Summary
Используя первичные эпителиальные клетки простаты человека, мы сообщаем о новом методе, свободном от биомаркеров функциональной характеристики стволовых клеток, спомощьив сфероидной этикетке- удержания. Пошаговым протоколом описывается для маркировки 2D, CFSE или Far Red 2D-клеток; трехмерное образование сфероидов; маркировка удерживающей стволовые клетки идентификации иммуноцитохимии; и изоляция от FACS.
Abstract
Несмотря на достижения в исследованиях стволовых клеток взрослых, выявление и изоляция стволовых клеток от образцов тканей остается серьезной проблемой. В то время как резидентные стволовые клетки относительно тихие с нишевыми удерживающими устройствами во взрослых тканях, они входят в клеточный цикл в трехмерной (3D) культуре и проходят как симметричное, так и асимметричное деление клеток, что приводит как к стеблю, так и к прародителю Клетки. Последние быстро размножаются и являются основной популяцией клеток на различных стадиях линии обязательств, образуя неоднородные сфероиды. С использованием первичных нормальных человеческих эпителиальных клеток простаты (HPrEC), сфероид основе, этикетки удержания асссбыл был разработан, что позволяет идентификации и функциональной изоляции сфероидов инициирующих стволовых клеток в одном разрешении клеток.
HPrEC или клеточные линии двухмерно (2D) культивируются с BrdU в течение 10 дней, чтобы позволить его включение в ДНК всех разделительных клеток, в том числе самообновляющихся стволовых клеток. Вымыть начинается после переноса в 3D-культуру на 5 дней, в течение которых стволовые клетки самообновляются через асимметричное деление и инициируют образование сфероидов. В то время как относительно тихие стволовые клетки дочери сохраняют родительскую ДНК, помеченную BrdU, потомки дочери быстро размножаются, теряя этикетку BrdU. BrdU можно заменить CFSE или Far Red pro-dyes, которые позволяют изоляцию стволовых клеток в реальном маштабе времени FACS. Характеристики стволовых клеток подтверждаются образованием сфероидов in vitro, анализами регенерации тканей in vivo и документированием их симметричных/асимметричных делений клеток. Изолированные этикетки удерживающих стволовых клеток могут быть тщательно допрошены вниз по течению молекулярных и биологических исследований, в том числе РНК-сек, ChIP-seq, одноклеточного захвата, метаболической активности, протеоме профилирования, иммуноцитохимии, органоидного образования, и in vivo ткани регенерации. Важно отметить, что этот подход, свободный от маркеров функциональной изоляции стволовых клеток, определяет стволовые клетки из свежих образцов рака и линии раковых клеток из нескольких органов, что свидетельствует о широкой применимости. Он может быть использован для выявления рака стволовых клеточных биомаркеров, экран фармацевтических препаратов ориентации рака стволовых клеток, и обнаружить новые терапевтические цели в раковых заболеваниях.
Introduction
Человеческая предстательная железа содержит светящийся эпителий с секреторной функцией и базальные клетки, лежащие в ее основе вместе с необычным нейроэндокринным компонентом клеток. Эпителиальные клетки, в этом случае, генерируются из редкой популяции стволовых клеток простаты, которые являются относительно затихи в vivo и выступать в качестве системы ремонта для поддержания железистого гомеостаза на протяжении всей жизни1. Несмотря на многие достижения, выявление и функциональная изоляция стволовых клеток простаты остается серьезной проблемой в этой области. Биомаркеры стволовых клеток, в том числе клеточной поверхности маркера на основе методологии в сочетании с цитометрией потока обычно используются для исследования стволовых клеток2,3,4. Тем не менее, результаты для обогащения и изоляции сильно различаются в зависимости от функции маркерных комбинаций и антитела специфичность5,6,поднимая вопросы о личности изолированных клеток. Другой широко используемый подход для стволовых, как обогащение клеток является трехмерной (3D) сфероидной культуры2,3,4. В то время как резидентов стволовых клеток относительно тихие in vivo с нишевыми ограничениями, они проходят деление клеток в 3D матричной культуры (как симметричные и асимметричные), генерации как стволовых и прародителей клеток, которые быстро размножаются к линии обязательств7,8. Сформированные сфероиды представляют собой разнородную смесь, содержащую как стволовые клетки, так и клетки-прародители на различных стадиях обязательств линии, включая клетки-прародители ранней и поздней стадии. Таким образом, анализы с использованием целых сфероидов не являются исключительными стволовыми клетками, что делает идентификацию уникальных свойств стволовых клеток неубедительной. Поэтому, очень важно создать анализы для выявления и отделения стволовых клеток простаты от их дочери-прародителей. С этой целью цель нынешнего протокола заключается в создании системы анализа, которая позволяет эффективно выявлять и изоляцию стволовых клеток из тканей предстательной железы человека с последующим тщательным анализом их биологических функций.
Долгосрочный 5-бромо-2'-deoxyuridine (BrdU) этикетка-удержание широко используется для in vivo и in vitro lineage отслеживания стволовых клеток на основе их длительного удвоения времени9,10. Нынешний подход к идентификации и изоляции стволовых клеток простаты, описанный в настоящем документе, основан на их относительных тихих характеристиках и свойствах удержания этике в смешанной эпителиальной популяции. Кроме того, на основе гипотезы бессмертной нити ДНК, только стволовые клетки могут пройти асимметричное деление клеток. Стволовая клетка представляет собой дочернюю клетку, которая содержит более старую родительскую ДНК, в то время как клетка-прародитель, которая является клеткой-приверженной дочерью, получает недавно синтезированную ДНК. Уникальное свойство стволовых клеток, описанное выше, используется для выполнения маркировки BrdU в родительских стволовых клетках в первичных культурах, а затем отслеживать их этикетку после BrdU-вымывания при переходе к 3D-безякорной культуре сфероидов. В то время как большинство первичных эпителиальных клеток простаты сохраняют базальный и транзитный усиливающий фенотип в 2D-культуре, есть также редкая популяция многопотентных стволовых клеток, пополняя и поддерживая эпителиальный гомеостаз, о чем свидетельствует образование сфероидов или полностью дифференцированных органоидов с соответствующими культурами при передаче в 3D-системы3,12. В нашем текущем протоколе, с помощью HPrEC простаты сфероидов или простасфера основе BrdU, CFSE, или Дальнекрасный удержания анализы следуют флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), мы определяем этикетки удерживающих стволовых клеток в сфероидов на уровне одной клетки13.
Важно отметить, что мы также подтвердили характеристики стволовых клеток клеток, удерживающих этикетку в сфероидах на ранней стадии, по сравнению с клетками-прародителями с родословной. К ним относятся асимметричное деление стволовых клеток, способность образования сфероидов in vitro и способность регенерации тканей in vivo, повышенная аутофагия, увеличенный биогенеза рибосомы и снижение метаболической активности. Впоследствии был проведен анализ РНАЗЕКа. По дифференциально выраженные гены в сфероидных клетках, сохраняющих этикетку, были замечены, которые могут служить новыми биомаркерами для стволовых клеток простаты человека. Этот сфероид на основе этикетки удерживая подход может применяться к образцам рака аналогичным образом определить небольшое количество раковых стволовых клеток, тем самым обеспечивая переводческие возможности для управления терапевтической резистентной популяции13. Ниже представлен prostasphere основе этикетки удержания асссс использованием основных эпителиальных клеток простаты человека (HPrEC) в качестве примера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все обработки клеток и средств массовой информации препараты должны быть выполнены с асептической техникой в классе II биологической безопасности кабинета (BSC).
1. Культура и содержание ячеек HPrEC в 2D
- Пальто 100 мм культуры блюда с 2 мл 2,5 мкг /см2 фибронектина раствор на ночь при комнатной температуре (RT). Приготовьте раствор и дайте культуре посуда на сухом воздухе в BSC в течение 45 мин. Фибронектин покрытием культуры блюда могут храниться 2-4 недели при 4 градусах Цельсия.
- Добавьте 9 мл среды роста эпителиальной клетки простаты (например, PrEGM) в блюдо культуры с покрытием 100 мм с покрытием фибронектина и сохраняйте блюдо в тепле в инкубаторе CO2 при 37 градусах Цельсия.
- Оттепель один флакон замороженных клеток HPrEC (2 х 105/мл) в водяной бане 37 градусов по Цельсию и resuspend клетки в 10 мл теплой среде.
- Центрифуга подвески ячейки на 500 х г в течение 5 минут на RT. Аспират и отказаться от супернатанта.
- Тщательно resuspend клетки в 1 мл теплой среде культуры. Семенные клетки путем трубоукладки 1 мл клеточной суспензии непосредственно в фибронектин покрытием 100 мм культуры блюдо, содержащее 9 мл предварительно разогретой среды (общий объем среднего и клеток составляет 10 мл). Поместите культурные блюда обратно в инкубатор CO2 при 37 градусах Цельсия.
- Пополнять среду каждые 2 дня. Для этого тщательно аспирируйте все носители и добавьте 10 мл свежей теплой среды.
- Примерно через 5 дней, убедитесь, что культуры 70-80% слияния. Выполните ферментативное пищеварение путем инкубации клеток с 3 мл 0,05% Трипсин / EDTA при 37 кв кв в течение 5 мин.
- Остановите пищеварение, добавив 3 мл теплого PBS, содержащего 10% FBS.
- Соберите клетки в 50 мл центрифуги трубки и центрифуги на 500 х г в течение 5 минут на RT. Аспират и отбросить супернатанта.
- Отрежь яточные гранулы в 30 мл теплой среды и распределяйте его поровну в три новых фибронектина покрытием 100 мм культуры блюда для следующего прохода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные клетки HPrEC могут быть проложено 3-5x без изменения их базальных эпителиальных клеточных характеристик. Эпителиальный фенотип тестируется с помощью экспрессий базальных эпителиальных клеточных маркеров цитокератин 5 и р63 с иммуноцитохимией/иммунофлуоресцентными (ICC/IF) анализами.
2. Маркировка HPrEC с BrdU, CFSE, или Дальнекрасный про-красителей
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут приступить либо к шагу 2.1 или шаг 2.2 после перехода к 3D prostasphere культуры, как описано в шаге 3.1.
-
Однократная маркировка клеток с BrdU
- Культура 2 х 105 HPrEC клеток в фибронектин покрытием 100 мм культуры блюда с 10 мл теплой среде, содержащей 1 мкм BrdU. Культура клетки в течение 10 дней (более двух проходов), чтобы обеспечить маркировку всех клеток, включая стволовые клетки простаты и клетки-прародители.
- После 10 дней, тщательно аспирировать PrEGM среды, содержащей BrdU и мыть клетки с 5 мл теплой PBS. Повторите 1x.
- Выполните ферментативное пищеварение с использованием 0,05% трипсина/EDTA, как описано в шагах 1.7-1.8. Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 мин на RT. Аспират и отказаться от супернатанта.
- Resuspend BrdU-маркированных гранулированных клеток (5 х 104) в 500 л ледяной (1:1) подвал мембранной матрицы / среднего и передачи на 3D простасферной культуры (описанные в шаге 3.1) в течение 5 дней, чтобы позволить BrdU вымывания во время формирования сфероидов (6 циклов клеток).
-
Двойная маркировка клеток с BrdU и CFSE или Far Red pro-dyes
- Если рекомендуется совместное маркировка живых клеток, возьмите предварительно обозначенные клетки, инкубированные BrdU в течение 10 дней со ступени 2.1 и совместно этикетку с 5 мкм CFSE или Far Red живые клетки флуоресцентные про-красителей в течение 30 мин. Выполните совместное обозначение в день 10.
- Тщательно аспирировать среду, содержащую BrdU и CFSE или Far Red про-красителей. Вымойте клетки с 5 мл теплого PBS. Повторите мыть 1x.
- Выполните ферментативное пищеварение с использованием 0,05% трипсина/EDTA, как описано в шагах 1.7-1.8. Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 мин на RT. Удалить и отказаться от супернатанта.
- Повторное использование комаркированных клеток (5 x 104) в 500 qL ледяной (1:1) подвальной мембранной матрицы/среды и перенос на 3D-культуру простасферы (описанной в разделе 3.1) в течение 5 дней, чтобы позволить БрДУ и CFSE или Far Red washout во время образования сфероидов (6 циклов клеток).
- Выполните обнаружение клеток, удерживающих этикетки, в сферах (День 5 простасфер), как описано в шагах 4.1, 4.2, 4.3 или 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Carboxyfluorescein диацетат succinimidyl эфир (CFSE) и Дальнекрасный являются длительными флуоресцентные про-красителей и хорошо сохраняются в помеченных клеток. Внутриклеточная эстераза в живых клетках расщепляют ацетатные группы, которые активируют зеленые или красные флуоресцентные молекулы, которые в настоящее время мембраны impermeant.
3. Формирование простасферы в системе культуры 3D-мембраны
-
Культура простасферы в 3D мембранной матричной системе
- Оттепель подвал мембраны матрицы на 4 градуса Цельсия на ночь и держать на льду перед использованием.
- Аккуратно добавьте 1 мл ледяной мембранной матрицы в равный объем среды ледяной культуры. Медленно смешивайте, трубачат вверх и вниз, избегая пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно покройдное дно 12 колодцев с культурой скважин ы и 100 зл. Это позволит свести к минимуму количество клеток, которые попадают через матрицу и растут как монослой. - Resuspend 5 х 104 HPrEC клеток в ледяной (1:1) подвал мембранной матрицы / культуры среднего смеси в общей объеме 500 зл.
- Пипетка 500 л этого клеточного раствора вокруг нижнего края каждой скважины.
- Swirl пластины равномерно распределить смесь вокруг обода скважины. Поместите пластину в инкубатор CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин, чтобы матрица затвердела.
- После того, как матрица затвердеет, накройте 1 мл теплой культуры среды в скважине. Не нарушайте подвал мембраны матричного кольца. Тщательно нацелить наконечник пипетки и распределить культуры среды в центре колодца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культурная среда должна быть разогрета до 37 градусов по Цельсию при добавлении в затвердевную мембранную матрицу подвала. Матрица мембраны подвала потеряет свою герметичность и растворится при воздействии холода/холодных носителей. - Пополнить среду каждые 2 дня. Тщательно аспирируйте 500 евро отработанного среднего и добавьте 500 л свежей теплой культуры среды.
- Мониторинг формирования и роста простасферы в течение 5-7 дней с помощью перевернутого микроскопа.
-
Пропуск простасфер
- Урожай prostaspheres из матрицы, тщательно aspirating от как можно больше средств массовой информации, как это возможно. Избегайте тревожных или собирание плавающих частей затвердевной матрицы.
- Добавьте 1 мл раствора диспаса (подвальная мембранная матрица: распасса при соотношении 1:2). Тщательно перемешайте, повысив вверх и вниз несколько раз.
- Инкубировать культурные тарелки в инкубаторе CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
- Возьмите изображения простасфер, которые находятся в нижней части культуры блюдо для подсчета числа сферы и измерения размера.
- Соберите шаровую смесь в трубку 15 мл. Centrifuge подвески на 500 х г в течение 5 мин на RT, чтобы гранулы сфер. Аспирируй и отбрасывай супернатант.
- Разогнать сферы на одиночные клетки, переварив с 500 л тепла 0,05% трипсина /ЭДТА и перенося подвеску в микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
- Инкубировать микроцентрифуг трубку в инкубатор CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Остановите действие трипсина с 500 Зл т.л. теплого PBS, содержащего 10% FBS. Передайте переваренный сферный суспензию через шприц 1 мл с иглой 26 G 5x, чтобы разъединить сферы на одиночные клетки.
- Центрифуга подвески на 500 х г в течение 5 минут, чтобы гранулы клетки на RT. Аспирировать супернатант и отбросить.
- Resuspend клетки гранулы в 1 мл теплой среде культуры и фильтр через 40 мкм пор размер нейлона ячейки ситечко.
- Центрифуга суспензии клеток на 500 х г в течение 5 минут, чтобы гранулы клетки на RT. Аспират и отказаться от супернатанта.
- Resuspend клеточной гранулы в 1 мл ледяной (1:1) подвал мембранной матрицы / культуры среды и субкультуры в 3D подвалм мембранной матрицы для второго прохождения простасферы.
4. Идентификация стволовых клеток предстательной железы, удерживающих БрДУ, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
- Перерастают прикрепленные простасферы с последующим иммунофлуоресцентным (IF) окрашиванием для 2D-изображения стволовых клеток простаты.
- Урожай простасферы путем диспази пищеварения, как описано в шагах 3.2.1-3.2.3. Центрифуги сферы в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки на 500 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
- Перепристеть сферы в 1 мл теплой культуры среды.
- Инкубировать 50 простасфер в скважине в 8 хорошо камерных слайдов в 200 зЛ культуры среды в 37 градусов по Цельсию инкубатор ночь, чтобы для крепления и нарастания сфер.
- На второй день, аспирируйте и отбрасывая культуры среды. Вымойте переросшие сферы с 200 Л ПБС в течение 5 мин.
- Зафиксировать сферы в 200 л/колодец ледяного метанола при -20 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
- Вымойте сферы с 200 Л/колодец PBS в течение 5 мин. Повторите 2x.
- Кислотные сферы для мытья с 200 Л/колодец 2N HCl в течение 30 минут на RT.
- Вымойте сферы с 200 Л/колодец PBS в течение 5 мин. Повторите 3x.
- Добавьте 100 зл блокирующего раствора, содержащего 5% нормальной козьей сыворотки в PBST (PBS с 0,25% Triton X-100) и инкубировать в течение 30 мин на РТ.
- Аспирировать блокирующий раствор и добавить 100 Л PBST, содержащий 2% нормальной сыворотки козий и первичной мыши анти-человеческого антитела BrdU (1:200) к каждому колодцу и инкубировать в увлажненной коробке при 4 градусах Цельсия в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь IgG антитела используется в качестве отрицательного контроля. - Аспирируй и удаляй основной раствор антитела. Вымойте сферы с 200 зл и л PBS в течение 5 мин. Повторите 2x.
- Добавьте 100 кЛ PBST, содержащий 2% нормальной козьей сыворотки и вторичной козьей антимышки Alexa Fluor 488 антитела (1: 500) к каждому колодцу и инкубировать на RT в темноте в течение 2 ч.
- Аспирируй и удаляй вторичный раствор антитела. Вымойте сферы с 200 зл ИТ PBS в течение 5 мин. Повторите 3x.
- Смонтировать горки с 25-40 ql водной монтажной среды, содержащей DAPI.
- Получайте изображения окрашенных сфер/клеток с флуоресцентным микроскопом и цветной цифровой камерой.
- Целое горе, ЕСЛИ окрашивание простасфер для 3D-изображения стволовых клеток простаты
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всего крепления IF окрашивания, простасферы обрабатываются с помощью 1,5 мл микроцентрифуговых труб.- Урожай простасфер ы диспазировать пищеварение, как описано в шагах 3.2.1-3.2.3. Центрифуга сферы в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки на 500 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и отбрасываете.
- Прикрепите и зафиксируйте сферы с 1 мл 4% параформальдегида на RT в течение 20 мин. Центрифуг сферы на 500 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и отбросить.
- Вымойте сферы, приостановив пеллету в 1 мл PBS. Центрифуги сферы на 500 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и отбрасываете. Повторите 1x.
- Кислота мыть сферы, resuspending гранулы в 1 мл 2N HCl в течение 30 минут.
- Вымойте сферы с 1 мл PBS в течение 5 мин и центрифуги на 500 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и отбросить. Повторите 3x.
- Отреприжить 15-30 сфер в 100 л блокирующего раствора, содержащего 5% нормальную козью сыворотку в PBST (PBS с 0,25% Triton X-100) и инкубировать в течение 30 мин на РТ.
- Чтобы удалить блокирующий раствор, центрифугите сферы на 500 х г в течение 5 мин. Аспирируйте и отбросьте супернатант.
- Resuspend сферы в 100 ЗЛ PBST, содержащий 2% нормальной сыворотки козы и первичной мыши анти-человеческого антитела BrdU (1:200) и инкубировать при 4 градусах Цельсия в одночасье.
- Вымойте сферы, приостановив пеллету в 1 мл PBS. Центрифуги сферы на 500 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и отбрасываете. Повторите 1x.
- Resuspend сферы в 100 ЗЛ PBST, содержащий 2% нормальной козьей сыворотки и вторичной козы анти-мышь Alexa Fluor 488 антитела (1:1,000) и инкубировать на RT в течение 2 ч.
- Вымойте сферы, приостановив пеллету в 1 мл PBS. Центрифуги сферы на 500 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и отбрасываете. Повторите 1x.
- Приостановите действие сфер в 30-50 злику вакусвоенной среды, содержащей DAPI. Чтобы не уплощать сферы, распределите их в хорошо созданное из 35-мм непокрытого культурного блюда с крышкой стеклянного дна. Затем добавьте покрывало в блюдо культуры, покрывающее колодец.
- Приобретите изображения всей сферы стеков с помощью передаваемого света перевернутого флуоресцентного конфокального микроскопа. Преобразуйте эти изображения в 3D-изображения с помощью программного обеспечения для визуализации с возможностями свободного рисования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь IgG антитела используется в качестве отрицательного контроля.
- Анализ парных клеток (4-дневный протокол)
- Культура BrdU помечены сферы на день 5.
- День 1: Урожай сфер из подвальной мембранной матрицы с 1 мл диспази пищеварения. Рассредоточьтесь на одиночные клетки на 500 л теплая 0,05% трипсина/ЭДТА в микроцентрифуговой трубке 1,5 мл, как описано в шагах 3,2,1-3,2,11.
- Приготовьте клетки в 1 мл теплой культуры среды.
- Плита рассеянных одиночных клеток (300-500 фунтов за скважину) в 8 хорошо камерных слайдов и культуры в 200 Л / хорошо культуры среды в одночасье, чтобы для вложения.
- День 2: Изменение среды культуры с 200 qL 2 мкм цитохалазин D в среде культуры и инкубировать ночь на 37 градусов по Цельсию, чтобы один деление клеток, что паузы на поздней метафазы на анафазу.
- День 3-4: Аспирируй и отбрасывайте среду. Исправьте клетки в 200 л/колой ледяного метанола при -20 градусах По Цельсию в течение 20 мин. Следуйте протоколу иммуносохранения для BrdU, как описано в шагах 4.1.5-4.1.14.
- Возьмите изображения парных клеток с флуоресцентным микроскопом. Убедитесь, что расстояние между двумя ядрами составляет менее 30 мкм. Основываясь на удержании BrdU, определите парные стволовые клетки как проходящие симметричное или асимметричное деление клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: BrdU этикетки удерживая стволовые клетки простаты проходят симметричное деление, чтобы привести к двум стволовым клеткам дочери сохраняя равное количество BrdU, в то время как стволовые клетки, проходящие асимметричное деление приводят к одной дочери стволовых клеток, сохраняющих все BrdU и другую дочернюю клетку-прародителя, которая потеряла этикетку BrdU.
5. Изоляция cfSE этикетки удерживающих стволовых клеток простаты сортировки FACS
- День 5: Урожай CFSE помечены день 5 prostaspheres растет в 6 хорошо культуры пластин в 3D культуры, заменив среду с 2 мл диспазы (подвальная мембранная матрица: dispase на 1:2 соотношение). Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно перемешать.
- Инкубировать пластины в ИНкубатор CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы переварить матрицу.
- Соберите шаровую смесь в центрифугу мощностью 15 мл. Центрифуги сферы на 500 х г в течение 5 минут на RT. Аспирируйте супернатант и отбрасываете.
- Приостановите гранулы сферы в 500 л тепла 0,05% трипсина/ЭДТА и перенесите в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
- Инкубировать сферы в инкубаторе CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Добавить 500 л теплого PBS, содержащего 10% FBS.
- Передайте сферы через шприц 1 мл с иглой 26 G 5x, чтобы полностью разъединить сферы на одиночные клетки.
- Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 мин на RT. Аспират и отказаться от супернатанта.
- Resuspend клетки в 1 мл теплой среде культуры, содержащей 1 мкг/мл пропиий йодида (PI) для окрашивания мертвых клеток. Инкубировать в течение 1 мин на RT.
- Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 мин на RT. Аспират и отказаться от супернатанта.
- Приготовьте клетки в 1 мл теплой культуры среды. Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 мин на RT. Аспират и отказаться от супернатанта.
- Resuspend клетки в 500 л теплой среде культуры и собирать клетки в 5 мл полистирола круглые нижние трубки, фильтруя их через 35 мкм пор размер ячейки ситечко оснастки.
- Выполните анализ трипсин-рассеянных CFSE-маркированных простасферных клеток с одноканальным анализатором FACS.
- Ворота субпопуляции фракционированных CFSEПривет, CFSEMed, и CFSELo клеток. Используйте отрицательные и положительные элементы управления для gating.
ПРИМЕЧАНИЕ: Присутствие FACS отсортированных CFSE этикетки удерживающих стволовых клеток простаты (см. Hu et al.13) может быть подтверждено зеленой флуоресценции микроскопии и их больший размер клетки по сравнению с не-сохраняющихся клеток. Этот больший размер клетки является свойством стволовых клеток простаты по отношению к популяциям клеток-прародителей. Это может быть различным с другими типами тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первичные нормальные клетки эпителия простаты человека помещаются в фибронектин покрытием культуры блюда и рост клеток поддерживается в 2D культуры(Рисунок 1a). При переходе в 3D-культуру с мембранной матрицей подвала дифференцированные эпителиальные клетки медленно вымирают. Только стволовые клетки простаты могут выжить в якорь свободной культуры и формы сфероидов в 5 дней(Рисунок 1b).
Двойная маркировка эпителиальных клеток простаты в 2D-культуре с последующим образованием сфероидов в 3D-культуре указывает на колокализацию BrdU, CFSE и Far Red в тех же клетках, сохраняющих этикетку(рисунок 2a-i).
Клетки, удерживающие этикетку, показывают характеристики стволовых клеток в сфероидах 5-го дня. Двойное иммуносохранение показывает, что клетки, удерживающие этикетку, обладают более низким уровнем цитокератинового белка KRT14; снижение клеточного соединения белка E-кадерин14; увеличение стволовых клеток ранних маркерных белков Wnt10B13,15,16 и ALDH1A1; повышенный аутофагия белка LC3, индикатор аутофагии потока активности17; и увеличение миозина МИБ(Рисунок 3a-f).
Сфероид на основе этикетки удержания анализ также успешно обнаруживает рак стволовых, как клетки в образцах рака простаты(Рисунок 4). Это позволит обнаружить истинные биомаркеры для раковых стволовых клеток и имеет потенциал для выявления новых терапевтических целей для рака простаты.
Рисунок 1: Поддержание HPrEC в 2D-культуре и сфероидное образование в 3D-культуре. () 2D первичной культуры HPrEC был BrdU-маркировки и переданы 3D культуры с простасферой формирования на день 5(b). Шкала баров 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Идентификация долгосрочных клеток, удерживающих этикетки, в первичных простасферах. Двойная маркировка BrdU (красный) и CFSE (зеленый); CFSE (зеленый) и Дальнекрасный (красный); BrdU (зеленый) и Far Red (красный) определили такие же стволовые клетки с сохранением родительской ДНК. Любые этикетки BrdU, CFSE или Far Red в быстро делящих клетках-прародителях (DAPI, синий) были разбавлены и потеряны(a-i). Репрезентативные изображения показывают BrdU/CFSE(a-c) (верхняяпанель), CFSE/Far Red(d-f)(средняя панель) и BrdU/Far Red(g-i) (нижняя панель) совместной маркировки в одной простасфере (PS) клетках. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Label-retaining PS клетки, демонстрирующие свойства стволовых клеток. По сравнению с не-маркировки удерживающих клеток-прародителей, BrdU или CFSE этикетки удерживающих стволовых клеток экспонат(a) более низкие уровни цитокератин 14 (KRT 14), (b) снижение уровня E-кадхерин,(c) повышенные уровни Wnt10B,(d)более высокие уровни ALDH1A1, (e) увеличилось. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Использование основанного на сфере исследования, удерживающего этикетку, для идентификации стволовых клеток, похожих на рак. CFSE этикетки удерживающих рака стволовых клеток в сфероидов, полученных из человеческих образцов рака простаты выставлены снижение E-кадерин белка по отношению к не-помечены клетки-прародителя. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цитометрия потока с использованием нескольких маркеров поверхности стволовых клеток является широко используемым подходом для исследования стволовых клеток, несмотря на отсутствие как специфичности, так и избирательности1,5,6. В то время как образование сфероидов в системе 3D культуры является еще одним полезным методом в обогащении редких популяций стволовых клеток из первичных эпителиальных клеток, включая HPrEC, в результате сфероидов по-прежнему неоднородная смесь стволовых и клеток-прародителей2,3,4. В простасферах, по сравнению с быстро размножающимися клетками-прародителями, относительно потихлый характер стволовых клеток позволяет их идентифицировать по долгосрочному оценке удержания этикеток.
Методы, резюмированные в настоящем документе, описывают маркировку HPrEC с использованием BrdU, CFSE и/или Far Red pro-dyes13. В то время как BrdU, CFSE, и / или Far Red про-красителей в быстро размножающихся клеток все быстро разбавленной каждой ячейки деления, есть дополнительный механизм, который объясняет потерю BrdU известный как бессмертный прядь ДНК сегрегации11. Это когда стволовая клетка подвергается асимметричному делению, что приводит к одной дочери стволовых клеток и клетки-прародителя. Стволовая клетка дочери сохраняет всю старую родительскую ДНК с этикеткой BrdU, в то время как клетка-прародитель дочери получает недавно синтезированную ДНК без этикетки BrdU. Таким образом, анализ удержания этикетки с использованием BrdU позволяет более четко и легко идентифицировать удерживающие этикетку стволовые клетки с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Это особенно полезно для подтверждения биомаркеров стволовых клеток, если двойное окрашивание с помощью двух различных антител. Одним из основных ограничений brdU маркировки является то, что клетки должны быть исправлены для окрашивания IF, тем самым предотвращая дальнейшие функциональные исследования после маркировки BrdU и фиксации клеток.
Чтобы решить эту проблему, два флуоресцентных про-красителей для живой маркировки HPrEC были протестированы в этикетке сохранения анализов. Результаты показали, что существует полное перекрытие BrdU, CFSE, и Дальнекрасный помечены шаровых клеток. BrdU этикетка может быть заменена CFSE или Far Red в сфере на основе этикетки удерживающих анализов, чтобы визуализация живых клеток для визуализации и разделения ПО FACS, содействие функциональной характеристике изолированных живых стволовых клеток, используя как анализы in vitro клеточной культуры и in vivo xenograft анализы13. CFSE или Far Red этикетке на основе FACS отсортированных живой стебель и клетки-прародители также могут быть использованы для РНК-сек, включая одноклеточные РНК-сек, который является очень мощным в выявлении новых маркеров генов стволовых клеток и сигнальных путей, а также эпителиальной иерархии линии клеток.
Новый метод, свободный от биомаркеров функциональной характеристики стволовых клеток, представленный здесь на основе сфероидных меток-удержания, может выявить раковые стволовые клетки из первичных образцов пациентов и линий раковых клеток. Таким образом, он предоставляет возможность для обнаружения новых биомаркеров рака стволовых клеток и разработки эффективных терапевтических препаратов, направленных на рак13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовых отношений раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Национального института рака R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Мы благодарим Flow Cytometry Core в Университете Иллинойса в Чикаго за помощь в сортировке клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
References
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
