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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/60357
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Urology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Pathology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Utilisant les cellules épithéliales primaires humaines de prostate, nous rapportons une nouvelle méthode biomarqueur-libre de caractérisation fonctionnelle des cellules de tige-comme par un test sphéroïde-basé d'étiquette-rétention. Un protocole étape par étape est décrit pour l'étiquetage des cellules BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formation sphénoïde tridimensionnelle; identification des cellules souches de conservation de l'étiquette par immunocytochimie; et l'isolement par FACS.

Abstract

Malgré les progrès de la recherche sur les cellules souches adultes, l'identification et l'isolement des cellules souches à partir de spécimens de tissus demeure un défi majeur. Bien que les cellules souches résidentes soient relativement calmes avec des contraintes de niche dans les tissus adultes, elles entrent dans le cycle cellulaire dans la culture tridimensionnelle sans ancre (3D) et subissent à la fois une division cellulaire symétrique et asymétrique, donnant naissance à la fois à la tige et à l'ancêtre. Cellules. Ces derniers prolifèrent rapidement et constituent la principale population cellulaire à divers stades de l'engagement de la lignée, formant des sphéroïdes hétérogènes. Utilisant les cellules épithéliales humaines normales primaires de prostate (HPrEC), un test sphéroïde, d'étiquette-rétention a été développé qui permet l'identification et l'isolement fonctionnel des cellules souches sphéroïdes-initiatrices à une résolution simple de cellules.

HPrEC ou lignées cellulaires sont cultivées en deux dimensions (2D) avec BrdU pendant 10 jours pour permettre son incorporation dans l'ADN de toutes les cellules de division, y compris les cellules souches auto-renouvelables. Le lavage commence lors du transfert à la culture 3D pendant 5 jours, au cours desquels les cellules souches se renouvellent par division asymétrique et initient la formation sphéroïde. Tandis que les cellules souches de fille relativement calmes conservent l'ADN parental BrdU-étiqueté, les ancêtres de fille prolifèrent rapidement, perdant l'étiquette brdU. Le BrdU peut être remplacé par des colorants pro CFSE ou Far Red, qui permettent l'isolement des cellules souches vivantes par le FACS. Les caractéristiques des cellules souches sont confirmées par la formation in vitro de sphéroïdes, les essais de régénération des tissus in vivo et la documentation de leurs divisions cellulaires symétriques/asymétriques. Les cellules souches isolées qui conservent l'étiquette peuvent être rigoureusement interrogées par des études moléculaires et biologiques en aval, y compris l'ARN-seq, le ChIP-seq, la capture d'une seule cellule, l'activité métabolique, le profilage du protéome, l'immunocytochimie, la formation d'organoïdes et la régénération des tissus in vivo. Fait important, cette approche d'isolement des cellules souches fonctionnelles sans marqueuridentifie les cellules souches à partir de spécimens de cancer frais et de lignées de cellules cancéreuses provenant de plusieurs organes, ce qui suggère une large applicabilité. Il peut être utilisé pour identifier les biomarqueurs de cellules souches du cancer, dépister les produits pharmaceutiques ciblant les cellules souches cancéreuses et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques dans les cancers.

Introduction

La prostate humaine contient l'épithélium luminal avec la fonction sécrétrice et les cellules basales la sous-jacente s'il y a un composant neuroendocrine peu commun de cellules. Les cellules épithéliales, dans ce cas, sont générées à partir d'une population rare de cellules souches de la prostate qui sont relativement calmes in vivo et agissent comme un système de réparation pour maintenir l'homéostasie glandulaire tout au long de la vie1. Malgré de nombreux progrès, l'identification et l'isolement fonctionnel des cellules souches de la prostate demeurent un défi majeur dans le domaine. Les biomarqueurs de cellules souches, y compris les méthodologies basées sur les marqueurs de surface cellulaire combinés à la cytométrie du débit sont couramment utilisés pour la recherche sur les cellules souches2,3,4. Cependant, les résultats pour l'enrichissement et l'isolement varient considérablement en fonction des combinaisons de marqueurs et de la spécificité d'anticorps5,6, soulevant des questions au sujet de l'identité des cellules isolées. Une autre approche largement utilisée pour l'enrichissement cellulaire de type souche est la culture sphéroïde tridimensionnelle (3D)2,3,4. Bien que les cellules souches résidentes soient relativement calmes in vivo avec des contraintes de niche, elles subissent une division cellulaire dans la culture de la matrice 3D (à la fois symétrique et asymétrique), générant à la fois des cellules souches et progénitrices qui se reproduisent rapidement vers l'engagement de lignée7,8. Les sphéroïdes formés sont un mélange hétérogène contenant à la fois des cellules souches et des cellules progénitrices à divers stades de l'engagement de la lignée, y compris les cellules progénitrices à un stade précoce et avancé. Ainsi, les essais utilisant l'ensemble des sphéroïdes ne sont pas exclusifs aux cellules souches, ce qui rend l'identification des propriétés uniques des cellules souches non concluante. Par conséquent, il est essentiel de créer des essais pour identifier et séparer les cellules souches de la prostate de leurs ancêtres filles. À cette fin, l'objectif du protocole actuel est d'établir un système d'analyse qui permet l'identification efficace et l'isolement des cellules souches des tissus de la prostate humaine suivies d'une analyse robuste en aval de leurs fonctions biologiques.

La rétention à long terme de l'étiquette 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) est largement utilisée pour le traçage in vivo et in vitro des cellules souches en fonction de leur temps de doublement prolongé9,10. L'approche actuelle pour l'identification et l'isolement de cellules souches de prostate décrites ci-dessus est basée sur leurs caractéristiques quiescentes relatives et leurs propriétés d'étiquette-rétention dans une population épithéliale mélangée. En outre, sur la base de l'hypothèse de l'ADN brin immortel, seules les cellules souches peuvent subir une division asymétrique des cellules. La cellule souche représente la cellule fille qui contient l'ADN parental plus ancien tandis que la cellule progénitrice, qui est une cellule fille engagée, reçoit l'ADN nouvellement synthétisé. La propriété unique de cellules souches décrite ci-dessus est exploitée pour effectuer l'étiquetage BrdU dans les cellules souches parentales dans les cultures primaires, puis suivre leur étiquette après BrdU-washout lors du transfert à la culture sphéroïde 3D sans ancrage. Tandis que la majorité des cellules épithéliales primaires de prostate maintiennent un phénotype basal et de transit amplifiant dans la culture 2D, il y a également une population rare de cellules souches multipotentes réapprovisionnant et maintenant l'homéostasie épithéliale comme démontré par la formation des sphéroïdes ou des organoïdes entièrement différenciés avec les médias de culture correspondants sur le transfert aux systèmes 3D3,12. Dans notre protocole actuel, en utilisant des sphéroïdes de la prostate HPrEC ou des tests de rétention BrdU, CFSE ou Far Red à base de prostasphere, suivis du tri des cellules activées par la fluorescence (FACS), nous identifions les cellules souches qui conservent l'étiquette dans les sphéroïdes à un seul niveau cellulaire13.

Fait important, nous avons confirmé en outre les caractéristiques des cellules souches des cellules de rétention d'étiquette dans les sphéroïdes à un stade précoce par rapport aux cellules progénitrices avec engagement de lignée. Ceux-ci incluent la division asymétrique de cellules souches, la capacité de formation sphéroïde in vitro et la capacité de régénération in vivo de tissu, l'activité élevée d'autophagie, la biogenèse augmentée de ribosome et l'activité métabolique diminuée. Par la suite, l'analyse de RNAseq a été exécutée. Des gènes exprimés différemment dans les cellules sphéroïdes qui conservent l'étiquette ont été observés qui peuvent servir de nouveaux biomarqueurs pour les cellules souches de la prostate humaine. Cette approche de conservation de l'étiquette à base de sphéroïdes peut s'appliquer aux échantillons de cancer afin d'identifier de la même façon un petit nombre de cellules souches cancéreuses, offrant ainsi des possibilités translationnelles de gérer les populations résistantes à la thérapeutique13. Présenté ci-dessous est le test de rétention d'étiquette à base de prostasphère à l'aide de cellules épithéliales primaires humaines de la prostate (HPrEC) à titre d'exemple.

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Protocol

Toutes les manipulations cellulaires et les préparations pour les médias doivent être effectuées avec une technique aseptique dans un coffret de sécurité biologique de classe II (BSC).

1. Culture et entretien des cellules HPrEC en 2D

  1. Enrober les plats de culture de 100 mm d'une solution de 2 ml de 2,5 g/cm2 de fibronectin pendant la nuit à température ambiante (RT). Aspirez la solution et laissez sécher les plats de culture dans le BSC pendant 45 min. Les plats de culture enrobés de fibronectin peuvent être conservés de 2 à 4 semaines à 4 oC.
  2. Ajouter 9 ml du milieu de croissance épithélial de la prostate (p. ex. PrEGM) dans un plat de culture de 100 mm recouvert de fibronectin et garder le plat au chaud dans un incubateur de CO2 à 37 oC.
  3. Décongeler une fiole de cellules HPrEC congelées (2 x 105/mL) dans un bain d'eau de 37 oC et resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu chaud.
  4. Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirate et jetez le supernatant.
  5. Resuspendre soigneusement les cellules dans 1 ml du milieu de culture chaude. Cellules de semence saucission en pipetilant 1 ml de la suspension cellulaire directement dans le plat de culture de 100 mm recouvert de fibronectine contenant 9 ml du milieu préchauffé (volume total de milieu et de cellules est de 10 ml). Remettre les plats de culture dans un incubateur de CO2 à 37 oC.
  6. Réapprovisionnez le milieu tous les 2 jours. Pour ce faire, aspirez soigneusement tous les supports et ajoutez 10 ml de milieu frais et chaud.
  7. En environ 5 jours, assurez-vous que les cultures sont de 70 à 80% de confluents. Effectuer la digestion enzymatique en couvant les cellules avec 3 ml de 0,05% Trypsin/EDTA à 37 oC pendant 5 min.
  8. Arrêter la digestion en ajoutant 3 ml de PBS chaud contenant 10% DE FBS.
  9. Recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 50 ml et centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirate et jeter le supernatant.
  10. Resuspendre la pastille cellulaire dans 30 ml de milieu chaud et la distribuer également dans trois nouveaux plats de culture de 100 mm recouverts de fibronectin pour le prochain passage.
    REMARQUE : Les cellules primaires de HPrEC peuvent être passages de 3 à 5x sans altérer leurs caractéristiques épithéliales basiques. Le phénotype épithélial est examiné par des expressions des marqueurs épithélial bashéliaux de cellules cytokeratin 5 et p63 avec des essais d'immunocytochimie/immunofluorescent (ICC/IF).

2. Étiquetage HPrEC avec BrdU, CFSE, ou Far Red pro-colories

REMARQUE : Les cellules peuvent procéder à l'étape 2.1 ou à l'étape 2.2 suivie du transfert à la culture de prostasphere 3D comme décrit à l'étape 3.1.

  1. Étiquetage unique des cellules avec BrdU
    1. Culture 2 x 105 cellules HPrEC dans des plats de culture de 100 mm recouverts de fibronectin avec 10 ml de milieu chaud contenant 1 M de BrdU. Culture des cellules pendant 10 jours (sur deux passages) pour assurer l'étiquetage de toutes les cellules, y compris les cellules souches de la prostate et progénitrice.
    2. Après 10 jours, aspirez soigneusement le milieu PrEGM contenant le BrdU et lavez les cellules avec 5 ml de PBS chaud. Répéter 1x.
    3. Effectuez la digestion enzymatique en utilisant 0.05% trypsin/EDTA comme décrit dans les étapes 1.7-1.8. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirate et jeter le supernatant.
    4. Resuspendre les cellules granulées étiquetées BrdU (5 x 104) dans 500 l de matrice/moyenne de membrane de la membrane du sous-sol (1:1) et transférer dans une culture de prostasphère 3D (décrite à l'étape 3.1) pendant 5 jours pour permettre le lavage du BrdU pendant la formation sphéroïde (cycles cellulaires de 6).
  2. Double étiquetage des cellules avec BrdU et CFSE ou Far Red pro-colorants
    1. Si l'étiquetage des cellules vivantes est souhaité, prenez les cellules pré-étiquetées incubées avec BrdU pendant 10 jours à partir de l'étape 2.1 et co-étiquette avec 5 M CFSE ou Far Red cellules vivantes fluorescentes pro-colories pendant 30 min. Effectuer le co-étiquetage au jour 10.
    2. Aspirez soigneusement le milieu contenant BrdU et CFSE ou Far Red pro-colories. Laver les cellules avec 5 ml de PBS chaud. Répéter le lavage 1x.
    3. Effectuez la digestion enzymatique en utilisant 0.05% trypsin/EDTA comme décrit dans les étapes 1.7-1.8. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à RT. Retirez et jetez le supernatant.
    4. Resuspendre les cellules co-étiquetées (5 x 104) dans 500 l de matrice/moyenne de membrane de la membrane du sous-sol (1:1) et transférer dans une culture de prostasphère 3D (décrite à la section 3.1) pendant 5 jours pour permettre brdU et CFSE ou Far Red au lavage pendant la formation sphéroïde (cycles de 6 cellules).
  3. Effectuer la détection des cellules de rétention d'étiquette s'est ressédent dans les sphères (prostasphères du jour 5) telles que décrites aux étapes 4.1, 4.2, 4.3 ou 5.
    REMARQUE : L'ester de succinimidyl de diactate de Carboxyfluorescein (CFSE) et le rouge lointain sont des pro-colorants fluorescents durables et sont bien conservés dans les cellules étiquetées. L'estérase intracellulaire dans les cellules vivantes cense les groupes d'acétate qui activent les molécules fluorescentes vertes ou rouges qui sont maintenant impermeant de membrane.

3. Formation de prostasphere dans le système de culture de membrane de sous-sol 3D

  1. Culture de prostasphere dans le système 3D de matrice de membrane de sous-sol
    1. Décongeler la matrice membranaire du sous-sol à 4 oC pendant la nuit et garder sur la glace avant utilisation.
    2. Ajouter délicatement 1 ml de matrice de membrane de sous-sol glacée dans un volume égal du milieu de culture glace-froid. Mélanger lentement en faisant monter et descendre, en évitant les bulles.
      REMARQUE : Pré-enrober le fond de 12 puits de plaque de culture de puits avec 100 L de cette solution. Cela permettra de minimiser le nombre de cellules qui tombent à travers la matrice et se développent comme une monocouche.
    3. Resuspendre 5 x 104 cellules HPrEC dans un mélange de matrice de membrane/culture de la membrane du sous-sol (1:1) dans un volume total de 500 L.
    4. Pipette 500 l de cette solution cellulaire autour de la jante inférieure de chaque puits.
    5. Faire pivoter la plaque pour répartir uniformément le mélange autour du bord du puits. Placer la plaque dans un incubateur de CO2 à 37 oC pendant 30 min pour permettre à la matrice de se solidifier.
    6. Une fois la matrice solidifiée, recouvrir de 1 ml de milieu de culture chaud par puits. Ne pas déranger l'anneau de matrice de membrane de sous-sol. Visez soigneusement la pointe de pipette et distribuez le milieu de culture au centre du puits.
      REMARQUE : Le milieu de culture doit être réchauffé à 37 oC lorsqu'il est ajouté à la matrice de membrane du sous-sol solidifié. La matrice de membrane de sous-sol perdra son intégrité et se dissoudra une fois exposée aux médias froids/frais.
    7. Réapprovisionner en milieu tous les 2 jours. Aspirez soigneusement 500 'L de milieu usé et ajoutez 500 'L de milieu de culture chaud frais.
    8. Surveiller la formation et la croissance de la prostasphère pendant 5 à 7 jours à l'aide d'un microscope inversé.
  2. La passage des prostasphères
    1. Récoltez les prostasphères de la matrice en aspirant soigneusement le plus de médias possible. Évitez de déranger ou de ramasser des morceaux flottants de la matrice solidifiée.
    2. Ajouter 1 mL de solution de dispase (matrice de membrane de sous-sol : dispase à un rapport de 1:2). Mélanger soigneusement en faisant monter et descendre plusieurs fois.
    3. Incuber les plaques de culture dans un incubateur de CO2 à 37 oC pendant 30 min.
    4. Prenez des images de prostasphères qui sont au bas du plat de culture pour le comptage des nombres de sphères et les mesures de taille.
    5. Recueillir le mélange de sphère dans un tube de 15 ml. Centrifugelas la suspension à 500 x g pendant 5 min à RT pour granuler les sphères. Aspirer et jeter le supernatant.
    6. Dispersez les sphères en cellules individuelles en digérant à l'intérieur de 500 ll de trypsine/EDTA chaude de 0,05 % et en transférant la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
    7. Incuber le tube de microcentrifuge dans un incubateur de CO2 à 37 oC pendant 5 min.
    8. Arrêtez l'action trypsine avec 500 L de PBS chaud contenant 10% de FBS. Passer la suspension de sphère digérée à travers une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G 5x pour dissocier les sphères en cellules simples.
    9. Centrifugelant la suspension à 500 x g pendant 5 min pour granuler les cellules à RT. Aspirer le supernatant et jeter.
    10. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu de culture chaude et filtrer à travers une passoire à cellules en nylon de taille pore de 40 m.
    11. Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min pour granuler les cellules à RT. Aspirate et jeter le supernatant.
    12. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de matrice de membrane de sous-sol(1:1) et de sous-culture dans une matrice de membrane de sous-sol 3D pour le deuxième passage de la prostasphère.

4. Identification des cellules souches de la prostate brdU-retenues par coloration immunofluorescente

  1. Dépasser les prostasphères attachées suivies de la coloration immunofluorescente (IF) pour la formation image 2D des cellules souches de la prostate.
    1. Récolte des prostasphères par digestion de dépase comme décrit dans les étapes 3.2.1-3.2.3. Centrifuger les sphères dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml à 500 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant.
    2. Resuspendre les sphères dans 1 ml de milieu de culture chaude.
    3. Incuber 50 prostasphères par puits dans 8 toboggans de chambre de puits dans 200 l de milieu de culture dans un incubateur de 37 oC pendant la nuit pour permettre l'attachement et la croissance des sphères.
    4. Le jour 2, aspirez et jetez le milieu de la culture. Laver les sphères dépassées avec 200 OL de PBS pendant 5 min.
    5. Fixer les sphères dans 200 l/puits de méthanol glacé à -20 oC pendant 20 min.
    6. Laver les sphères avec 200 l/puits de PBS pendant 5 min. Répétez 2x.
    7. Sphères de lavage à l'acide avec 200 l/puits de 2N HCl pendant 30 min à RT.
    8. Laver les sphères avec 200 l/puits de PBS pendant 5 min. Répétez 3x.
    9. Ajouter 100 l de solution de blocage contenant 5% de sérum de chèvre normal en SPL (PBS avec 0,25% Triton X-100) et incuber pendant 30 min à RT.
    10. Aspirez la solution de blocage et ajoutez 100 L de PBST contenant 2 % de sérum de chèvre normal et d'anticorps BrdU de souris primaires (1:200) à chaque puits et incubez dans une boîte humidifiée à 4 oC pendant la nuit.
      REMARQUE : L'anticorps IgG de souris est employé comme commande négative.
    11. Aspirez et retirez la solution d'anticorps primaire. Laver les sphères avec 200 oL de PBS pendant 5 min. Répétez 2x.
    12. Ajouter 100 L de PBST contenant 2% de sérum de chèvre normal et secondaire chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 anticorps (1: 500) à chaque puits et incuber à RT dans l'obscurité pendant 2 h.
    13. Aspirez et retirez la solution d'anticorps secondaire. Laver les sphères avec 200 oL de PBS pendant 5 min. Répétez 3x.
    14. Montez les toboggans avec un support de montage aqueux contenant du DAPI de 25 à 40 l à l'eau.
    15. Obtenez des images des sphères/cellules tachées avec un microscope fluorescent et un appareil photo numérique couleur.
  2. Tamonentier FI coloration des prostaspheres pour l'imagerie 3D de cellules souches de prostate
    REMARQUE : Pour la coloration de montage entier, les prostaspheres sont manipulés à l'aide de tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml.
    1. Récoltez les prostaspheres en dispasant la digestion tel que décrit dans les étapes 3.2.1-3.2.3. Centrifuger les sphères dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml à 500 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et jeter.
    2. Resuspendre et fixer les sphères avec 1 ml de 4% de paraformaldéhyde à RT pendant 20 min. Centrifuger les sphères à 500 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et jeter.
    3. Laver les sphères en rependant la pastille dans 1 ml de PBS. Centrifuger les sphères à 500 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et jeter. Répéter 1x.
    4. Laver les sphères à l'acide en rependant la pastille en 1 ml de 2N HCl pendant 30 min.
    5. Laver les sphères avec 1 ml de PBS pendant 5 min et la centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et jeter. Répéter 3x.
    6. Resuspendre 15 à 30 sphères dans 100 oL de solution de blocage contenant 5 % de sérum de chèvre normal en PBST (PBS avec 0,25 % Triton X-100) et incuber pendant 30 min à RT.
    7. Pour enlever la solution de blocage, centrifuger les sphères à 500 x g pendant 5 min. Aspirer et jeter le supernatant.
    8. Resuspendre les sphères dans 100 OL de PBST contenant 2% de sérum de chèvre normal et d'anticorps brdU de souris primaire (1:200) et incuber à 4 oC pendant la nuit.
    9. Laver les sphères en rependant la pastille dans 1 ml de PBS. Centrifuger les sphères à 500 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et jeter. Répéter 1x.
    10. Resuspendre les sphères dans 100 OL de PBST contenant 2% de sérum de chèvre normal et de chèvre secondaire anti-souris Alexa Fluor 488 anticorps (1:1,000) et incuber à RT pendant 2 h.
    11. Laver les sphères en rependant la pastille dans 1 ml de PBS. Centrifuger les sphères à 500 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et jeter. Répéter 1x.
    12. Resuspendre les sphères dans 30 à 50 oL de support de montage aqueux contenant du DAPI. Pour éviter d'aplatir les sphères, les distribuer dans un puits créé à partir d'un plat de culture non couché de 35 mm avec un fond de verre de couverture. Ajouter ensuite un bordereau au plat de culture, en couvrant le puits.
    13. Acquérir des images de la sphère entière Z-pile à l'aide d'un microscope confocal fluorescent inversé par la lumière transmise. Convertissez ces images Z-stack en images 3D à l'aide d'un logiciel d'imagerie doté de capacités de dessin de forme libre.
      REMARQUE : L'anticorps IgG de souris est employé comme commande négative.
  3. Analyse des cellules jumelées (protocole de 4 jours)
    1. Culture les sphères étiquetées BrdU au Jour 5.
    2. Jour 1: Récoltez les sphères à partir d'une matrice de membrane de sous-sol avec 1 ml de digestion de dispase. Dispersez-vous en cellules simples par 500 ll de trypsine/EDTA chaude de 0,05 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml tel que décrit dans les étapes 3.2.1-3.2.11.
    3. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture chaude.
    4. Plaquer les cellules individuelles dispersées (300 à 500 par puits) dans 8 toboggans de chambre de puits et la culture dans 200 l /milieu de culture de puits pendant la nuit pour permettre l'attachement.
    5. Jour 2 : Changer le milieu de culture avec 200 l de 2 M cytochalasine D dans le milieu de culture et incuber pendant la nuit à 37 oC pour permettre une division cellulaire qui s'arrête à la métaphase tardive à l'anaphase.
    6. Jour 3-4: Aspirer et jeter le milieu. Fixer les cellules dans 200 l/puits de méthanol glacé à -20 oC pendant 20 min. Suivez le protocole d'immunostaining pour BrdU tel que décrit dans les étapes 4.1.5-4.1.14.
    7. Prenez des images de cellules jumelées avec un microscope à fluorescence. Assurez-vous que la distance entre les deux noyaux est inférieure à 30 m. En fonction de la rétention brdU, identifiez les cellules souches appariées comme subissant une division de cellules symétriques ou asymétriques.
      REMARQUE : Les cellules souches de la prostate qui conservent l'étiquette BrdU subissent une division symétrique pour donner naissance à deux cellules souches filles conservant une quantité égale de BrdU, tandis que les cellules souches subissant une division asymétrique donnent naissance à une cellule souche fille conservant tous les BrdU et le cellule progénitrice qui a perdu l'étiquette BrdU.

5. Isolement des cellules souches de la prostate qui retiennent l'étiquette CFSE par tri FACS

  1. Jour 5 : Récoltez les prostasphères de jour 5 étiquetées CFSE qui poussent dans 6 plaques de culture de puits dans la culture 3D en remplaçant le milieu par 2 ml de dispase (matrice de membrane de sous-sol : dispase à un rapport de 1:2). Pipette de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger.
  2. Incuber les plaques dans un incubateur de CO2 à 37 oC pendant 30 min pour digérer la matrice.
  3. Recueillir le mélange de sphère dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger les sphères à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le supernatant et jeter.
  4. Resuspendre la pastille de sphère dans 500 l de trypsine chaude de 0,05% /EDTA, et transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
  5. Incuber les sphères dans un incubateur de CO2 à 37 oC pendant 5 min. Ajouter 500 l de PBS chaud contenant 10 % de FBS.
  6. Passer les sphères à travers une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G 5x pour dissocier complètement les sphères en cellules simples.
  7. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirate et jeter le supernatant.
  8. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture chaude contenant 1 iodide de propidium (PI) pour tacher les cellules mortes. Incuber 1 min à RT.
  9. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirate et jeter le supernatant.
  10. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture chaude. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à RT. Aspirate et jeter le supernatant.
  11. Resuspendre les cellules dans 500 l de milieu de culture chaude et de recueillir les cellules dans 5 ml de polystyrène tubes de fond rond en les filtrant à travers 35 pore taille cellule spassoires snap capillaires.
  12. Effectuez l'analyse des cellules de prostasphere étiquetées CFSE-dispersées par trypsine avec un analyseur FACS à un seul canal.
  13. Portez les sous-populations des cellules cfSEHifractionnaires, CFSEMedet CFSELo. Utilisez les contrôles négatifs et positifs pour le gating.
    REMARQUE : La présence de cellules souches de la prostate qui conservent l'étiquette CFSE triées par FACS (voir Hu et coll.13) peut être confirmée par microscopie à fluorescence verte et leur plus grande taille de cellules comparativement aux cellules non retenues. Cette plus grande taille de cellules est une propriété des cellules souches de prostate par rapport aux populations de cellules progénitrices. Cela peut être différent avec d'autres types de tissus.

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Representative Results

Les cellules épithéliales normales primaires de prostate sont placées dans des plats de culture fibronectin-enduits et la croissance cellulaire est maintenue dans la culture 2D(figure 1a). Lors du transfert dans la culture 3D avec une matrice de membrane de sous-sol, les cellules épithéliales différenciées meurent lentement. Seules les cellules souches de la prostate peuvent survivre dans une culture sans ancrage et former des sphéroïdes en 5 jours (figure 1b).

L'étiquetage double des cellules épithéliales de prostate dans la culture 2D suivie de la formation sphéroïde dans la culture 3D indique la colocalisation de BrdU, de CFSE, et de rouge lointain dans les mêmes cellules d'étiquette-retenue(figure 2a-i).

Les cellules de conservation de l'étiquette présentent des caractéristiques des cellules souches dans les sphéroïdes du jour 5. La double immunostaining montre que les cellules d'étiquette-retenue présentent des niveaux plus bas de protéine de cytokatin KRT14 ; diminution de la protéine de jonction cellulaire E-cadherin14; protéines à marqueur précoce de cellules souches wnt10B13,15,16 et ALDH1A1; a augmenté la protéine autophagie LC3, un indicateur de l'activité de flux d'autophagie17; et augmenté la myosine IIB (Figure 3a-f).

Un essai de rétention d'étiquette sphéroïde détecte également avec succès les cellules souches cancéreuses dans les échantillons de cancer de la prostate (figure 4). Cela permettra la découverte de véritables biomarqueurs pour les cellules cancéreuses semblables à des tiges et a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate.

Figure 1
Figure 1 : Maintien du HPrEC dans la culture 2D et formation sphéroïde dans la culture 3D. (a) Une culture primaire 2D de HPrEC a été BrdU-étiqueté et transféré à la culture 3D avec la formation de prostasphere le jour 5 (b). Barres d'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Identification des cellules de rétention d'étiquetteà longue durée dans les prostasphères primaires. Double étiquetage de BrdU (rouge) et CFSE (vert); CFSE (vert) et Far Red (rouge); BrdU (vert) et Far Red (rouge) ont identifié les mêmes cellules souches avec la rétention de l'ADN parental. Toutes les étiquettes BrdU, CFSE ou Far Red dans les cellules progénitrices qui divisent rapidement (DAPI, bleu) ont été diluées et perdues (a-i). Les images représentatives montrent BrdU/CFSE (a-c) (panneau supérieur), CFSE/Far Red (d-f) (panneau moyen) et BrdU/Far Red (g-i) (panneau inférieur) co-étiquetage dans les cellules de prostasphère unique (PS). Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Cellules PS qui conservent l'étiquette et qui présentent des propriétés de cellules souches. Par rapport aux cellules progénitrices non-label-retenues, les cellules souches BrdU ou CFSE qui conservent l'étiquette présentent (a) des niveaux inférieurs de cytokératine 14 (KRT 14),( b) diminution des niveaux d'E-cadhérine, (c) niveaux élevés de Wnt10B, (d) niveaux plus élevés d'ALDH1A1, (e) augmentation de LC3, et (f) a augmenté myosin IIBs. Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Utilisation de l'exemple de conservation de l'étiquette à base de sphère pour l'identification des cellules souches cancéreuses. Les cellules souches de cancer de CFSE-retenue de cancer dans les sphéroïdes dérivés des spécimens humains de cancer de la prostate ont montré la protéine e-cadhérine réduite relative aux cellules progénitrices non étiquetées. Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La cytométrie de flux utilisant plusieurs marqueurs de surface de cellules souches est une approche couramment utilisée pour la recherche sur les cellules souches, bien qu'elle manque à la fois de spécificité et de sélectivité1,5,6. Tandis que la formation de sphéroïdes dans un système de culture 3D est une autre méthode utile en enrichissant la population rare de cellules souches des cellules épithéliales primaires, y compris HPrEC, les sphéroïdes résultants sont toujours un mélange hétérogène des cellules de tige et d'ancêtre2,3,4. Dans les prostasphères, par rapport aux cellules progénitrices qui prolifèrent rapidement, le caractère relativement quiescent des cellules souches leur permet d'être identifiés par des indices à long terme.

Les méthodes résumées dans cet article décrivent l'étiquetage de HPrEC en utilisant BrdU, CFSE, et/ou Far Red pro-colories13. Tandis que BrdU, CFSE, et/ou Far Red pro-colorants dans les cellules proliférant rapidement sont tous rapidement dilués par chaque division de cellules, il y a un mécanisme additionnel qui explique la perte de BrdU connu sous le nom de ségrégation immortelle d'ADN de brin11. C'est alors que la cellule souche subit une division asymétrique, donnant lieu à une cellule souche fille et une cellule progénitrice. La cellule souche de fille conserve tout l'ADN parental ancien avec l'étiquette BrdU, tandis que la cellule d'ancêtre de fille reçoit l'ADN nouvellement synthétisé sans l'étiquette brdU. Par conséquent, un test de rétention d'étiquette s'appliquant à BrdU permet d'identifier plus clairement et plus facilement les cellules souches qui conservent l'étiquette par coloration immunofluorescente. Ceci est particulièrement utile pour confirmer les biomarqueurs de cellules souches par LA double coloration FI à l'aide de deux anticorps différents. Une limitation majeure de l'étiquetage BrdU est que les cellules doivent être fixées pour la coloration IF, empêchant ainsi d'autres études fonctionnelles après l'étiquetage BrdU et la fixation cellulaire.

Pour résoudre ce problème, deux colorants pro fluorescents pour l'étiquetage HPrEC vivant ont été testés dans des essais de conservation des étiquettes. Les résultats ont indiqué qu'il y avait un chevauchement complet des cellules de sphère étiquetées BrdU, CFSE et Far Red. L'étiquette BrdU pourrait être remplacée par CFSE ou Far Red dans des essais de conservation d'étiquettes basés sur la sphère pour permettre la visualisation des cellules vivantes pour l'imagerie et la séparation par FACS, favorisant la caractérisation fonctionnelle des cellules souches vivantes isolées utilisant à la fois des tests de culture cellulaire in vitro et des essais in vivo de xénogreffe13. Les cellules de tige et d'ancêtre vivantes et les cellules de l'étiquette CFSE ou Far Red triaient les cellules vivantes et les cellules progénitrices, y compris l'ARN-seq à cellule unique, qui est très puissant pour identifier de nouveaux marqueurs génétiques à cellules souches et des voies de signalisation, ainsi que pour la hiérarchie épithéliale de lignée cellulaire.

La nouvelle méthode sans biomarqueurs de caractérisation fonctionnelle des cellules souches par un essai de rétention d'étiquette sphéroïde présenté ici permet d'identifier les cellules cancéreuses semblables à des tiges à partir de spécimens de patients primaires et de lignées de cellules cancéreuses. Ainsi, il offre une avenue pour découvrir de nouveaux biomarqueurs de cellules souches cancéreuses et développer des thérapies efficaces ciblant le cancer13.

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Disclosures

Les auteurs n'ont pas de relations financières à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par des subventions du National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Nous remercions le Flow Cytometry Core de l'Université de l'Illinois à Chicago pour son aide sur le tri cellulaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
1 mL tuberculin syringes Bectin Dickinson BD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishes Corning/Falcon 353003
12-well culture plate Corning/Falcon 353043
15 mL centrifuge tubes Corning/Falcon 352097
22 x 22 mm coverslips, sq Corning 284522 For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslips Corning 2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needle Monoject 1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottom MatTek Corp P35G-0-10-C Glass bottom No. 0, uncoated, irradiated
40 µm pore nylon cell strainer Corning 352340
5% CO2 culture incubator, 37 °C Forma
50 mL centrifuge tubes Corning/Falcon 352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap Corning 352235 35 µm nylon mesh
6-well culture plates Corning 353046
8-well chamber slides Millipore Sigma PEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPI Vector Laboratories H-1200 A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) Sigma-Aldrich B5002 1 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Centrifuge for 15 mL tubes Beckman Coulter Allegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) Thermo Fisher Scientific C34554 5 mM stock solution in DMSO
cytochalasin D Thermo Fisher Scientific PHZ1063
Dispase 1U/mL StemCell Technologies 07923
FACS CellSorter MoFlo XDP Beckman Coulter s
Far-Red pro-dye Thermo Fisher C34564 5 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895 For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital camera Carl Zeiss Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) Lifeline Cell Technology FC-0038 Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red free Corning 356239
Methanol Corning A452-4
Mouse anti-BrdU antibody Cell Signaling 5292S
Mouse IgG antibody (negative control) Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) Lifeline Cell Technology LL-0041
Propidium Iodide (PI) R & D Systems 5135/10 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope

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References

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Hu, W. Y., Hu, D. P., Xie, L., Birch, L. A., Prins, G. S. Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures. J. Vis. Exp. (154), e60357, doi:10.3791/60357 (2019).

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