Summary
Ved hjælp af humane primære prostata epiteliale celler, rapporterer vi en roman biomarkør-fri metode til funktionel karakterisering af Stem-lignende celler ved en spheroid-baseret etiket-retention assay. En trin-for-trin-protokol er beskrevet for BrdU, CFSE eller langt rødt 2D-celle mærkning; tredimensionel sfærisk dannelse; etiket-fastholde Stem-lignende celle identifikation ved immunocytochemistry; og isolation af FACS.
Abstract
Trods fremskridt inden for forskning i voksne stamceller er identifikation og isolering af stamcellerne fra vævsprøver fortsat en stor udfordring. Mens residente stamceller er relativt latent med niche begrænsninger i voksent væv, kommer de ind i cellecyklussen i anker-fri tredimensionel (3D) kultur og gennemgår både symmetrisk og asymmetrisk celledeling, hvilket giver anledning til både Stam-og progenitorceller Celler. Sidstnævnte prolifererer hurtigt og er den største cellepopulation på forskellige stadier af Lineage engagement, danner heterogene sfæroider. Ved hjælp af primære normale humane prostata epiteliale celler (HPrEC), en spheroid-baseret, etiket-retention assay blev udviklet, der tillader identifikation og funktionel isolering af spheroid-initierende stamceller ved en enkelt celle opløsning.
HPrEC eller cellelinjer er to-dimensionelt (2D) kultiveret med BrdU i 10 dage for at tillade dets inkorporering i DNA af alle skille celler, herunder selvfornyende stamceller. Skyl ud begynder ved overførsel til 3D-kulturen i 5 dage, hvor stamceller selv fornyer gennem asymmetrisk division og initierer sfærisk dannelse. Mens relativt latent datter stamceller bevarer brdu-mærket forældrenes DNA, er datter forfædre hurtigt prolifererende, mister brdu etiketten. BrdU kan erstattes med CFSE eller langt røde Pro-farvestoffer, som tillader levende stamcelle isolation af FACS. Stamcelle egenskaberne bekræftes ved in vitro-sfærisk dannelse, in vivo-vævs regenererings analyser og ved at dokumentere deres symmetriske/asymmetriske celle opdelinger. De isolerede etiket-holde stamceller kan blive nøje afhørt af downstream-molekylære og biologiske undersøgelser, herunder RNA-SEQ, ChIP-SEQ, enkelt celle opsamling, metabolisk aktivitet, proteom profilering, immunocytokemi, organoid dannelse og in vivo vævsregenerering. Det er vigtigt, at denne markør frie funktionelle stamcelle isolations tilgang identificerer Stam lignende celler fra friske kræft prøver og kræft cellelinjer fra flere organer, hvilket tyder på bred anvendelighed. Det kan bruges til at identificere kræft stamme-lignende celle biomarkører, skærm lægemidler rettet mod kræft Stem-lignende celler, og opdage nye terapeutiske mål i kræft.
Introduction
Den menneskelige prostata indeholder luminale epitel med sekretoriske funktion og basal celler underliggende det sammen med en usædvanlig neuroendokrine celle komponent. Epitelcellerne, i dette tilfælde, er genereret fra en sjælden population af prostata stamceller, der er relativt latent in vivo og fungere som et reparationssystem til at opretholde glandulær homøostase hele livet1. Trods mange fremskridt er identifikationen og den funktionelle isolation af prostata stamceller fortsat en stor udfordring i marken. Stamcelle-biomarkører, herunder celleoverflade markerings baserede metoder kombineret med flowcytometri, anvendes almindeligvis til stamcelleforskning2,3,4. Men, resultater for tilsætning og isolation varierer meget som en funktion af markør kombinationer og antistof specificitet5,6, at rejse spørgsmål om identiteten af de isolerede celler. En anden meget udbredt tilgang til Stem-lignende celle berigelse er tredimensionel (3D) sfærisk kultur2,3,4. Mens residente stamceller er relativt latent in vivo med niche begrænsninger, gennemgår de celle opdeling i 3D Matrix kultur (både symmetrisk og asymmetrisk), genererer både stamceller og progenitorcellerne, der hurtigt gengiver mod Lineage engagement7,8. De dannede sfæroider er en heterogen blanding, der indeholder både stamceller og progenitorceller på forskellige stadier af lineært engagement, herunder tidlige og sene progenitorceller. Således er assays ved hjælp af hele sfæroider ikke stamcelle eksklusiv, hvilket gør identifikationen af unikke stamcelle egenskaber inkonklusive. Derfor er det afgørende at skabe assays at identificere og adskille prostata stamceller fra deres datter forfædre. Med henblik herpå er målet med den nuværende protokol at etablere et analyse system, der giver mulighed for effektiv identifikation og isolering af stamceller fra humant prostata væv efterfulgt af en robust downstream-analyse af deres biologiske funktioner.
Langsigtet 5-Bromo-2'-deoxyuridin (brdu) etiket-retention er meget udbredt til in vivo og in vitro-Lineage sporing af stamceller baseret på deres langvarige fordoblings tiden9,10. Den nuværende fremgangsmåde for identifikation og isolering af prostata stamceller er baseret på deres relative, karakteristiske og mærkelige egenskaber i en blandet epitelial population. Desuden er det kun stamceller, som er baseret på den udødelige streng DNA-hypotese, som kan gennemgå asymmetrisk celledeling. Stam cellen repræsenterer den datter celle, der indeholder det ældre forældre-DNA, mens progenitorcellen, som er en engageret datter celle, modtager det nyligt syntetiserede DNA. Den unikke stamcelle egenskab, der er beskrevet ovenfor, udnyttes til at udføre brdu-mærkning i forældre stamceller i primære kulturer og derefter spore deres etiket efter brdu-washout ved overførsel til 3D Anchor-fri sfæroide-kultur. Mens størstedelen af primære prostata epiteliale celler bevarer en basal og transit forstærker fænotype i 2D-kultur, er der også en sjælden population af Multipotente stamceller, som genopfylder og vedligeholder epitelial homøostase som det fremgår af dannelsen af sfæroider eller fuldt differentierede organoider med tilsvarende dyrkningsmedier ved overførsel til 3D-systemer3,12. I vores nuværende protokol, ved hjælp af HPrEC prostata sfæroider eller prostasphere-baserede BrdU, CFSE, eller langt røde retention assays efterfulgt af fluorescens aktiverede celle sortering (FACS), identificerer vi etiket-fastholdelse stamceller i sfæroider på et enkelt celleniveau13.
Det er vigtigt, at vi yderligere bekræftede stamcelle egenskaberne for etiket bevarende celler i tidlige stadier af sfæroider sammenlignet med progenitorcellerne med lineært engagement. Disse omfatter stamcelle asymmetrisk division, in vitro sfærisk dannelse evne og in vivo vævsregenerering kapacitet, forhøjet autophagy aktivitet, Augmented ribosom Biogenese og nedsat metabolisk aktivitet. Efterfølgende blev der udført RNAseq-analyse. Differentielt udtrykte gener i etiket-fastholdelse sfæide celler blev observeret, der kan tjene som nye biomarkører for humane prostata stamceller. Denne spheroid-baserede etiket-fastholdelse tilgang kan gælde for kræft prøver til tilsvarende identificere et lille antal kræft stamceller, hvilket giver translationelle muligheder for at forvalte de terapeutiske resistente populationer13. Præsenteret nedenfor er prostasphere-baseret etiket-retention assay ved hjælp af humane primære prostata epiteliale celler (HPrEC) som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle celle håndterings-og medie præparater skal udføres med aseptisk teknik i et biologisk sikkerhedskabinet i klasse II.
1. kultur og vedligeholdelse af HPrEC-celler i 2D
- Coat 100 mm kultur retter med 2 ml 2,5 μg/cm2 fibronektin opløsning natten over ved stuetemperatur (RT). Aspirer opløsningen og lad kultur retterne lufttørre i BSC for 45 min. Fibronectin-belagte kultur retter kan opbevares 2 – 4 uger ved 4 °C.
- Tilsæt 9 mL prostata epitel cellevækst medium (f. eks. PrEGM) til en fibronectin-belagt 100 mm kulturfad og hold skålen varm i en CO2 -inkubator ved 37 °c.
- Tø et hætteglas med frosne HPrEC-celler (2 x 105/ml) i et 37 °c-vandbad og resuspension af cellerne i 10 ml varmt medium.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Cellerne opslæmmes grundigt i 1 mL af det varme dyrkningsmedium. Frøceller ved pipettering 1 mL af cellesuspensionen direkte ind i fibronectin-belagt 100 mm kultur skål indeholdende 9 mL af det forvarmede medium (total volumen af medium og celler er 10 mL). Placer kultur retterne tilbage i en CO2 -inkubator ved 37 °c.
- Genfyld mediet hver 2. For at gøre dette, forsigtigt aspirere alle medier og tilsæt 10 mL frisk varmt medium.
- I omkring 5 dage, sikre, at kulturerne er ~ 70-80% confluent. Udfør enzymatisk fordøjelse ved at inkube cellerne med 3 mL 0,05% trypsin/EDTA ved 37 °C i 5 min.
- Stop fordøjelsen ved at tilsætte 3 mL varm PBS indeholdende 10% FBS.
- Cellerne opsamles i et 50 mL centrifugeglas og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Resuspender celle pellet i 30 mL varmt medium og dispenserer det ligeligt i tre nye fibronectin-belagte 100 mm kultur retter til næste passage.
Bemærk: primære hprec celler kan urerne ~ 3 – 5x uden at ændre deres basal epiteliale celleegenskaber. Epitelial fænotype er testet ved udtryk af basal epiteliale celle markører cytokeratin 5 og p63 med immunocytochemistry/Immunofluorescent (ICC/IF) assays.
2. mærkning HPrEC med BrdU, CFSE, eller langt røde Pro-farvestoffer
Bemærk: cellerne kan fortsætte enten til trin 2,1 eller trin 2,2 efterfulgt af overførslen til 3D prostasphere-kulturen som beskrevet i trin 3,1.
-
Enkelt mærkning af celler med BrdU
- Kultur 2 x 105 hprec celler i fibronectin-belagt 100 mm kultur retter med 10 ml varmt medium indeholdende 1 ΜM brdu. Kultur cellerne i 10 dage (over to passager) for at sikre mærkning af alle celler, herunder prostata stamme og stamceller.
- Efter 10 dage, forsigtigt aspirere PrEGM medium, der indeholder BrdU og vaske cellerne med 5 mL varm PBS. Gentag 1x.
- Udfør enzymatisk fordøjelse med 0,05% trypsin/EDTA som beskrevet i trin 1.7 – 1.8. Cellerne centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Resuspendér brdu-mærkede pelleteret celler (5 x 104) i 500 μl iskold (1:1) kælder membran matrix/medium og Overfør til en 3D prostasphere-kultur (beskrevet i trin 3,1) i 5 dage for at tillade brdu udskylning under sfæroide-dannelsen (~ 6-celle cyklusser).
-
Dobbelt mærkning af celler med BrdU og CFSE eller langt røde Pro-farvestoffer
- Hvis Co-mærkning for levende celler ønskes, tage præ-mærkede celler inkuberet med BrdU i 10 dage fra trin 2,1 og co-label med 5 μM CFSE eller langt rødt levende celle fluorescerende Pro-farvestoffer i 30 min. Udfør Co-mærkning på dag 10.
- Aspirer forsigtigt mediet indeholdende BrdU og CFSE eller langt røde Pro-farvestoffer. Cellerne vaskes med 5 mL varm PBS. Gentag vask 1x.
- Udfør enzymatisk fordøjelse med 0,05% trypsin/EDTA som beskrevet i trin 1.7 – 1.8. Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Fjern og kassér supernatanten.
- Resuspendere de Co-mærkede celler (5 x 104) i 500 μl iskold (1:1) kælder membran matrix/medium og overførsel til en 3D prostasphere kultur (beskrevet i afsnit 3,1) i 5 dage for at tillade brdu og cfse eller langt rødt udvaskes under sfæoidedannelsen (~ 6 celle cyklusser).
- Udfør påvisning af etiket bevarende celler i sfærer (dag 5 prostaspheres) som beskrevet i trin 4,1, 4,2, 4,3 eller 5.
Bemærk: Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) og langt rødt er langvarige fluorescerende Pro-farvestoffer og er godt bevaret inden for de mærkede celler. Intracellulære esterase i levende celler kløver acetatgrupper, der aktiverer de grønne eller røde fluorescerende molekyler, der nu membran imperment.
3. prostasphere dannelse i 3D kælder membran kultur system
-
Prostasphere kultur i 3D kælder membran matrix system
- Tø kælderen membran matrix ved 4 °C natten over og holde på is før brug.
- Tilsæt forsigtigt 1 mL iskold kælder membran matrix i et tilsvarende volumen af iskold kulturmediet. Bland langsomt ved pipettering op og ned, undgå bobler.
Bemærk: pre-coat bunden af 12 brønd kultur plade brønde med 100 μL af denne opløsning. Dette vil minimere antallet af celler, der falder gennem matrixen og vokse som en monolayer. - Resuspension 5 x 104 hprec celler i iskold (1:1) kælder membran matrix/Culture medium mix i et samlet volumen på 500 μl.
- Pipetten 500 μL af denne celle opløsning omkring den nederste kant af hver brønd.
- Drej pladen for at fordele blandingen jævnt omkring brøndens rand. Pladen placeres i en CO2 -inkubator ved 37 °c i 30 minutter, så matrixen kan størkne.
- Når matrixen er solidificeret, dækkes med 1 mL varmt dyrkningsmedium pr. brønd. Forstyr ikke kælderen membran matrix ring. Mål forsigtigt pipettespidsen og dispensere kulturmediet til midten af brønden.
Bemærk: dyrkningsmediet skal opvarmes til 37 °C, når det tilsættes til den solidificerede kælder membran matrix. Kælderen membran matrix vil miste sin integritet og opløses, når de udsættes for kolde/kølige medier. - Genopfylde medium hver 2 dage. Aspirer forsigtigt ~ 500 μL af brugt medium og tilsæt 500 μL frisk varm kulturmedium.
- Overvåg prostasphere dannelse og vækst i 5 – 7 dage ved hjælp af et inverteret mikroskop.
-
Passaging af prostaspheres
- Høst prostaspheres fra matrixen ved forsigtigt at aspirere så meget medier som muligt. Undgå at forstyrre eller opsamle flydende stykker af den solidificerede matrix.
- Der tilsættes 1 mL dispase opløsning (kælder membran matrix: dispase ved et 1:2-forhold). Bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange.
- Der Inkubér kultur pladerne i en CO2 -inkubator ved 37 °c i 30 minutter.
- Tag billeder af prostaspheres, der er i bunden af kulturen skålen for Sphere nummer optælling og størrelse målinger.
- Kugle blandingen opsamles i et 15 mL rør. Centrifuger suspensionen ved 500 x g i 5 minutter ved rt for at pille sfærerne. Aspirér og kassér supernatanten.
- Sprede sfærerne i enkeltceller ved at fordøje med 500 μL varm 0,05% trypsin/EDTA og overføre suspensionen til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Mikrocentrifuge røret inkubates i en CO2 -inkubator ved 37 °c i 5 minutter.
- Stop trypsin-handlingen med 500 μL varm PBS indeholdende 10% FBS. Den Ford øjede sfære opslæmning gennem en 1 mL sprøjte med en 26 G nål 5x for at adskille sfærerne i enkeltceller.
- Centrifuger suspensionen ved 500 x g i 5 min. for at pille CELLERNE ved rt. Aspirér supernatanten og kassér.
- Resuspension celle pellet i 1 mL varm kulturmedium og filtrere gennem en 40 μm porestørrelse nylon celle Strainer.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 minutter for at pille CELLERNE ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Resuspension celle pellet i 1 mL iskold (1:1) kælder membran matrix/kulturmedium og subkultur i en 3D kælder membran matrix for den anden passage af prostasphere.
4. identifikation af brdu-fastholdelse prostata stamceller ved immunfluorescent farvning
- Udvækst de vedlagte prostaspheres efterfulgt af immunfluorescent (hvis) farvning for prostata stamcelle 2D Imaging.
- Høst prostaspheres ved dispase fordøjelse som beskrevet i trin 3.2.1 – 3.2.3. Sfærerne centrifugeres i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas ved 500 x g i 5 min. kassér supernatanten.
- Gensuspendere kugler i 1 mL varmt dyrkningsmedium.
- Incubate ~ 50 prostaspheres per brønd i 8 brøndkammer glider i 200 μL af kulturmedium i en 37 °C inkubator natten for at give mulighed for fastgørelse og udvækst af kugler.
- På dag 2, Aspirér og kassér dyrkningsmediet. Vask de dyrkede sfærer med 200 μL PBS i 5 min.
- Fastgør sfærerne i 200 μL/brønd af iskold methanol ved-20 °C i 20 minutter.
- Vask sfærerne med 200 μL/brønd PBS i 5 min. Gentag 2x.
- Sure vaske kugler med 200 μL/brønd af 2N HCl i 30 min ved RT.
- Vask sfærerne med 200 μL/brønd PBS i 5 min. Gentag 3x.
- Tilsæt 100 μL blokerende opløsning, der indeholder 5% normalt gede serum i PBST (PBS med 0,25% Triton X-100), og Inkuber i 30 min ved RT.
- Aspirér spærre opløsningen og tilsæt 100 μL PBST indeholdende 2% normalt gede serum og primær muse anti-humant BrdU antistof (1:200) til hver brønd og Inkuber i en befuret æske ved 4 °C natten over.
Bemærk: mus IgG antistof bruges som en negativ kontrol. - Aspirer og fjern den primære antistof opløsning. Vask sfærerne med 200 μL PBS i 5 min. Gentag 2x.
- Tilsæt 100 μL PBST indeholdende 2% normalt gede serum og sekundær ged anti-Mouse Alexa fluor 488 antistof (1:500) til hver brønd og Inkuber ved RT i mørket i 2 timer.
- Indsug og fjern den sekundære antistof opløsning. Sfærerne vaskes med 200 μL PBS i 5 min. Gentag 3x.
- Monter diasene med ~ 25-40 μL vandigt monterings medium, der indeholder DAPI.
- Få billeder af de farvede kugler/celler med et fluorescerende mikroskop og et farve digitalt kamera.
- Hele mount, hvis farvning af prostaspheres for prostata stamcelle 3D imaging
Bemærk: for hele beslaget, hvis farvning, håndteres prostakugler med 1,5 mL mikrocentrifuge glas.- Høst prostasfærerne ved at dispase fordøjelsen som beskrevet i trin 3.2.1 – 3.2.3. Sfærerne centrifugeres i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og kassér den.
- Resuspender og fastgør sfærerne med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD ved RT i 20 min. centrifuger sfærerne ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og kassér den.
- Sfærerne vaskes ved at opafbryde pellet i 1 mL PBS. Centrifuger sfærerne ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og kassér den. Gentag 1x.
- Syre vask sfærerne ved at resuspendere pellet i 1 mL 2N HCl i 30 min.
- Sfærerne vaskes med 1 mL PBS i 5 min og centrifugeres ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og kassér den. Gentag 3x.
- Resuspension ~ 15 – 30 kugler i 100 μL blokerende opløsning indeholdende 5% normalt gede serum i PBST (PBS med 0,25% Triton X-100) og inkubere i 30 min ved RT.
- For at fjerne blokerings opløsningen centrifugeres sfærerne ved 500 x g i 5 min. Aspirér og kassér supernatanten.
- Resuspension af sfærerne i 100 μL PBST indeholdende 2% normalt gede serum og primær mus anti-humant BrdU antistof (1:200) og Inkuber ved 4 °C natten over.
- Sfærerne vaskes ved at opafbryde pellet i 1 mL PBS. Centrifuger sfærerne ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og kassér den. Gentag 1x.
- Resuspension af kugler i 100 μL PBST indeholdende 2% normalt gede serum og sekundær ged anti-mus Alexa fluor 488 antistof (1:1000) og inkubere ved RT for 2 h.
- Sfærerne vaskes ved at opafbryde pellet i 1 mL PBS. Centrifuger sfærerne ved 500 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og kassér den. Gentag 1x.
- Resuspension af kugler i 30 – 50 μL vandigt monterings medium indeholdende DAPI. For at forhindre fladning af sfærerne, skal du dispensere dem til et godt lavet fra en 35 mm ubelagt kulturfad med en dækglas bund. Derefter tilsættes en dækglas til kulturen skålen, der dækker brønden.
- Erhverve hele Sphere Z-stack billeder ved hjælp af en overført lys inverteret fluorescerende confokale mikroskop. Konverter disse Z-stack billeder til 3D-billeder ved hjælp af en billedbehandling software med kombinationstegning tegning kapaciteter.
Bemærk: mus IgG antistof bruges som en negativ kontrol.
- Analyse af parret celler (4 dages protokol)
- Kultur de BrdU-mærkede kugler til dag 5.
- Dag 1: høst sfærerne fra en kælder membran matrix med 1 mL dispase fordøjelse. Dispergeres i enkeltceller med 500 μL varm 0,05% trypsin/EDTA i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas som beskrevet i trin 3.2.1-3.2.11.
- Cellerne opslæmmes i 1 mL varmt dyrkningsmedium.
- Plade de spredte enkeltceller (~ 300 – 500 pr. brønd) i 8 brøndkammer slides og kultur i 200 μL/brønd kulturmedium natten for at give mulighed for fastgørelse.
- Dag 2: Skift kulturmedium med 200 μL 2 μM cytochalasin D i dyrkningsmediet, og Inkuber natten over ved 37 °C for at tillade en celle division, der standser ved senmetaphase til anaphase.
- Dag 3 – 4: Aspirér og kassér mediet. Fix celler i 200 μL/brønd af iskold methanol ved-20 °C i 20 min. Følg immunofarvnings protokollen for BrdU som beskrevet i trin 4.1.5-4.1.14.
- Tag billeder af parrede celler med et fluorescens mikroskop. Sørg for, at afstanden mellem de to kerner er mindre end 30 μm. baseret på BrdU-retention, identificere de parrede stamceller som undergår symmetrisk eller asymmetriske celle division.
Bemærk: BrdU label-fastholdelse af prostata stamceller gennemgår en symmetrisk opdeling for at give anledning til to datter stamceller, der bevarer en tilsvarende mængde af BrdU, hvorimod stamceller, som gennemgår asymmetrisk spaltning, giver anledning til en stamcelle i en datter, som bevarer alle BrdU og anden datter progenitorcelle, som har mistet BrdU etiketten.
5. isolering af CFSE-mærket-fastholdelse af prostata stamceller ved FACS sortering
- Dag 5: høst CFSE-mærkede dag 5 prostaspheres vokser i 6 godt kultur plader i 3D-kultur ved at udskifte mediet med 2 mL dispase (kælder membran matrix: dispase ved en 1:2 ratio). Pipetten op og ned flere gange for at blande grundigt.
- Pladerne inkubates i en CO2 -inkubator ved 37 °c i 30 minutter for at fordøje matrixen.
- Kugle blandingen opsamles i et 15 mL centrifugeglas. Centrifuger sfærerne ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér supernatanten og kassér.
- Resuspension af kugle pellet i 500 μL varm 0,05% trypsin/EDTA, og Overfør til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Kuglerne inkubates i en CO2 -inkubator ved 37 °c i 5 min. Tilsæt 500 ΜL varm PBS indeholdende 10% FBS.
- Passere sfærerne gennem en 1 mL sprøjte med en 26 G nål 5x at fuldstændig dissociere kugler i enkeltceller.
- Cellerne centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Cellerne opslæmmes i 1 mL varm dyrkningsmedium, der indeholder 1 μg/mL propidium Iodid (PI) til farvning af døde celler. Inkuber i 1 min ved RT.
- Cellerne centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Cellerne opslæmmes i 1 mL varmt dyrkningsmedium. Cellerne centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved rt. Aspirér og kassér supernatanten.
- Resuspension cellerne i 500 μl varm kulturmedium og indsamle cellerne i 5 ml polystyren runde bund rør ved at filtrere dem gennem 35 μm porestørrelse celle si snap caps.
- Udfør analysen af trypsin-dispergerede CFSE-mærkede prostasphere-celler med en enkelt kanals FACS-analysator.
- Gate subpopulationer af fraktioneret CFSEHi, Cfsemed, og cfseLo celler. Brug de negative og positive kontroller for gating.
Bemærk: tilstedeværelsen af FACS sorteret CFSE label-fastholdelse prostata stamceller (Se Hu et al.13) kan bekræftes ved grøn Fluorescens mikroskopi og deres større Cellestørrelse sammenlignet med ikke-fastholde celler. Denne større Cellestørrelse er en egenskab af prostata stamceller i forhold til progenitorcelle populationer. Dette kan være anderledes med andre vævstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære normale humane prostata epiteliale celler er placeret i fibronectin-coated kultur retter og cellevækst vedligeholdes i 2D kultur (figur 1a). Ved overførsel til 3D-kultur med en kælder membran matrix, er differentierede epiteliale celler langsomt uddø. Kun prostata stamceller kan overleve i en anker-fri kultur og danne sfæroider i 5 dage (figur 1b).
Dobbelt mærkning af prostata epiteliale celler i 2D-kultur efterfulgt af sfæroide dannelse i 3D-kultur indikerer samlokaliseringen af brdu, cfse og langt rødt i de samme label-fastholdelse celler (figur 2a-i).
Label-fastholdelse celler viser stamcelle karakteristika i dag 5 sfæroider. Dobbelt immun farvning viser, at label-fastholdelse celler udviser lavere niveauer af cytokeratin protein KRT14; nedsat celle samlings protein E-cadherin14; forhøjede stamcelle tidlige markør proteiner Wnt10B13,15,16 og ALDH1A1; øget autophagy protein LC3, en indikator for autophagy flux aktivitet17; og øget myosin IIB (figur 3a-f).
En spheroid-baseret etiket-retention assay også med succes detekterer Cancer Stem-lignende celler i prostatacancer prøver (figur 4). Dette vil gøre det muligt for opdagelsen af ægte biomarkører for kræft stamme-lignende celler og har potentiale til at identificere nye terapeutiske mål for prostatakræft.
Figur 1: vedligeholdelse af HPrEC i 2D-kultur og sfæroidedannelse i 3D-kultur. (a) en primær 2D-kultur for HPrEC blev mærket og overført til 3D-kultur med prostasphere formation på dag 5 (b). Skala stænger = 400 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: identifikation af langvarige etiketceller i primær prostasfærer. Dobbelt mærkning af BrdU (rød) og CFSE (grøn); CFSE (grøn) og langt rødt (rødt); BrdU (grøn) og langt rødt (rødt) identificerede de samme stamceller med fastholdelse af forældrenes DNA. Enhver BrdU, CFSE eller langt røde etiketter i hurtigt dividere stamceller (DAPI, blå) blev fortyndet og tabt (a-i). Repræsentative billeder viser BrdU/CFSE (a-c) (øverste panel), Cfse/far Red (d-f) (midterste panel), og Brdu/far Red (g-i) (lavere panel) Co-mærkning i enkelt prostasphere (PS) celler. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: etiket-fastholdelse af PS-celler, som udviser stamcelle egenskaber. Sammenlignet med ikke-label-fastholdelse progenitorceller, BrdU eller CFSE label-fastholdelse stamceller udviser (a) lavere niveauer af cytokeratin 14 (krt 14), (b) nedsat niveau af E-cadherin, (c) forhøjede niveauer af Wnt10B, (d) højere niveauer af ALDH1A1, (E) øget LC3, og (f) øget myosin IIb proteiner. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: brug af Sphere-baseret label-fastholdelse assay til identifikation af kræft Stem-lignende celler. CFSE label-fastholdelse af kræft stamceller i sfæroider afledt af humane prostatacancer prøver udviste reduceret E-cadherin protein i forhold til de ikke-mærkede stamceller. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flow cytometri ved hjælp af flere stamcelle overflade markører er en almindeligt anvendt tilgang til stamcelleforskning trods manglende både specificitet og selektivitet1,5,6. Mens sfæroide dannelse i et 3D-kultur system er en anden nyttig metode til at berige den sjældne stamcelle population fra primære epitelceller, herunder hprec, er de resulterende sfæroider stadig en heterogen blanding af Stam-og progenitorceller2,3,4. I prostasfærer, sammenlignet med de hurtigt prolifererende stamceller, giver den relativt ringe karakter af Stem-cellerne dem mulighed for at blive identificeret ved langtidsopbevaring af etiketter.
Metoderne opsummeret i dette papir beskrive mærkning af HPrEC ved hjælp af BrdU, CFSE, og/eller langt røde Pro-farvestoffer13. Mens BrdU, CFSE, og/eller langt røde Pro-farvestoffer i hurtigt prolifererende celler er alle hurtigt fortyndet af hver celle division, der er en ekstra mekanisme, der tegner sig for tabet af BrdU kendt som udødelig strand DNA segregation11. Dette er, når Stam cellen gennemgår asymmetrisk division, hvilket giver anledning til en datter stamcelle og en progenitorcelle. Datter Stam cellen bevarer alle de gamle forældre-DNA med BrdU label, mens datter progenitorcellen modtager det nyligt syntetiserede DNA uden BrdU etiketten. Derfor giver en etiket-retention analyse ved hjælp af brdu mulighed for klarere og lettere identifikation af etiket-holde stamceller ved immunfluorescent farvning. Dette er især nyttigt at bekræfte stamcelle biomarkører ved, hvis dobbelt farvning ved hjælp af to forskellige antistoffer. En væsentlig begrænsning af BrdU mærkning er, at cellerne skal fastsættes for, hvis farvning, hvilket forhindrer yderligere funktionelle undersøgelser efter BrdU mærkning og celle fiksering.
For at løse dette problem, to fluorescerende Pro-farvestoffer til levende HPrEC mærkning blev testet i label-fastholdelse assays. Resultaterne indikerede, at der var en fuldstændig overlapning af BrdU, CFSE og langt rødt mærkede kugle celler. BrdU label kunne erstattes med CFSE eller langt rødt i Sphere-baserede label-fastholdelse assays at tillade visualisering af levende celler til billeddannelse og separation af FACS, fremme funktionel karakterisering af isolerede levende stamceller ved hjælp af både in vitro cellekultur assays og in vivo xenograft assays13. CFSE eller far Red label-baserede FACS sorteret levende stilk og stamceller kan også anvendes til RNA-SEQ inklusive enkelt celle-RNA, hvilket er meget kraftfuldt til at identificere nye stamcelle-genmarkører og signalerings veje samt epitelial celle Lineage hierarki.
Den roman biomarkør-fri metode til funktionel karakterisering af stamceller ved en spheroid-baseret etiket-retention assay præsenteret her kan identificere kræft stamme-lignende celler fra primære patientprøver og kræft cellelinjer. Således, det giver en vej til at opdage nye biomarkører af kræft Stem-lignende celler og udvikle effektive Therapeutics rettet mod kræft13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke finansielle relationer til at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi takker Flowcytometry Core ved University of Illinois i Chicago for assistance til celle sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
