Vi præsenterer en microinjectrode system designet til Elektrofysiologi og assisteret levering af eksperimentelle sonder (dvs., nanosensorer, mikroelektroder), med valgfri Drug infusion. Alment tilgængelige mikrofluidiske komponenter kobles til en kanyle, der indeholder sonden. En trin-for-trin-protokol for microinjectrode konstruktion er inkluderet, med resultater under muscimolholdige infusion i makak cortex.
Denne microinjectrode system er designet til lægemiddel infusion, Elektrofysiologi, og levering og hentning af eksperimentelle sonder, såsom mikroelektroder og nanosensorer, optimeret til gentagen brug i vågen, opfører dyr. Microinjectrode-systemet kan konfigureres til flere formål: (1) enkel anbringelse af kanyle til anbringelse af en eksperimentel sonde, der ellers ville være for skrøbelig til at trænge ind i dura mater, (2) mikrofluidisk infusion af et lægemiddel, enten uafhængigt eller koblet til en kanyle, der indeholder en eksperimentel sonde (dvs. mikroelektrode, Nanosensor). I denne protokol forklarer vi trin for trin opførelse af microinjectrode, dens kobling til mikrofluidisk komponenter, og protokollen for brug af systemet in vivo. De mikrofluidiske komponenter i dette system giver mulighed for levering af volumener på nanoliter skalaen, med minimal indtrængnings skade. Drug infusion kan udføres uafhængigt eller samtidig med eksperimentelle sonder såsom mikroelektroder eller nanosensorer i en vågen, opfører dyr. Anvendelser af dette system spænder fra måling af virkningerne af et lægemiddel på kortikale elektriske aktivitet og adfærd, til at forstå funktionen af en bestemt region af cortex i forbindelse med adfærdsmæssige præstationer baseret på sonde eller Nanosensor målinger. For at demonstrere nogle af funktionerne i dette system, præsenterer vi et eksempel på muscimolholdige infusion for reversibel inaktivering af frontal Eye felt (FEF) i rhesus makak under en fungerende hukommelse opgave.
Elektrofysiologi og Drug injektion metoder er meget udbredt i neurovidenskab at studere neuronal aktivitet og adfærd, in vivo, i gnavere og primater. I løbet af de sidste tre årtier, forbedringer af de tidlige injectrode modeller tillod en mere præcis og mindre invasiv teknik, og samtidige optagelse og Drug injektion på specifikke hjerne steder1,2,3. For primater i særdeleshed, evnen til præcist at levere små mængder med minimal vævsskade er afgørende, hvis teknikken skal anvendes til undersøgelse af avancerede kognitive funktioner, der kræver højtuddannede dyr. Nylige fremskridt omfatter kroniske elektrofysiologiske og kemiske målinger i kombination med stimulation ved hjælp af implanterede sonder4, og kombineret optagelse og mikrofluidisk Drug levering er for nylig blevet afprøvet i gnavere5. Injectrode-systemet, der er beskrevet her, tillader elektrofysiologisk optagelse, stimulering og præcis lægemiddel levering, og det er allerede gennemført med succes i flere primat Labs6,7,8.
Den stigende tilgængelighed af sarte, specialiserede sensorer, såsom nanosensorer9,10 med neurovidenskabelige applikationer, kræver en pålidelig metode til at få sonden gennem dura mater uden at beskadige de skrøbelige nanoskala enheder eller Micro elektrode spidser.
Vi designede et microinjectrode system, der overvinder de tekniske udfordringer ved at kombinere disse metoder ved hjælp af let tilgængelige, billige komponenter, og letter to hovedfunktioner: (i) evnen til at placere en skrøbelig eksperimentel sonde, såsom en mikroelektrode eller Nanosensor, gennem dura mater og neurale væv, beskyttet mod eventuelle skader. Denne funktion tillader placering af den eksperimentelle sonde på målrettede steder, leveret ved hjælp af kanyle som en guide gennem neurale væv. II) evnen til at anvende en mikroelektrode til at udføre eksperimenter, der kombinerer Elektrofysiologi optagelser og elektrisk stimulation med lægemiddel indsprøjtning.
Vores system bruger et styre slange til at trænge ind i Dura, sammen med en kanyle, der fungerer både til levering af lægemidler (ved brug af systemet til mikroinfusion) og giver yderligere beskyttelse af mikroelektroden eller nanosensoren (både ved passage gennem dura og neurale væv). Dette system kan nemt konstrueres med bredt kommercielt tilgængelige komponenter, som er billige og nemme at finde. Vi minimerer indtrængen skader ved hjælp af en lille diameter kanyle (udvendig diameter OD = 235 μm, indre diameter ID = 108 μm).
Her præsenterer vi trin-for-trin instruktioner til microinjectrode konstruktion og konfiguration af mikrofluidisk system. Vi forklarer de nødvendige skridt til brug af microinjectrode, enten uafhængigt eller koblet til det mikrofluidisk-system til lægemiddel indsprøjtning. En lignende fremgangsmåde kan anvendes med enhver skrøbelig eksperimentel sonde, såsom en Nanosensor9,10. Sonden kan være foran-eller tilbage-indlæst i kanyle (afhængigt af design), og vil blive beskyttet mod skader, når penetrateret dura og neurale væv. Vi leverer eksempeldata fra et in vivo-eksperiment med ikke-menneskelige primater, hvor vi brugte en wolfram-mikroelektrode til at udføre elektrisk stimulation og efterfølgende injicerede muscimolholdige i frontal øjet (FEF), mens dyret udførte en Memory guidet saccade (MGS) opgave.
Flere metoder er i øjeblikket tilgængelige til at udføre samtidige Drug levering og Elektrofysiologi. Vores system er beregnet til at have den fleksibilitet, der skal anvendes til optagelser enten uafhængigt eller i kombination med Drug injektion, og at have evnen til præcist at placere enhver skrøbelig eksperimentel sonde, såsom en Nanosensor eller en mikroelektrode, beskyttet mod enhver skade, gennem dura mater og neurale væv. Systemet giver mulighed for præcis styring af lægemiddel infusions volumener med det blotte øje (17 nL præcision vist i tidligere undersøgelser i vores Lab3).
Der er flere specialiserede systemer til tryk injektion med mindre diametre12. Disse systemer giver mulighed for flere optagelse sites, men den komplekse opsætning af software og hardware, der kræves for kontrol af systemet bærer højere omkostninger for hver af komponenterne, og har mindre fleksibilitet til at interface med eksperimentelle sonder, som endnu ikke er kommercialiseret i stor skala. Desuden, vores injectrode kræver ikke et kronisk implantat og giver en stor grad af fleksibilitet: kompatibel med biosensorer til at måle kemiske og elektrofysiologiske signaler, og i stand til at inficere narkotika samt, med potentiale til at måle effekten af lokaliserede Drug infusioner på disse reaktioner.
Designet gør det muligt at udstå den eksperimentelle sonde efter Dura penetration for at undgå beskadigelse af sondens struktur. Denne funktion giver mulighed for multifunktionalitet af enheden, at trænge ind i Dura uden at risikere beskadigelse af en eksperimentel sonde såsom nanometer-skala nanosensorer10. Men der er en begrænsning af længden, der kan frem springede, begrænset af antallet af drejninger af ferrule, begrænset til ~ 1 mm for standard ferrules. Der er minimal vævsskade på grund af den lille kanyle diameter (228 μm).
I forsøget viste vi, at systemet blev anvendt til at udføre kontrolleret levering af muscimolholdige til reversibel inaktivering af FEF, samtidig med enten elektrisk stimulation eller ekstracellulær optagelse (enkelt neuron, lokalt felt potentiale) ved hjælp af en mikroelektrode. Dette eksperiment i FEF kræver mikrostimulering af FEF for at bekræfte saccade vektorer før inaktivering, og stoffet blev invant til at studere arbejdshukommelsen under reversibel FEF inaktivering. Det er usandsynligt, at en optagelse fra samme isolerede enkelt neuron kan opretholdes før og efter lægemidlet injektion; men vi var i stand til at optage lokale felt potentialer før og efter infusion. Her viser vi et eksperiment, som kombinerer injektion, optagelse og elektrisk stimulation.
Når det er sat op, metoden er meget pålidelig og robust. Men på grund af udfældning af små molekyler (f. eks. salt) inden for det lille rør og havne, kræves en grundig skylning efter hvert eksperiment for at holde mikrofluidics fri for forhindringer og lækager. På grund af enkelheden i hele kredsløbet, kan hver komponent udskiftes uafhængigt for nem fejlfinding.
Selv om metoden blev demonstreret i FEF-området i en ikke-menneskelig primat, kan princippet anvendes på alle andre hjerneområder, hvor en kombination af elektrisk stimulation, optagelse, og Drug injektion ønskes, i arter af gnaver størrelse eller større.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health (NIH), tilskud EY026924 og EY014800 (til B.N.), et ubegrænset tilskud fra forskning for at forhindre blindhed, Inc., New York, NY til Department of Ophthalmology og Visual Sciences, University af Utah, og start-up midler, der ydes til R.E. af Henry Samueli School of Engineering og Department of Electrical Engineering på University of California, Irvine. Denne metode er baseret på en tidligere rapport af en lignende metode udviklet i Dr. Tirin Moore’s Lab, udgivet i Noudoost & Moore 2011, Journal of Neuroscience metoder. Forfatterne takker Dr. Kelsey Clark for hendes kommentarer til manuskriptet.
3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |