobu ile eşleştirilmiş hücrelerin görüntülerini alın. BrdU-retansiyonuna bağlı olarak iki çekirdek arasındaki mesafenin 30 μm'den az olduğundan emin olun, eşleştirilmiş kök hücreleri simetrik veya asimetrik hücre bölünmesi olarak tanımlayın.
NOT: BrdU etiket-istinat prostat kök hücreleri brdu eşit miktarda istinat iki kız kök hücreleri neden simetrik bölünme geçmesi, asimetrik bölünme geçiren kök hücreler tüm BrdU ve istinat bir kız kök hücre yol açar BrdU etiketini kaybetmiş diğer kız ata hücresi.
5. CFSE etiket-istinat prostat kök hücrelerinin FACS sıralaması ile izolasyonu
- 5. Gün: 3D kültürde 6 kuyu kültür plakasında yetişen CFSE etiketli gün 5 prostaspheres hasat dispase 2 mL (bazal membran matris: 1:2 oranında dispase) ile orta değiştirerek. Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez iyice karıştırmak için.
- Matrisi sindirmek için 37 °C'de 30 dk'da bir CO2 kuluçka makinesinde plakaları kuluçkaya yatırın.
- Küre karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın. Küreleri 500 x g'de 5 dk'da sentrifuge.
- Küre peletini 500 μL ılık %0,05 tripsin/EDTA'da yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosentrifuge tüpüne aktarın.
- 37 °C'de 37 °C'de bir CO2 kuluçka makinesindeki küreleri 5 dakika kuluçkaya yatırın. %10 FBS içeren 500 μL sıcak PBS ekleyin.
- Küreleri 26 G iğne 5x ile 1 mL şırıngadan geçirerek küreleri tek hücrelere tamamen ayırın.
- Hücreleri 500 x g'de 5 dk.'da 5 dk. Aspire edin ve süpernatantatın.
- 1 μg/mL propidium iyodür (PI) içeren sıcak kültür ortamının 1 mL'lik hücrelerini yeniden askıya alın ve ölü hücreleri lekeleyin. RT'de 1 dakika kuluçka.
- Hücreleri 500 x g'de 5 dk.'da 5 dk. Aspire edin ve süpernatantatın.
- 1 mL sıcak kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri 500 x g'de 5 dk.'da 5 dk. Aspire edin ve süpernatantatın.
- Hücreleri 500 μL sıcak kültür ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri 35 m gözenek boyutuhücre süzgeci nden filtreleyerek 5 mL polistiren yuvarlak alt tüplerinde toplayın.
- Tek kanallı FACS analizörü ile tripsin dağılmış CFSE etiketli prostasphere hücrelerinin analizini yapın.
- Fraksiyona sahip CFSEHi, CFSEMedve CFSELo hücrelerinin alt popülasyonlarını kapıla. Gating için negatif ve pozitif denetimleri kullanın.
NOT: FACS sıralanmış CFSE etiket istinat prostat kök hücrelerinin varlığı (Hu ve ark.13)yeşil floresan mikroskopisi ve daha büyük hücre büyüklüğü istinat olmayan hücrelere göre teyit edilebilir. Bu büyük hücre büyüklüğü, projen hücre popülasyonlarına göre prostat kök hücrelerinin bir özelliğidir. Bu diğer doku tipleri ile farklı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primer normal insan prostat epitel hücreleri fibronektin kaplı kültür yemekleriiçine yerleştirilir ve hücre büyümesi 2D kültürkorunur(Şekil 1a). Bir bazal membran matris ile 3D kültüre transfer üzerine, farklılaşmış epitel hücreleri yavaş yavaş ölür. Sadece prostat kök hücreleri çapasız bir kültürde hayatta kalabilir ve 5 gün içinde spheroidler oluşturabilir(Şekil 1b).
Prostat epitel hücrelerinin 2B kültürde çift etiketlemesi ve ardından 3D kültürde küresel oluşum, aynı etiket tutma hücrelerinde BrdU, CFSE ve Far Red'in birlikte lokalizasyonunu gösterir(Şekil 2a-i).
Etiket istinat hücreleri 5. Çift immünboyama etiket istinat hücrelerinin sitokeratin proteini KRT14 daha düşük seviyelerde sergilediğini göstermektedir; azalmış hücre kavşak proteini E-kadherin14; artmış kök hücre erken marker proteinleri Wnt10B13,15,16 ve ALDH1A1; artmış otofaji proteini LC3, otofaji akı aktivitesinin bir göstergesi17; ve artmış miyozin IIB (Şekil 3a-f).
Spheroid tabanlı etiket tutma testi de prostat kanseri örneklerinde kanser kök benzeri hücreleri başarıyla tespit eder(Şekil 4). Bu kanser kök benzeri hücreler için gerçek biyobelirteçlerin keşfi sağlayacak ve prostat kanseri için yeni terapötik hedefleri belirlemek için potansiyele sahiptir.
Şekil 1: HPrEC'nin 2D kültürde bakımı ve 3D kültürde küresel formasyon. (a) HPrEC'in 2D birincil kültürü BrdU etiketli ve5. Ölçek çubukları = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Primer prostaspheres uzun vadeli etiket istinat hücrelerinin belirlenmesi. BrdU (kırmızı) ve CFSE (yeşil) çift etiketleme; CFSE (yeşil) ve Far Red (kırmızı); BrdU (yeşil) ve Far Red (kırmızı) ebeveyn DNA'sının tutulması ile aynı kök benzeri hücreleri tanımladı. Hızla bölünen progenitor hücrelerinde (DAPI, mavi) herhangi bir BrdU, CFSE veya Far Red etiketleri seyreltilmiş ve kaybedilmiş(a-i). Temsili görüntüler BrdU/CFSE(a-c)(üst panel), CFSE/Far Red(d-f)(orta panel) ve BrdU/Far Red(g-i)(alt panel) tek prostasphere (PS) hücrelerinde ortak etiketlemeyi göstermektedir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kök hücre özelliklerini gösteren etiket tutucu PS hücreleri. Etiket tutmayan ata hücreleri ile karşılaştırıldığında, BrdU veya CFSE etiket tutucu kök hücre sergisi(a)daha düşük sitokeratin 14 (KRT 14), (b) E-kadherin düzeylerinde azalma, (c) Wnt10B yüksek seviyeleri, (d) ALDH1A1 yüksek seviyelerde, (e) artmış LC3, ve (f) artmış myosos iIBs protein. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kanser kök benzeri hücrelerin tanımlanması için küre bazlı etiket tutma testini kullanma. CFSE etiket istinat kanser kök benzeri hücreler insan prostat kanseri örnekleri elde edilen spheroidler olmayan etiketli progenitor hücrelere göre azaltılmış E-kadherin protein ilerler. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birden fazla kök hücre yüzey belirteçleri kullanarak Akış sitometrisi hem özgüllük ve seçicilik1,5,6eksik rağmen kök hücre araştırmaları için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Bir 3D kültür sisteminde küresel oluşumu birincil epitel hücrelerinden nadir kök hücre popülasyonunu zenginleştirmede başka yararlı bir yöntem iken, HPrEC dahil, ortaya çıkan sferoidler hala kök ve progenitor hücrelerinin heterojen bir karışımıdır2,3,4. Prostaspheres, hızla çoğalan progenitor hücreleri ile karşılaştırıldığında, kök hücrelerin nispeten quiescent karakteri onları uzun vadeli etiket tutma testi ile tespit edilmesine olanak sağlar.
Bu yazıda özetlenen yöntemler, HPrEC'nin BrdU, CFSE ve/veya Far Redpro-boya13 kullanılarak etiketlendiğini açıklar. BrdU, CFSE, ve / veya Far Red pro-boyalar hızla çoğalan hücrelerde tüm hızlı bir şekilde her hücre bölünmesi tarafından seyreltilmiş iken, ölümsüz iplikçik DNA ayrımı 11 olarak bilinen BrdU kaybı için hesaplar ek bir mekanizma vardır11. Bu kök hücre asimetrik bölünme uğrar, bir kız kök hücre ve bir ata hücresi neden olmasıdır. Kız kök hücre BrdU etiketi ile tüm eski ebeveyn DNA korur, kızı ata hücre BrdU etiketi olmadan yeni sentezlenen DNA alır. Bu nedenle, BrdU kullanılarak yapılan bir etiket tutma tonu, etiket tutucu kök hücrelerin immünororesan boyama ile daha net ve daha kolay tanımlanmasına olanak tanır. Bu özellikle iki farklı antikor kullanarak IF çift boyama ile kök hücre biyobelirteçleri onaylamak için yararlıdır. BrdU etiketlemenin önemli bir sınırlaması, hücrelerin IF boyama için düzeltilmesi, böylece BrdU etiketleme ve hücre fiksasyonu sonrasında daha fazla fonksiyonel çalışmaların önlenmesidir.
Bu sorunu çözmek için, canlı HPrEC etiketleme için iki floresan pro-boyalar etiket tutma tahlilleri test edildi. Sonuçlar, BrdU, CFSE ve Far Red etiketli küre hücrelerinin tam bir çakışması olduğunu göstermiştir. BrdU etiketi CFSE veya Far Red ile değiştirilebilir küre tabanlı etiket istinat tahlilleri facs tarafından görüntüleme ve ayırma için canlı hücrelerin görselleştirilmesi ne izin vermek, in vitro hücre kültürü tahlilleri ve in vivo xenograft tahlilleri hem kullanarak izole canlı kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu teşvik13. CFSE veya Far Red etiket tabanlı FACS sıralanmış canlı kök ve progenitor hücreleri de tek hücreli RNA-seq dahil Olmak üzere RNA-seq için kullanılabilir, hangi çok yeni kök hücre gen belirteçleri ve sinyal yolları yanı sıra epitel hücre soy hiyerarşisi belirlenmesinde güçlüdür.
Burada sunulan bir sferoid tabanlı etiket tutma teşrisi ile kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu yeni biyomarker-free yöntemi birincil hasta örnekleri ve kanser hücre hatları kanser kök benzeri hücreleri tespit edebilirsiniz. Böylece, kanser kök benzeri hücrelerin yeni biyobelirteçleri keşfetmek ve kanser hedefleyen etkili terapötikler geliştirmek için bir cadde sağlar13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmek için mali ilişkileri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Kanser Enstitüsü R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) hibeleri ile desteklenmiştir. Biz hücre sıralama konusunda yardım için Chicago Illinois Üniversitesi'nde Akış Sitometri Çekirdek teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al.
