Summary
Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l'etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l'identificazione delle cellule staminali di conservazione dell'etichetta mediante immunocitochimica; e l'isolamento da parte della FACS.
Abstract
Nonostante i progressi nella ricerca sulle cellule staminali adulte, l'identificazione e l'isolamento delle cellule staminali dai campioni di tessuto rimane una sfida importante. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti con vincoli di nicchia nei tessuti adulti, entrano nel ciclo cellulare in coltura tridimensionale senza ancora (3D) e subiscono sia la divisione cellulare simmetrica che asimmetrica, dando origine sia al gambo che al progenitore Cellule. Questi ultimi proliferano rapidamente e sono la popolazione cellulare principale in varie fasi dell'impegno di lignaggio, formando sferoidi eterogenei. Utilizzando le normali cellule epiteliali della prostata umana primaria (HPrEC), è stato sviluppato un saggio basato su sferoide di ritenzione di etichette che consente l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali che lo sferoide operino a una risoluzione a singola cellula.
HPrEC o linee cellulari sono bidimensionali (2D) coltivate con BrdU per 10 giorni per consentire la sua incorporazione nel DNA di tutte le cellule che si dividono, comprese le cellule staminali auto-rinnovanti. Wash out inizia al momento del trasferimento alla coltura 3D per 5 giorni, durante i quali le cellule staminali si auto-rinnovano attraverso la divisione asimmetrica e avviano la formazione di sferoidi. Mentre le cellule staminali figlie relativamente quiescenti conservano il DNA parentale etichettato da BrdU, i progenitori della figlia proliferano rapidamente, perdendo l'etichetta BrdU. BrdU può essere sostituito con CFSE o Far Red pro-dyes, che consentono l'isolamento delle cellule staminali vive da FACS. Le caratteristiche delle cellule staminali sono confermate dalla formazione in vitro sferoide, dai saggi di rigenerazione dei tessuti in vivo e dalla documentazione delle loro divisioni cellulari simmetriche/asimmetriche. Le cellule staminali isolate che conservano l'etichetta possono essere rigorosamente interrogate da studi molecolari e biologici a valle, tra cui RNA-seq, ChIP-seq, cattura a singola cellula, attività metabolica, profilazione del proteoma, immunocitochimica, formazione di organiidi e rigenerazione dei tessuti in vivo. È importante sottolineare che questo approccio di isolamento delle cellule staminali funzionali privo di marcatori identifica le cellule staminali provenienti da campioni di cancro freschi e linee cellulari tumorali di più organi, suggerendo un'ampia applicabilità. Può essere usato per identificare biomarcatori cellulari simili a tumori, prodotti farmaceutici di schermata che prendono di mira le cellule staminali tumorali e scoprire nuovi bersagli terapeutici nei tumori.
Introduction
La ghiandola prostatica umana contiene epitelio luminoso con funzione secretoria e cellule basali sottostanti insieme a un insolito componente delle cellule neuroendocrine. Le cellule epiteliali, in questo caso, sono generate da una rara popolazione di cellule staminali prostate che sono relativamente quiescenti in vivo e fungono da sistema di riparazione per mantenere l'omeostasi ghiandolare per tutta la vita1. Nonostante molti progressi, l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali prostata rimane una sfida importante nel settore. I biomarcatori delle cellule staminali staminali, comprese le metodologie basate su marcatori di superficie cellulare combinate con la citometria di flusso, sono comunemente utilizzati per la ricerca sulle cellule staminali2,3,4. Tuttavia, i risultati per l'arricchimento e l'isolamento variano ampiamente in funzione delle combinazioni di marcatori e della specificità degli anticorpi5,6, sollevando domande sull'identità delle cellule isolate. Un altro approccio ampiamente utilizzato per l'arricchimento delle cellule staminali è la coltura tridimensionale (3D) degli sferoidi2,3,4. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti in vivo con vincoli di nicchia, subiscono la divisione cellulare nella coltura a matrice 3D (sia simmetrica che asimmetrica), generando cellule staminali e progenitrici che si riproducono rapidamente verso l'impegno di lignaggio7,8. Gli sferoidi formati sono una miscela eterogenea contenente sia cellule staminali che cellule progenitrici in varie fasi dell'impegno di lignaggio, comprese le cellule progenitrici in fase iniziale e tardiva. Pertanto, i saggi che utilizzano gli interi sferoidi non sono esclusivi per le cellule staminali, rendendo inconcludente l'identificazione di proprietà uniche delle cellule staminali. Pertanto, è fondamentale creare saggi per identificare e separare le cellule staminali della prostata dai loro progenitori figlia. A tal fine, l'obiettivo dell'attuale protocollo è quello di stabilire un sistema di analisi che consenta l'identificazione e l'isolamento efficienti delle cellule staminali dai tessuti prostata umani seguiti da una solida analisi a valle delle loro funzioni biologiche.
La ritenzione a lungo termine dell'etichetta a 5-bromo-2'-deoxyuridina (BrdU) è ampiamente utilizzata per la tracciabilità in vivo e in vitro delle cellule staminali in base al loro tempo di raddoppio prolungato9,10. L'attuale approccio per l'identificazione delle cellule staminali prostate e l'isolamento descritto qui si basa sulle loro caratteristiche quiescenti relative e sulle proprietà di ritenzione delle etichette all'interno di una popolazione epiteliale mista. Inoltre, sulla base dell'ipotesi del DNA del filamento immortale, solo le cellule staminali possono subire la divisione asimmetrica delle cellule. La cellula staminale rappresenta la cellula figlia che contiene il DNA parentale più vecchio, mentre la cellula progenitore, che è una cellula figlia impegnata, riceve il DNA appena sintetizzato. L'esclusiva proprietà delle cellule staminali descritta in precedenza viene sfruttata per eseguire l'etichettatura BrdU nelle cellule staminali parentali nelle colture primarie e quindi tenere traccia della loro etichetta dopo il lavaggio di BrdU al momento del trasferimento nella coltura di sferidi senza ancoraggio 3D. Mentre la maggior parte delle cellule epiteliali prostate primarie conservaun fenotipo basale e di transito amplificando nella coltura 2D, c'è anche una rara popolazione di cellule staminali multipotenti che ricostituiscono e mantengono l'omeostasi epiteliale come evidenziato dalla formazione di sferoidi o organoidi completamente differenziati con corrispondenti mezzi di coltura al momento del trasferimentoaisistemi 3D3,12. Nel nostro protocollo attuale, utilizzando sferoidi prostata HPrEC o brdU, CFSE o far Red ritenzioni seguite dallo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), identifichiamo cellule staminali che conservano l'etichetta negli sferoidi a livello di singola cellula13.
È importante sottolineare che abbiamo ulteriormente confermato le caratteristiche delle cellule staminali delle cellule che conservano l'etichetta all'interno di sferoidi in fase iniziale rispetto alle cellule progenitrici con impegno di lignaggio. Questi includono la divisione asimmetrica delle cellule staminali, la capacità di formazione di sferoidi in vitro e la capacità di rigenerazione dei tessuti in vivo, elevata attività dell'autofagia, biogenesi ribosomiana aumentata e diminuzione dell'attività metabolica. Successivamente, è stata eseguita l'analisi RNAseq. Sono stati osservati geni espressi in modo differenziale nelle cellule sferoidi che conservano l'etichetta che possono servire come nuovi biomarcatori per le cellule staminali della prostata umana. Questo approccio basato su sferoidi, che mantiene l'etichetta può applicarsi ai campioni di cancro per identificare in modo simile un piccolo numero di cellule staminali tumorali, fornendo così opportunità traslazionali per gestire le popolazioni resistenti terapeutiche13. Di seguito è presentato il saggio di ritenzione delle etichette basato sulla prostasfera che utilizza come esempio le cellule epiteliali primarie umane (HPrEC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le manipolazioni delle cellule e i preparati dei supporti devono essere eseguiti con tecnica asettica in un mobile di sicurezza biologica di classe II (BSC).
1. Cultura e manutenzione delle cellule HPrEC in 2D
- Cappotto 100 mm piatti di coltura con 2 mL di 2,5 g / cm2 soluzione fibronectina durante la notte a temperatura ambiente (RT). Aspirare la soluzione e lasciare asciugare i piatti della coltura nel BSC per 45 min.
- Aggiungere 9 mL del mezzo di crescita delle cellule epiteliali prostata (ad esempio, PrEGM) in un piatto di coltura di 100 mm rivestito di fibronectina e mantenere il piatto caldo in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi.
- Scongelare una fiala di cellule HPrEC congelate (2 x 105/mL) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e risospendere nuovamente le cellule in 10 mL di mezzo caldo.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
- Risospendere accuratamente le cellule in 1 mL del mezzo di coltura calda. Le cellule di semi convogliando 1 mL della sospensione cellulare direttamente nel piatto di coltura da 100 mm rivestito di fibronectina che contiene 9 mL del mezzo preriscaldato (il volume totale di medie e le cellule è di 10 mL). Rimettere i piatti della coltura in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi.
- Rifornire il mezzo ogni 2 giorni. Per farlo, aspirare con attenzione tutti i supporti e aggiungere 10 mL di fresco mezzo caldo.
- In circa 5 giorni, assicurarsi che le culture siano confluenti del 70-80%. Eseguire la digestione ezimatica incubando le cellule con 3 mL di 0,05% Trypsin/EDTA a 37 s per 5 min.
- Interrompere la digestione aggiungendo 3 mL di PBS caldo contenente 10% FBS.
- Raccogliere le cellule in un tubo di centrifuga di 50 mL e centrifugare a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 30 mL di mezzo caldo e dispensare equamente in tre nuovi piatti di coltura 100 mm rivestiti di fibronetina per il passaggio successivo.
NOTA: Le cellule HPrEC primarie possono essere passaggiate da 3 a 5x senza alterare le loro caratteristiche epiteliali basali. Il fenotipo epiteliale è testato da espressioni di marcatori di cellule epiteliali basali citokeratina 5 e p63 con saggi immunocitochimico/immunofluorescente (ICC/IF).
2. Etichettatura HPrEC con BrdU, CFSE o Far Red pro-dyes
NOTA: le celle possono procedere al passaggio 2.1 o al passaggio 2.2 seguito dal trasferimento alla coltura della prostasfera 3D, come descritto nel passaggio 3.1.
-
Etichettatura singola delle cellule con BrdU
- Coltura 2 x 105 cellule HPrEC in piatti di coltura da 100 mm ricoperti di fibronectina con 10 mL di mezzo caldo contenente 1 M di BrdU. Coltura le cellule per 10 giorni (oltre due passaggi) per garantire l'etichettatura di tutte le cellule comprese le cellule staminali della prostata e le cellule progenitrici.
- Dopo 10 giorni, aspirare con cura il mezzo PrEGM contenente il BrdU e lavare le cellule con 5 mL di PBS caldo. Ripetere 1x.
- Eseguire la digestione ezimatica utilizzando 0.05% trypsin/EDTA come descritto nei passaggi 1.7–1.8. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
- Risospendere le celle pellettate etichettate con etichetta con BrdU (5 x 104) in 500 - L di matrice/mezzo di membrana sotterranea a freddo ghiaccio (1:1) e trasferirle in una coltura prostasfera 3D (descritta al punto 3.1) per 5 giorni per consentire il lavaggio di BrdU durante la formazione dello sferoide (6 cicli cellulari).
-
Doppia etichettatura delle celle con BrdU e CFSE o Far Red pro-dyes
- Se si desidera la co-etichettatura per le cellule vive, prendere le cellule pre-etichettate incubate con BrdU per 10 giorni dal passo 2.1 e co-etichetta con 5 M CFSE o Far Red cellule fluorescenti pro-coloranti per 30 min. Eseguire la co-etichetta al giorno 10.
- Aspirare con attenzione il mezzo contenente BrdU e CFSE o Far Red pro-dyes. Lavare le celle con 5 mL di PBS caldo. Ripetere il lavaggio 1x.
- Eseguire la digestione ezimatica utilizzando 0.05% trypsin/EDTA come descritto nei passaggi 1.7–1.8. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Rimuovere e scartare il supernatante.
- Risospendere le cellule co-etichettate (5 x 104) in 500 - L di matrice/mezzo della membrana del seminterrato a freddo ghiaccio (1:1) e trasferirle a una coltura prostasfera 3D (descritta nella sezione 3.1) per 5 giorni per consentire BrdU e CFSE o Far Red washout durante la formazione degli sferoidi (6 cicli cellulari).
- Eseguire il rilevamento delle cellule che mantengono l'etichetta nelle sfere (Giorno 5 prostaspheres) come descritto nei passaggi 4.1, 4.2, 4.3 o 5.
NOTA: Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) e Far Red sono pro-dyes fluorescenti di lunga durata e sono ben conservati all'interno delle cellule etichettate. L'elanda intracellulare nelle cellule vive fenda i gruppi di acetati che attivano le molecole fluorescenti verdi o rosse che ora sono imperte in membrana.
3. Formazione della prostasfera nel sistema di coltura della membrana del seminterrato 3D
-
Coltura prostasphere nel sistema di matrice della membrana del seminterrato 3D
- Scongelare la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi durante la notte e tenere il ghiaccio prima dell'uso.
- Aggiungere delicatamente 1 mL di membrana del seminterrato ghiacciato in un volume uguale del mezzo di coltura ghiacciato. Mescolare lentamente pipetting su e giù, evitando bolle.
NOTA: Pre-coat il fondo di 12 pozzi di piastra ben coltura con 100 l di questa soluzione. Questo ridurrà al minimo il numero di cellule che rientrano nella matrice e crescono come un monostrato. - Risospendere 5 x 104 cellule HPrEC nella matrice/mezzo di coltura del cutesto a freddo (1:1) in un volume totale di 500 .
- Pipetta 500 -L di questa soluzione cellulare intorno al bordo inferiore di ogni pozzo.
- Swirl la piastra per distribuire uniformemente la miscela intorno al bordo del pozzo. Collocare la piastra in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 30 min per consentire alla matrice di solidificare.
- Una volta che la matrice si è solidificata, coprire con 1 mL di mezzo di coltura calda per pozzo. Non disturbare l'anello della matrice della membrana del seminterrato. Puntare con attenzione la punta della pipetta e dispensare il mezzo di coltura al centro del pozzo.
NOTA: Il mezzo di coltura deve essere riscaldato a 37 gradi centigradi quando viene aggiunto alla matrice della membrana del seminterrato solidificata. La matrice della membrana seminterrato perderà la sua integrità e si dissolverà quando esposto a supporti freddi / freddi. - Rifornire medio ogni 2 giorni. Aspirare con cura 500 dollari di mezzo esaurito e aggiungere 500 l di fresco mezzo di coltura calda.
- Monitorare la formazione e la crescita della prostasfera per 5-7 giorni utilizzando un microscopio invertito.
-
Passaggio di prostasfere
- Raccogliere prostasfere dalla matrice aspirando con attenzione il maggior numero di supporti possibile. Evitare di disturbare o raccogliere pezzi galleggianti della matrice solidificata.
- Aggiungere 1 mL di soluzione dispase (matrice di membrana seminterrato: dispase a un rapporto 1:2). Mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte.
- Incubare le piastre di coltura in un incubatore di CO2 a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Scattare immagini di prostasfere che si trovano nella parte inferiore del piatto di coltura per il conteggio dei numeri di sfera e le misure delle dimensioni.
- Raccogliere la miscela di sfere in un tubo da 15 mL. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 5 min a RT per pellet le sfere. Aspirare e scartare il supernatante.
- Disperdere le sfere in singole cellule digerindo con 500 , l'una di caldo 0,05% di metapsina/EDTA e trasferendo la sospensione in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
- Incubare il tubo di microcentrifuga in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Interrompere l'azione trypsin con 500 l di PBS caldo contenente 10% FBS. Passare la sospensione della sfera digerita attraverso una siringa da 1 mL con un ago 5x da 26 G per dissociare le sfere in singole cellule.
- Centrifugare la sospensione a 500 x g per 5 min per pellet le cellule a RT. Aspirate il supernatante e scartare.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di coltura calda e filtrare attraverso un colino di nylon di dimensioni pori da 40 m.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min per pellet le cellule a RT. Aspirate e scartare il sovratalmente.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di ghiaccio freddo (1:1) matrice di membrana seminterrato -proietto e sottocultura in una matrice di membrana seminterrato 3D per il secondo passaggio della prostasfera.
4. Identificazione delle cellule staminali prostate che conservano BrdU mediante colorazione immunofluorescente
- Supera le prostasfere attaccate seguite dalla colorazione immunofluorescente (IF) per l'imaging 2D delle cellule staminali prostate.
- Prostasfere di raccolta per digestione dispasia come descritto nei passaggi da 3.2.1– 3.2.3. Centrifugare le sfere in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL a 500 x g per 5 min. Scartare il supernatante.
- Risospendere le sfere in 1 mL di mezzo di coltura calda.
- Incubare 50 prostasfere per pozzo in 8 vetrini da camera in 200 gradi l di mezzo di coltura in un'incubatrice di 37 gradi centigradi durante la notte per consentire l'attaccamento e la crescita delle sfere.
- Il secondo giorno, aspirare e scartare il mezzo di coltura. Lavare le sfere obsolete con 200 l di PBS per 5 min.
- Fissare le sfere in 200 /l/po di metanolo ghiacciato a -20 gradi centigradi per 20 min.
- Lavare le sfere con 200 gradi/pozzetto di PBS per 5 min. Ripetere 2x.
- Sfere di lavaggio acido con 200 l/l/po' di 2N HCl per 30 min a RT.
- Lavare le sfere con 200 gradi/pozzetto di PBS per 5 min. Ripetere 3x.
- Aggiungere 100 l di soluzione di blocco contenente 5% siero di capra normale in PBST (PBS con 0,25% Triton X-100) e incubare per 30 min a RT.
- Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere 100 ll di PBST contenente il 2% di siero di capra normale e l'anticorpo BrdU del topo primario (1:200) a ciascun pozzo e incubare in una scatola umidificata a 4 gradi durante la notte.
NOTA: L'anticorpo Mouse IgG viene utilizzato come controllo negativo. - Aspirare e rimuovere la soluzione anticorpale primaria. Lavare le sfere con 200 gradi l di PBS per 5 min. Ripetere 2x.
- Aggiungete 100 ll l di PBST contenente il 2% di siero di capra normale e l'anticorpo secondario di Capra anti-tono Alexa Fluor 488 (1: 500) a ciascun pozzo e incubate RT al buio per 2 h.
- Aspirare e rimuovere la soluzione anticorpale secondaria. Lavare le sfere con 200 gradi l di PBS per 5 min. Ripetere 3x.
- Montate gli scivoli con 25-40 dollari di supporto di montaggio acquoso contenente DAPI.
- Ottenere immagini delle sfere/cellule colorate con un microscopio fluorescente e una fotocamera digitale a colori.
- Colore SE intero di prostasfere per l'imaging 3D delle cellule staminali prostate
NOTA: per l'intera colorazione IF, le prostasfere vengono maneggiate utilizzando tubi di microcentrifuga da 1,5 mL.- Raccogliere le prostasfere per digestione dispasi, come descritto nei passaggi da 3.2.1 a 3.2.3. Centrifugare le sfere in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare.
- Risospendere e fissare le sfere con 1 mL del 4% di paraformaldeide a RT per 20 m. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare.
- Lavare le sfere risuspendendo il pellet in 1 mL di PBS. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 1x.
- L'acido lava le sfere rispendendo il pellet in 1 mL di 2N HCl per 30 min.
- Lavare le sfere con 1 mL di PBS per 5 min e centrifugare a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 3x.
- Risospendere le sfere da 15 a 30 dollari in una soluzione di blocco di 100 gradi contenente il siero di capra normale del 5% in PBST (PBS con 0,25% Triton X-100) e incubare per 30 min a RT.
- Per rimuovere la soluzione di blocco, centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate e scartare il sovrinterrato.
- Risospendere le sfere in 100 gradi l di PBST contenenti il 2% di siero di capra normale e l'anticorpo BrdU anti-umano del topo primario (1:200) e incubare a 4 gradi durante la notte.
- Lavare le sfere risuspendendo il pellet in 1 mL di PBS. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 1x.
- Risospendere le sfere in 100 o L di PBST contenente il 2% di siero di capra normale e anticorpi secondari antito-topi Alexa Fluor 488 (1:1,000) e incubare a RT per 2 h.
- Lavare le sfere risuspendendo il pellet in 1 mL di PBS. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e scartare. Ripetere 1x.
- Risospendere le sfere in 30-50 gradi di supporto di montaggio acquoso contenente DAPI. Per evitare di appiattire le sfere, dispensele in un piatto ben creato da un piatto di coltura non rivestito di 35 mm con un fondo di vetro di copertura. Quindi aggiungere una coverslip al piatto di coltura, coprendo il pozzo.
- Acquisire immagini a sfera intera : stack utilizzando un microscopio confocale fluorescente a luce trasmessa. Convertire queste immagini a z in immagini 3D utilizzando un software di imaging con funzionalità di disegno a mano libera.
NOTA: L'anticorpo Mouse IgG viene utilizzato come controllo negativo.
- Analisi delle celle accoppiate (protocollo di 4 giorni)
- Cultura le sfere etichettate BrdU al giorno 5.
- Giorno 1: Raccogliere le sfere da una matrice di membrana seminterrato con 1 mL di digestione dispasi. Disperselo in singole cellule di 500 , luna di metapsina/EDTA calda dello 0,05% in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL, come descritto nei passaggi da 3,2,1 a 3,2,11.
- Risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di coltura calda.
- Piastrare le singole cellule disperse (300-500 dollari per pozzo) in 8 vetrini da camera e coltura in 200 : l/pozzo medio di coltura durante la notte per consentire l'attaccamento.
- Giorno 2: Cambiare il mezzo di coltura con 200-L di 2-M cytochalasin D nel mezzo di coltura e incubare durante la notte a 37 s C per consentire una divisione cellulare che si ferma alla tarda metafase in anaphase.
- Giorno 3-4: Aspirare e scartare il mezzo. Fissare le cellule in 200 l/po di metanolo ghiacciato a -20 gradi centigradi per 20 min. Seguire il protocollo di immunostaining per BrdU come descritto nei passaggi 4.1.5–4.1.14.
- Scatta immagini di cellule accoppiate con un microscopio a fluorescenza. Assicurarsi che la distanza tra i due nuclei sia inferiore a 30 m. In base alla ritenzione brdU, identificare le cellule staminali accoppiate come sottoposte a divisione cellulare simmetrica o asimmetrica.
NOTA: le cellule staminali della prostata che mantengono l'etichetta BrdU sono sottoposte a divisione simmetrica per dare origine a due cellule staminali figlie che conservano la stessa quantità di BrdU, mentre le cellule staminali staminali in fase di divisione asimmetrica danno origine a una cellula staminale figlia che conserva tutte le altra cellula progenitrice figlia che ha perso l'etichetta BrdU.
5. Isolamento delle cellule staminali della prostata che conservano l'etichetta CFSE mediante lo smistamento FACS
- Giorno 5: Raccogliere il giorno 5 giorno etichettato CFSE prostaspheres che crescono in 6 piastre di coltura ben in cultura 3D sostituendo il mezzo con 2 mL di dispase (matrice di membrana seminterrato: dispase a un rapporto 1:2). Pipette su e giù più volte per mescolare accuratamente.
- Incubare le piastre in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 30 min per digerire la matrice.
- Raccogliere la miscela di sfera in un tubo di centrifuga di 15 mL. Centrifugare le sfere a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate il supernatante e scartare.
- Risospendere il pellet sfere a 500 , l of warm 0.05% trypsin/EDTA, e trasferire in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml.
- Incubare le sfere in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Passare le sfere attraverso una siringa da 1 mL con un ago da 26 G 5x per dissociare completamente le sfere in singole cellule.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
- Risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di coltura calda che contiene 1 g/mL di propidio iodide (PI) per macchiare le cellule morte. Incubare per 1 min a RT.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
- Risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di coltura calda. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a RT. Aspirate e scartare il supernatante.
- Risospendere le cellule in 500 gradi di coltura calda e raccogliere le cellule in 5 mL di tubi rotondi rotondi filtrandoli attraverso i cappuccini a colicella di 35 m.
- Eseguire l'analisi delle cellule prostasfera con etichetta CFSE disperse da tripina con un analizzatore FACS a canale singolo.
- Gate le sottopopolazioni di parti CFSEHi, CFSEMed, e CFSELo cellule. Utilizzare i controlli negativi e positivi per il gating.
NOTA: La presenza di cellule staminali della prostata in formato CFSE ordinate in FACS (vedi Hu et al.13) può essere confermata dalla microscopia a fluorescenza verde e dalla loro maggiore dimensione delle cellule rispetto alle cellule non conservanti. Questa dimensione più grande delle cellule è una proprietà delle cellule staminali prostata rispetto alle popolazioni di cellule progenitrici. Questo può essere diverso con altri tipi di tessuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le normali cellule epiteliali umane primarie vengono inserite in piatti di coltura rivestiti di fibronectina e la crescita cellulare è mantenuta nellacoltura2D ( Figura 1a). Al momento del trasferimento nella coltura 3D con una matrice di membrana seminterrato, le cellule epiteliali differenziate si esauriscono lentamente. Solo le cellule staminali della prostata possono sopravvivere in una coltura senza ancora e formare sferoidi in 5 giorni (Figura 1b).
La doppia etichettatura delle cellule epiteliali prostata nella coltura 2D seguita dalla formazione di sferidi nella coltura 3D indica la colocalizzazione di BrdU, CFSE e Far Red nelle stesse celle di conservazione dell'etichetta (Figura 2a-i).
Le cellule che conservano l'etichetta mostrano le caratteristiche delle cellule staminali negli sferoidi del giorno 5. La doppia immunostaining mostra che le cellule che conservano l'etichetta presentano livelli più bassi di proteina citokeratina KRT14; diminuzione della proteina di giunzione cellulare E-cadherin14; aumento delle proteine marcatore precoce delle cellule staminali Wnt10B13,15,16 e ALDH1A1; aumento della proteina autofagia LC3, un indicatore dell'attività del flusso di autofagia17; e ha aumentato la miosina IIB (Figura 3a-f).
Un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi rileva con successo anche cellule staminali tumorali nei campioni di cancro alla prostata (Figura 4). Ciò consentirà la scoperta di veri biomarcatori per le cellule staminali tumorali e potrebbe identificare nuovi obiettivi terapeutici per il cancro alla prostata.
Figura 1: Manutenzione dell'HPrEC nella cultura 2D e nella formazione di sferoidi nella cultura 3D. (a) Una cultura primaria 2D di HPrEC è stata etichettata brdU e trasferita alla coltura 3D con formazione prostasfera il giorno 5 (b). Barre di scala - 400 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione delle cellule di conservazione delle etichette a lungo termine nelle prostasfere primarie. Doppia etichettatura di BrdU (rosso) e CFSE (verde); CFSE (verde) e Rosso lontano (rosso); BrdU (verde) e Far Red (rosso) hanno identificato le stesse cellule staminali con ritenzione del DNA parentale. Tutte le etichette BrdU, CFSE o Far Red in celle progenitrici che si dividono rapidamente (DAPI, blu) sono state diluite e perse (a-i). Le immagini rappresentative mostrano la coetichetta BrdU/CFSE (a-c) (pannello superiore), CFSE/Far Red (d-f) (pannello centrale) e BrdU/Far Red(g-i) (pannello inferiore) in celle a singola prostasfera (PS). Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cellule PS che conservano etichette che presentano proprietà delle cellule staminali. Rispetto alle cellule progenitrici non Le cellule staminali BRdU o CFSE che conservano l'etichetta presentano (a) livelli inferiori di citokeratina 14 (KRT 14), (b) i livelli ridotti di E-cadherin, (c) livelli elevati di Wnt10B, (d) livelli più elevati di ALDH1A1,(e) hanno aumentato l'LC3 e (f) le proteine IIB aumentate. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Utilizzo del saggio di conservazione dell'etichetta basato sulla sfera per l'identificazione di cellule staminali tumorali. Le cellule staminali del cancro che conservano l'etichetta CFSE negli sferoidi derivati da campioni di cancro alla prostata umana hanno mostrato una riduzione della proteina E-cadherin rispetto alle cellule progenitrici non etichettate. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La citometria di flusso con più marcatori di superficie di cellule staminali è un approccio comunemente usato per la ricerca sulle cellule staminali, nonostante manchi sia di specificità che di selettività1,5,6. Mentre la formazione di sferoidi in un sistema di coltura 3D è un altro metodo utile per arricchire la popolazione di cellule staminali rare da cellule epiteliali primarie, tra cui HPrEC, gli sferoidi risultanti sono ancora una miscela eterogenea di cellule staminali e progenitrici2,3,4. Nelle prostasfere, rispetto alle cellule progenitrici che proliferano rapidamente, il carattere relativamente quiescente delle cellule staminali permette loro di essere identificate dal saggio di ritenzione delle etichette a lungo termine.
I metodi riepilogati in questo documento descrivono l'etichettatura di HPrEC utilizzando BrdU, CFSE e/o Far Red pro-dyes13. Mentre BrdU, CFSE, e/o Far Red pro-dyes in cellule in rapida proliferazione sono tutti rapidamente diluiti da ogni divisione cellulare, c'è un meccanismo aggiuntivo che spiega la perdita di BrdU noto come immortal strand DNA segregation11. Questo è quando la cellula staminale subisce una divisione asimmetrica, dando origine a una cellula staminale figlia e una cellula progenitrice. La cellula staminali figlia conserva tutto il vecchio DNA parentale con etichetta BrdU, mentre la cellula progenitrice figlia riceve il DNA appena sintetizzato senza l'etichetta BrdU. Pertanto, un saggio di ritenzione di etichette con BrdU consente un'identificazione più chiara e più semplice delle cellule staminali che conservano le etichette mediante colorazione immunofluorescente. Ciò è particolarmente utile per confermare i biomarcatori delle cellule staminali mediante la doppia colorazione IF utilizzando due diversi anticorpi. Una delle principali limitazioni dell'etichettatura BrdU è che le cellule devono essere fissate per la colorazione IF, impedendo così ulteriori studi funzionali a seguito dell'etichettatura BrdU e della fissazione cellulare.
Per risolvere questo problema, due pro-dyes fluorescenti per l'etichettatura HPrEC dal vivo sono stati testati in saggi di conservazione delle etichette. I risultati hanno indicato che c'era una completa sovrapposizione di celle a sfera etichettate BrdU, CFSE e Far Red. L'etichetta BrdU potrebbe essere sostituita con CFSE o Far Red nei saggi di conservazione dell'etichetta a sfera per consentire la visualizzazione delle cellule vive per la imaging e la separazione da parte di FACS, promuovendo la caratterizzazione funzionale delle cellule staminali vive isolate utilizzando sia saggi in coltura in vitro che saggi xenograft in vivo13. Le cellule staminali e progenitrici in formato CFSE o FACS differenziate con etichetta rossa potrebbero essere utilizzate anche per le cellule RNA-seq, incluso l'RNA-seq a singola cellula, che è molto potente nell'identificare nuovi marcatori genici delle cellule staminali e vie di segnalazione delle cellule epiteliali.
Il nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali mediante un saggio di ritenzione di etichette a base di sferoide qui presentato può identificare le cellule simili a cellule staminali tumorali da campioni di pazienti primari e linee cellulari tumorali. Così, fornisce una strada per scoprire nuovi biomarcatori di cellule staminali tumorali e lo sviluppo di terapie efficaci mirano al cancro13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno rapporti finanziari da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Ringraziamo il Flow Cytometry Core dell'Università dell'Illinois a Chicago per l'assistenza sullo smistamento delle cellule.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
