Summary
Met behulp van humane primaire prostaat Epitheelcellen, rapporteren we een nieuwe biomarker-vrije methode van functionele karakterisering van stam-achtige cellen door een spheroid-gebaseerde label-retentie test. Een stap-voor-stap protocol wordt beschreven voor BrdU, CFSE of far Red 2D Cell labeling; driedimensionale spheroid-formatie; Label-behoud stam-achtige celidentificatie door immunocytochemie; en isolatie door FACS.
Abstract
Ondanks vooruitgang bij adulte stamcelonderzoek blijft het identificeren en isoleren van stamcellen uit weefsel specimens een grote uitdaging. Hoewel ingezeten stamcellen relatief met niche-beperkingen in volwassen weefsels zijn, komen ze in de celcyclus in een anker vrije driedimensionale (3D) cultuur en ondergaan zowel symmetrische als Asymmetrische celdeling, wat leidt tot zowel stam als voorlopercellen Cellen. De laatste vermenigvuldigen zich snel en zijn de belangrijkste celpopulatie in verschillende stadia van de afstamming verbintenis, vormen heterogene spheroids. Met behulp van primaire normale humane prostaat epitheelcellen (HPrEC) werd een op spheroid gebaseerde, label-retentie test ontwikkeld die de identificatie en functionele isolatie van de spheroid-initiërende stamcellen in één celresolutie mogelijk maakt.
HPrEC-of cellijnen zijn twee-dimensioneel (2D) gecultiveerde met BrdU gedurende 10 dagen om de opname ervan in het DNA van alle scheidings cellen mogelijk te maken, inclusief zelf-vernieuwende stamcellen. Wassen begint bij overdracht naar de 3D-cultuur gedurende 5 dagen, waarbij stamcellen zichzelf verlengen via asymmetrische verdeling en de vorming van spheroid initiëren. Terwijl de relatief trillerende dochter stamcellen BrdU-gelabeld ouder-DNA behouden, vermenigvuldigen de dochter voor ouders zich snel en verliezen ze het BrdU-label. BrdU kan worden vervangen door CFSE of far Red Pro-kleurstoffen, die live stamcel isolatie door FACS mogelijk maken. Stamcel karakteristieken worden bevestigd door in-vitro-spheroid-vorming, in vivo weefselregeneratie testen, en door het documenteren van hun Symmetrische/asymmetrische celsplitsingen. De geïsoleerde stamcel cellen kunnen grondig worden ondervraagd door stroomafwaarts moleculaire en biologische studies, waaronder RNA-seq, chip-seq, single cell Capture, metabole activiteit, Proteoom profilering, immunocytochemie, organoïd vorming en in vivo weefselregeneratie. Belangrijk is dat deze marker-vrije functionele stamcel isolatie benadering stam-achtige cellen van verse kanker specimens en kankercellijnen uit meerdere organen identificeert, wat een brede toepasbaarheid suggereert. Het kan worden gebruikt om kanker stam-achtige cel biomarkers identificeren, scherm farmaceutische producten gericht op kanker stam-achtige cellen, en ontdek nieuwe therapeutische doelen in kankers.
Introduction
De menselijke prostaat klier bevat luminaal epitheel met secretoire functie en basale cellen onderliggende het samen met een ongewone neuro-endocriene cel component. De epitheelcellen, in dit geval, worden gegenereerd uit een zeldzame populatie van prostaat stamcellen die relatief stilzitten in vivo en fungeren als een reparatie systeem om klierweefsel homeostase gedurende het hele leven1. Ondanks veel vooruitgang blijft de identificatie en functionele isolatie van prostaat stamcellen een grote uitdaging in het veld. Stamcel biomarkers, met inbegrip van celoppervlak marker-gebaseerde methodologieën gecombineerd met Flow cytometrie worden vaak gebruikt voor stamcelonderzoek2,3,4. De resultaten voor verrijking en isolatie lopen echter sterk uiteen als functie van markerings combinaties en antilichaam specificiteit5,6, waarbij vragen worden gesteld over de identiteit van de geïsoleerde cellen. Een andere veelgebruikte aanpak voor stem-achtige celverrijking is driedimensionale (3D) spheroid-cultuur2,3,4. Terwijl ingezeten stamcellen relatief stilzitten in vivo met niche-beperkingen, ondergaan ze celdeling in 3D-matrix cultuur (zowel symmetrisch als asymmetrisch), waardoor zowel stam-als voorlopercellen worden gegenereerd die zich snel voortplanten in de richting van de Lineage-verbintenis7,8. De gevormde sferoïden zijn een heterogene mengeling die zowel stamcellen als voorlopercellen bevat in verschillende stadia van de afstamming, waaronder vroege en late stadia van voorlopercellen. Dus, assays met behulp van de hele sferoïden zijn niet stamcel exclusief, waardoor de identificatie van unieke stamcel eigenschappen onduidelijk. Daarom is het van cruciaal belang om assays te maken om prostaat stamcellen van hun dochter voor ouders te identificeren en te scheiden. In dit voordeel is het doel van het huidige protocol het vaststellen van een assay-systeem dat de efficiënte identificatie en isolatie van stamcellen van menselijke prostaat weefsels mogelijk maakt, gevolgd door een robuuste downstream-analyse van hun biologische functies.
Lange termijn 5-broom-2'-deoxyuridine (Brdu) label-retentie wordt veel gebruikt voor in vivo en in vitro tracering van stamcellen op basis van hun verlengde verdubbelingstijd9,10. De huidige aanpak voor de identificatie en isolatie van prostaat stamcellen die hierin wordt beschreven, is gebaseerd op hun relatieve trillende karakteristiek en label retentie eigenschappen binnen een gemengde epitheel populatie. Bovendien kunnen alleen stamcellen, op basis van de onsterfelijke streng DNA-hypothese, Asymmetrische celdeling ondergaan. De stamcel vertegenwoordigt de dochtercel die het oudere DNA van ouders bevat terwijl de voorlopercellen, die een toegewijde dochtercel is, het nieuw gesynthetiseerde DNA ontvangt. De unieke eigenschap van de stamcel die hierboven wordt beschreven, wordt gebruikt om BrdU-labeling uit te voeren in ouderlijke stamcellen in primaire culturen en vervolgens hun label na BrdU-washout bij te houden na overdracht naar 3D-anker vrije spheroid-cultuur. Hoewel het merendeel van de primaire prostaat epitheelcellen een basale en doorvoer versterkend fenotype in 2D-cultuur behouden, is er ook een zeldzame populatie van multipotente stamcellen die de epitheliale homeostase aanvullen en onderhouden, zoals blijkt uit de vorming van sferoïden of volledig gedifferentieerde organogeniden met overeenkomstige kweekmedia bij overdracht naar 3D-systemen3,12. In ons huidige protocol, met behulp van hprec prostaat sferoïden of prostasphere gebaseerde Brdu, CFSE, of far Red retentie testen gevolgd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), identificeren we label-behoud stamcellen in sferoïden op één cel niveau13.
Belangrijk is dat we de kenmerken van de stamcel van de cellen voor het behoud van etiketten in vroege stadia van sferoïden verder hebben bevestigd in vergelijking met de voorlopercellen met Lineage engagement. Dit zijn onder andere stamcel asymmetrische divisie, in vitro spheroid vorming vermogen en in vivo weefselregeneratie capaciteit, verhoogde autophagy activiteit, verhoogd ribosoom biogenese en verminderde metabole activiteit. Vervolgens werd RNAseq-analyse uitgevoerd. Differentiaal uitgedrukte genen in labelhoudende spheroid-cellen werden waargenomen die kunnen dienen als nieuwe biomarkers voor menselijke prostaat stamcellen. Deze op spheroid gebaseerde benadering van etikettering kan worden toegepast op kanker specimens om een klein aantal kanker stamachtige cellen te identificeren, waardoor translationele mogelijkheden worden geboden om de therapeutische resistente populaties13te beheren. Hieronder vindt u de prostasphere-based label-retentie assay met menselijke primaire prostaat epitheelcellen (HPrEC) als voorbeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle celhantering en media preparaten moeten worden uitgevoerd met een aseptische techniek in een klasse II biologisch veiligheidskabinet (BSC).
1. cultuur en onderhoud van HPrEC-cellen in 2D
- Coat 100 mm cultuur gerechten met 2 mL 2,5 μg/cm2 fibronectin-oplossing 's nachts bij kamertemperatuur (RT). Aspireren de oplossing en laat de cultuur gerechten lucht drogen in de BSC voor 45 min. de cultuur gerechten met fibronectin-coating kunnen 2 – 4 weken bij 4 °C worden bewaard.
- Voeg 9 mL prostaat epitheel celgroei medium (bijv. PrEGM) toe aan een fibronectin-Coated 100 mm kweek schaal en houd het gerecht warm in een CO2 -incubator bij 37 °c.
- Ontdooi een injectieflacon met bevroren HPrEC-cellen (2 x 105/ml) in een waterbad van 37 °c en breng de cellen over in 10 ml warm medium.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Breng de cellen grondig in 1 mL van het warme kweekmedium. Zaadcellen door pipetteren 1 mL van de celsuspensie rechtstreeks in de fibronectin-Coated 100 mm kweek schotel met 9 mL van het voorverwarmde medium (totale volume van medium en cellen is 10 mL). Plaats cultuur gerechten terug in een CO2 -incubator bij 37 °c.
- Vul het medium elke 2 dagen. Om dit te doen, zuig alle media zorgvuldig op en voeg 10 mL vers warm medium toe.
- In ongeveer 5 dagen, zorg ervoor dat de culturen zijn ~ 70 – 80% Confluent. Voer de enzymatische spijsvertering uit door de cellen gedurende 5 minuten te bebroed met 3 mL 0,05% trypsine/EDTA bij 37 °C.
- Stop de spijsvertering door 3 mL warme PBS met 10% FBS toe te voegen.
- Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 50 mL en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Rebreng de celpellet in 30 mL warm medium en verdeel het in drie nieuwe fibronectin-gecoate 100 mm cultuur gerechten voor de volgende passage.
Opmerking: primaire HPrEC cellen kunnen worden doorgedogen ~ 3 – 5x zonder hun basale epitheliale celkenmerken te veranderen. Epitheliaal fenotype wordt getest door uitdrukkingen van basale epitheliale celmarkeringen cytokeratine 5 en p63 rooms met immunocytochemie/immunofluorescentie (ICC/IF) testen.
2. labelen van HPrEC met BrdU, CFSE, of far Red Pro-kleurstoffen
Opmerking: de cellen kunnen doorgaan naar stap 2,1 of stap 2,2, gevolgd door de overdracht naar 3D prostasphere Culture zoals beschreven in stap 3,1.
-
Enkelvoudige labeling van cellen met BrdU
- Cultuur 2 x 105 hprec cellen in fibronectin-Coated 100 mm kweek gerechten met 10 ml warm medium met 1 ΜM Brdu. Kweek de cellen gedurende 10 dagen (over twee passages) om te zorgen voor het labelen van alle cellen, inclusief prostaat stam en voorlopercellen.
- Na 10 dagen, voorzichtig aspireren de PrEGM medium met de BrdU en was de cellen met 5 mL warme PBS. 1x herhalen.
- Voer de enzymatische spijsvertering uit met 0,05% trypsine/EDTA zoals beschreven in de stappen 1.7 – 1.8. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de Brdu-gelabelde gepileerde cellen (5 x 104) in 500 μL ijskoude (1:1) kelder membraan matrix/medium en breng gedurende 5 dagen over in een 3D prostasphere Culture (beschreven in stap 3,1) om Brdu wegwassende werking toe te staan tijdens de vorming van spheroid (~ 6 celcycli).
-
Dubbele labeling van cellen met BrdU en CFSE of far Red Pro-kleurstoffen
- Als co-labeling voor levende cellen gewenst is, Neem vooraf gelabelde cellen met BrdU gedurende 10 dagen vanaf stap 2,1 en co-label met 5 μM CFSE of far Red Live Cell fluorescerende Pro-kleurstoffen gedurende 30 min. Voer de co-labeling uit op dag 10.
- Aspiraat het medium met Brdu en CFSE of far Red Pro-kleurstoffen zorgvuldig. Was de cellen met 5 mL warme PBS. Herhaal de Wash 1x.
- Voer enzymatische spijsvertering uit met 0,05% trypsine/EDTA zoals beschreven in stap 1.7 – 1.8. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Respendeer de co-gelabelde cellen (5 x 104) in 500 μL ijskoude (1:1) kelder membraan matrix/medium en breng gedurende 5 dagen over in een 3D-prostasphere-cultuur (beschreven in sectie 3,1) om Brdu en CFSE of ver rode wegwassende werking tijdens de vorming van spheroid mogelijk te maken (~ 6 celcycli).
- Voer de detectie van cellen voor het behoud van labels uit in bollen (dag 5 prostaspheres) zoals beschreven in de stappen 4,1, 4,2, 4,3 of 5.
Opmerking: Carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE) en Far Red zijn duurzame fluorescerende Pro-kleurstoffen en zijn goed bewaard binnen de gelabelde cellen. Intracellulaire esterase in levende cellen klieven de acetaatgroepen die de groene of rode fluorescerende moleculen activeren die nu membraan imperbedoeld zijn.
3. prostasphere vorming in het 3D-kelder membraan kweek systeem
-
Prostasphere Culture in het 3D Basement membraan matrix systeem
- De kelder membraan matrix bij 4 °C 's nachts ontdooien en voor gebruik op ijs blijven.
- Voeg zachtjes 1 mL ijskoude membraan matrix toe aan een gelijk volume van het ijskoude kweekmedium. Meng langzaam door Pipetteer op en neer, Vermijd bubbels.
Opmerking: pre-Coat de bodem van 12 well Culture Plate Wells met 100 μL van deze oplossing. Dit minimaliseert het aantal cellen dat door de matrix valt en groeit als een monolayer. - Respendeer 5 x 104 hprec cellen in ijskoude (1:1) kelder membraan matrix/kweekmedium mix in een totaal volume van 500 μL.
- Pipetteer 500 μL van deze celoplossing rond de onderste rand van elke put.
- Draai de plaat om het mengsel gelijkmatig over de rand van de put te verdelen. Plaats de plaat gedurende 30 minuten in een CO2 -incubator bij 37 °c, zodat de matrix kan stollen.
- Als de matrix eenmaal is verstevigd, bedek deze met 1 mL warm kweekmedium per put. De kelder membraan matrixring niet storen. Richt de pipetpunt zorgvuldig en verdeel het kweekmedium naar het midden van de put.
Opmerking: het kweekmedium moet worden opgewarmd tot 37 °C wanneer het wordt toegevoegd aan de gestankte kelder membraan matrix. De kelder membraan matrix zal zijn integriteit verliezen en oplossen wanneer blootgesteld aan koude/koele media. - Medium elke 2 dagen aanvullen. Voorzichtig aspireren ~ 500 μL van het gebruikte medium en voeg 500 μL vers warm kweekmedium.
- Bewaak de prostasphere vorming en groei gedurende 5 – 7 dagen met behulp van een omgekeerde Microscoop.
-
Het doorgangen van prostaspheres
- Oogst prostaspheres uit de matrix door het zorgvuldig afzuigen van zoveel mogelijk media. Vermijd het verstoren of oppakken van zwevende stukken van de gestijde matrix.
- Voeg 1 mL dispase oplossing toe (kelder membraan matrix: dispase bij een 1:2 ratio). Meng grondig door meerdere malen op en neer te pipetteren.
- Incuberen de kweek platen in een CO2 -incubator bij 37 °c gedurende 30 minuten.
- Neem beelden van prostaspheres die zich aan de onderkant van de cultuur schotel voor Sphere Number tellen en grootte metingen.
- Verzamel het bolmengsel in een buis van 15 mL. Centrifugeer de suspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT om de bollen te pellet. Aspireren en gooi het supernatant.
- Dispergeer de bollen in enkele cellen door te verlijmen met 500 μL warm 0,05% trypsine/EDTA en de suspensie over te brengen naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Incuberen de microcentrifuge buis in een CO2 -incubator bij 37 °c gedurende 5 minuten.
- Stop de trypsine-actie met 500 μL warme PBS die 10% FBS bevat. Passeer de verteerde bol-suspensie door een 1 mL spuit met een 26 G naald 5x om de bollen in afzonderlijke cellen te ontkoppelen.
- Centrifugeer de suspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten om de cellen op rt. aspireren de supernatant en gooi.
- Respendeer de celpellet in 1 mL warm kweekmedium en filtreer door een nylon celzeef van 40 μm poriegrootte.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten om de cellen op rt. aspireren en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de celpellet in 1 mL ijskoude (1:1) kelder membraan matrix/kweekmedium en subcultuur in een 3D-kelder membraan matrix voor de tweede passage van de prostasphere.
4. identificatie van BrdU-behoudend prostaat stamcellen door immunofluorescentie kleuring
- Ontgroeien de bijgevoegde prostaspheres gevolgd door immunofluorescentie (IF) kleuring voor prostaat stamcel 2D beeldvorming.
- Oogst prostaspheres door de vertering te ontvetten zoals beschreven in de stappen 3.2.1 – 3.2.3. Centrifugeer de bollen in een micro centrifugebuis van 1,5 mL bij 500 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg.
- Respendeer bollen in 1 mL warm kweekmedium.
- Incureer ~ 50 prostaspheres per well in 8 goed kamer glaasjes in 200 μL kweekmedium in een incubator van 37 °C 's nachts, om de hechting en uitgroei van bollen mogelijk te maken.
- Op dag 2, aspireren en gooi het cultuurmedium. Was de uitgroeide bollen met 200 μL PBS gedurende 5 min.
- Fixeer de bollen in 200 μL/goed van ijskoude methanol bij-20 °C gedurende 20 min.
- Was de bollen met 200 μL/goed van PBS gedurende 5 min. Herhaal 2x.
- Acid Wash bollen met 200 μL/goed van 2N HCl gedurende 30 min bij RT.
- Was de bollen met 200 μL/goed van PBS gedurende 5 min. Herhaal 3x.
- Voeg 100 μL blokkerende oplossing met 5% normaal geiten serum toe in PBST (PBS met 0,25% Triton X-100) en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT.
- Zuig de blokkerende oplossing op en voeg 100 μL PBST met 2% normaal geit serum en primaire muis anti-humaan BrdU antilichaam (1:200) toe aan elke put en inbroed in een bevoficeerde doos bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: muis IgG antilichaam wordt gebruikt als een negatieve controle. - Aspirate en verwijder de primaire antilichaam oplossing. Was de bollen met 200 μL PBS gedurende 5 min. Herhaal 2x.
- Voeg 100 μL PBST met 2% normaal geiten serum en secundaire geit anti-muis Alexa Fluor 488 antilichaam (1:500) toe aan elk goed en incuberen bij RT in het donker gedurende 2 uur.
- Aspirate en verwijder de secundaire antilichaam oplossing. Was de bollen met 200 μL PBS gedurende 5 min. Herhaal 3x.
- Monteer de glaasjes met ~ 25-40 μL waterig afdekmedium dat DAPI bevat.
- Verkrijg afbeeldingen van de bevlekte bollen/cellen met een fluorescerende Microscoop en een digitale kleur camera.
- Hele mount als kleuring van prostaspheres voor prostaat stamcel 3D-beeldvorming
Opmerking: voor de hele mount als kleuring, prostaspheres worden behandeld met behulp van 1,5 mL micro centrifugebuizen.- Oogst de prostaspheres door de vertering te ontvetten, zoals beschreven in de stappen 3.2.1 – 3.2.3. Centrifugeer de bollen in een micro centrifugebuis van 1,5 mL bij 500 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en gooi.
- Respendeer en fixeer de bollen met 1 mL 4% Paraformaldehyde bij RT gedurende 20 min. Centrifugeer de bollen bij 500 x g gedurende 5 min. zuig het supernatant op en gooi het weg.
- Was de bollen door de pellet opnieuw op te schorten in 1 mL PBS. Centrifugeer de bollen op 500 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en gooi. 1x herhalen.
- Zuur was de bollen door de pellet in 1 mL van 2N HCl gedurende 30 minuten te resuspenteren.
- Was de bollen met 1 mL PBS gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. aspireren van de supernatant en gooi. Herhaal 3x.
- Respendeert ~ 15 – 30 bollen in 100 μL blokkerende oplossing met 5% normaal geiten serum in PBST (PBS met 0,25% Triton X-100) en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT.
- Om de blokkerende oplossing te verwijderen, centrifugeer de bollen op 500 x g gedurende 5 min. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Rebreng de bollen in 100 μL PBST met 2% normaal geit serum en primaire muis anti-humaan BrdU antilichaam (1:200) en incuberen bij 4 °C 's nachts.
- Was de bollen door de pellet opnieuw op te schorten in 1 mL PBS. Centrifugeer de bollen op 500 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en gooi. 1x herhalen.
- Rebreng de bollen in 100 μL PBST met 2% normaal geiten serum en secundaire geit anti muis Alexa Fluor 488 antilichaam (1:1000) en inbroed bij RT voor 2 uur.
- Was de bollen door de pellet opnieuw op te schorten in 1 mL PBS. Centrifugeer de bollen op 500 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en gooi. 1x herhalen.
- Rebreng de bollen in 30 – 50 μL waterige montage medium met DAPI. Om te voorkomen dat de bollen worden afgevlakt, moet u ze in een goed gemaakt van een 35 mm ongecoate kweek schaal met een afdekglas bodem afleveren. Voeg vervolgens een dekslip toe aan het cultuur gerecht, dat de put bedekt.
- Verkrijg hele bol Z-stack beelden met behulp van een verzonden licht omgekeerde fluorescerende confocale Microscoop. Deze Z-stack-afbeeldingen converteren naar 3D-afbeeldingen met behulp van een imaging software met vrije vorm tekening mogelijkheden.
Opmerking: muis IgG antilichaam wordt gebruikt als een negatieve controle.
- Analyse van gekoppelde cellen (4-daags Protocol)
- Kweek de BrdU-gelabelde bollen tot dag 5.
- Dag 1: oogst de bollen van een kelder membraan matrix met 1 mL dispase spijsvertering. Dispergeer in enkele cellen met 500 μL warm 0,05% trypsine/EDTA in een micro centrifugebuis van 1,5 mL zoals beschreven in de stappen 3.2.1 – 3.2.11.
- Respendeer de cellen in 1 mL warm kweekmedium.
- Plaat de verspreide enkelvoudige cellen (~ 300 – 500 per put) in 8 goed kamer dia's en cultuur in 200 μL/goed cultuurmedium 's nachts om toe te staan voor bevestiging.
- Dag 2: Verander het kweekmedium met 200 μL cytochalasin 2 μM in het kweekmedium en incuberen 's nachts bij 37 °C om één celdeling toe te staan die bij late metafase aan anafhase pauzeert.
- Dag 3 – 4: aspireren en gooi het medium weg. Repareer cellen in 200 μL/goed van ijskoude methanol bij-20 °C gedurende 20 min. Volg het immunokleurings protocol voor BrdU zoals beschreven in de stappen 4.1.5 – 4.1.14.
- Neem beelden van gepaarde cellen met een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat de afstand tussen de twee kernen minder dan 30 μm is. op basis van BrdU-retentie, Identificeer de gekoppelde stamcellen als een symmetrische of Asymmetrische celdeling ondergaat.
Opmerking: het BrdU label-behoud van prostaat stamcellen ondergaat een symmetrische verdeling om twee dochter stamcellen die eenzelfde hoeveelheid BrdU behouden te geven, terwijl stamcellen die asymmetrische verdeling ondergaan aanleiding geven tot een dochter stamcel met behoud van alle BrdU en de andere dochter voorlopercellen die het BrdU-label heeft verloren.
5. isolatie van het CFSE-etiket-behoud van prostaat stamcellen door FACS sortering
- Dag 5: oogst de CFSE-gelabelde dag 5-prostaspheres die in 6 goed-cultuur platen in 3D-cultuur groeien door het medium te vervangen door 2 mL dispase (kelder membraan matrix: dispase bij een 1:2-verhouding). Pipetteer meerdere malen omhoog en omlaag om grondig te mengen.
- Incuberen de platen in een CO2 -incubator bij 37 °c gedurende 30 minuten om de matrix te verteren.
- Vang het bolmengsel op in een centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer de bollen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspireren de supernatant en gooi.
- Regeer de bol pellet in 500 μL warme 0,05% trypsine/EDTA en breng over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Incubeer de bollen in een CO2 -incubator bij 37 °c gedurende 5 min. Voeg 500 ΜL warme PBS met 10% FBS toe.
- Passeer de bollen door een 1 mL spuit met een 26 G naald 5x om de bollen volledig te ontkoppelen in enkele cellen.
- Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de cellen in 1 mL warme kweekmedium met 1 μg/mL propidium jodide (PI) om dode cellen te vlekken. Incuberen gedurende 1 minuut bij RT.
- Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de cellen in 1 mL warm kweekmedium. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. aspirate en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de cellen in 500 μL warm kweekmedium en verzamel de cellen in 5 mL polystyreen ronde onderkant buizen door ze te filteren door middel van 35 μm poriegrootte celzeef snap caps.
- Uitvoeren van de analyse van trypsine-verspreide CFSE-gelabelde prostasphere cellen met een Single-Channel FACS Analyzer.
- Poort de subpopulaties van gefractioneerde CFSEHi, CFSEmed, en CFSElo cellen. Gebruik de negatieve en positieve controles voor gating.
Opmerking: de aanwezigheid van FACS gesorteerd CFSE label-behoud prostaat stamcellen (Zie hu et al.13) kan worden bevestigd door groene fluorescentiemicroscopie en hun grotere celgrootte in vergelijking met niet-te behouden cellen. Deze grotere celgrootte is een eigenschap van prostaat stamcellen ten opzichte van progenitorcelpopulaties. Dit kan afwijken met andere weefsel typen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire normale menselijke prostaat epitheelcellen worden geplaatst in fibronectin-gecoate cultuur gerechten en celgroei wordt gehandhaafd in de 2D-cultuur (Figuur 1a). Bij overdracht in 3D-cultuur met een kelder membraan matrix, de gedifferentieerde epitheliale cellen langzaam sterven. Alleen prostaat stamcellen kunnen overleven in een anker vrije cultuur en vormen sferoïden in 5 dagen (Figuur 1b).
Dubbele labeling van prostaat epitheelcellen in 2D cultuur gevolgd door spheroid vorming in 3D-cultuur geeft de colokalisatie van BrdU, CFSE, en ver rood in dezelfde label-behoud cellen (Figuur 2a-i).
Label-behoud cellen vertonen stamcel karakteristieken in dag 5-spheroids. Dubbele immunokleuring toont aan dat label-behoudende cellen lagere niveaus van cytokeratine eiwit KRT14 vertonen; verlaagd celjunctie eiwit E-cadherin14; verhoogde stamcel vroege marker eiwitten Wnt10B13,15,16 en ALDH1A1; verhoogde autophagy Protein LC3, een indicator van autophagy flux activiteit17; en verhoogde myosine IIB (Figuur 3a-f).
Een spheroid-gebaseerde label-retentie test detecteert ook met succes kanker stamachtige cellen in prostaatkanker specimens (Figuur 4). Dit zal de ontdekking van echte biomarkers voor kanker stam-achtige cellen mogelijk maken en heeft het potentieel om nieuwe therapeutische doelen voor prostaatkanker te identificeren.
Figuur 1: onderhoud van HPrEC in 2D-cultuur en spheroid-vorming in 3D-cultuur. a) een2D-primaire cultuur van HPrEC was Brdu-gelabeld en overgebracht naar de 3D-cultuur met prostasphere Formation op dag 5 (b). Schaal staven = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: identificatie van op lange termijn te bewaren cellen in primaire prostaspheres. Dubbele labeling van BrdU (rood) en CFSE (groen); CFSE (groen) en ver rood (rood); BrdU (groen) en Far Red (rood) identificeerden dezelfde stam achtige cellen met behoud van het ouderlijke DNA. Elke BrdU, CFSE of far Red Labels in snel verdelen voorlopercellen (DAPI, blauw) werden verdund en verloren (a-i). Representatieve afbeeldingen tonen BrdU/CFSE (a-c) (bovenste paneel), CFSE/Far Red (d-f) (middelste paneel) en Brdu/Far Red (g-i) (onderste paneel) Co-labeling in enkelvoudige prostasphere (PS)-cellen. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: label-behoud PS cellen die de eigenschappen van stamcel vertonen. In vergelijking met niet-labelhoudende voorlopercellen, BrdU-of CFSE-label-behoudende stamcellen vertonen (a) lagere niveaus van cytokeratine 14 (KRT 14),(b) verlaagde niveaus van E-cadherin, (c) verhoogde niveaus van Wnt10B, (d) hogere niveaus van ALDH1A1, (E) toegenomen LC3, en (f) verhoogde myosine IIB-eiwitten. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: gebruik van de op de bol gebaseerde label-behoudende test voor de identificatie van kanker stamachtige cellen. CFSE-label-behoud van kanker stam-achtige cellen in sferoïden afgeleid van menselijke prostaatkanker specimens vertoonden verminderde E-cadherin eiwit ten opzichte van de niet-gelabelde voorlopercellen. Schaal staven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flow flowcytometrieonderzoeken met behulp van meerdere stamcel oppervlak markers is een veelgebruikte benadering voor stamcelonderzoek ondanks het ontbreken van zowel specificiteit en selectiviteit1,5,6. Terwijl spheroid-vorming in een 3D-cultuur systeem een andere nuttige methode is om de zeldzame stamcel populatie te verrijken van primaire Epitheelcellen, waaronder hprec, zijn de resulterende spheroïden nog steeds een heterogene mengeling van stam-en voorlopercellen2,3,4. In prostasferen, in vergelijking met de snel prolifererende voorlopercellen, laat het relatief trillende karakter van stamcellen hen toe om te worden geïdentificeerd door de lange-termijn label retentie test.
De methoden samengevat in dit artikel beschrijven de labeling van HPrEC met behulp van BrdU, CFSE, en/of far Red Pro-kleurstoffen13. Terwijl Brdu, CFSE en/of far Red Pro-kleurstoffen in snel prolifererende cellen allemaal snel worden verdund door elke celdeling, is er een aanvullend mechanisme dat het verlies van Brdu bekend als onsterfelijke strand DNA segregatie11. Dit is wanneer de stamcel asymmetrische verdeling ondergaat, wat aanleiding geeft tot een dochter stamcel en een voorlopercellen. De dochter stamcel behoudt al het oude Ouderlijke DNA met BrdU label, terwijl de dochter voorlopercellen het nieuw gesynthetiseerde DNA ontvangen zonder het BrdU-label. Daarom zorgt een etiket retentie test met BrdU voor een duidelijkere en gemakkelijkere identificatie van de etikettering van stamcellen door immunofluorescentie kleuring. Dit is vooral handig om stamcel biomarkers te bevestigen door dubbele kleuring met twee verschillende antilichamen. Een belangrijke beperking van BrdU-labeling is dat cellen moeten worden vastgesteld voor als kleuring, waardoor verdere functionele studies worden voorkomen na BrdU-labeling en celfixatie.
Om dit probleem op te lossen, werden twee fluorescerende Pro-kleurstoffen voor Live HPrEC-labeling getest in label-behoud assays. De resultaten gaven aan dat er een volledige overlap was tussen BrdU, CFSE en Far Red met het label Sphere Cells. Brdu-label kan worden vervangen door CFSE of far Red in Sphere-gebaseerde assays om visualisatie van levende cellen voorbeeld vorming en scheiding door FACS mogelijk te maken, waardoor functionele karakterisering van geïsoleerde levende stamcellen wordt bevorderd met behulp van zowel in vitro celcultuurtesten als in vivo xenotransplantaatmodellen is assays13. CFSE of far Red op etiketten gebaseerde FACS gesorteerde levende stam-en voorlopercellen kunnen ook worden gebruikt voor RNA-seq, waaronder single cell RNA-seq, wat zeer krachtig is bij het identificeren van nieuwe stamcel genmarkers en signalering trajecten, evenals epitheliale cellineage hiërarchie.
De nieuwe biomarker-vrije methode voor functionele karakterisering van stamcellen door een op spheroid gebaseerde label-retentie test die hier wordt gepresenteerd, kan kanker stamachtige cellen van primaire patiënt specimens en kankercellijnen identificeren. Zo biedt het een laan voor het ontdekken van nieuwe biomarkers van kanker stamachtige cellen en het ontwikkelen van effectieve therapeutische therapieën gericht op kanker13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële relaties om openbaar te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door subsidies van de National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). We danken de flow Cytometry core aan de Universiteit van Illinois in Chicago voor hulp bij het sorteren van cellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
