당사는 전기 생리학을 위해 설계된 마이크로인로드 시스템을 제시하고 선택적 약물 주입과 함께 실험 프로브(즉, 나노센서, 마이크로전극)의 보조 전달을 지원합니다. 널리 이용 가능한 미세유체 성분은 프로브를 함유하는 캐뉼라에 결합된다. 마이크로 인젝트 로드 건설을위한 단계별 프로토콜이 포함되어 있으며, 마카크 피질에서 muscimol 주입 중 결과가 있습니다.
이 마이크로 인젝트로드 시스템은 약물 주입, 전기 생리학 및 마이크로 전극 및 나노 센서와 같은 실험 프로브의 전달 및 검색을 위해 설계되었으며 깨어 있는 동물의 반복 사용에 최적화되어 있습니다. 마이크로 인젝트 로드 시스템은 여러 가지 목적을 위해 구성 될 수있다 : (1) 그렇지 않으면 dura mater를 관통하기에 너무 깨지기 쉬운 실험 프로브의 배치를위한 캐뉼라의 간단한 배열, (2) 약물의 미세 유체 주입, 중 하나 독립적으로 또는 실험 프로브 (즉, 마이크로 전극, 나노 센서)를 포함하는 캐뉼라에 결합. 이 프로토콜에서 우리는 마이크로 인젝트로드의 단계 적 구성, 미세 유체 구성 요소에의 결합 및 생체 내에서 시스템을 사용하기위한 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다. 이 시스템의 미세 유체 구성 요소는 침투 손상을 최소화하면서 나노 리터 스케일에서 볼륨을 전달할 수 있습니다. 약물 주입은 깨어있는 동물에서 마이크로 전극 또는 나노 센서와 같은 실험 프로브와 독립적으로 또는 동시에 수행 될 수 있습니다. 이 시스템의 응용 분야는 약물이 피질 전기 적 활동 및 행동에 미치는 영향을 측정하는 것부터 프로브 또는 나노 센서 측정에 기반한 행동 성능의 맥락에서 피질의 특정 영역의 기능을 이해하는 것까지 다양합니다. 이 시스템의 기능 중 일부를 설명하기 위해, 우리는 작업 메모리 작업 동안 rhesus macaque에서 전두엽 안구 (FEF)의 가역적 인 비활성화에 대한 muscimol 주입의 예를 제시한다.
전기 생리학 및 약물 주입 방법은 신경 활동 및 행동, 생체 내, 설치류 및 영장류를 연구하기 위해 신경 과학에서 널리 사용됩니다. 지난 3년간, 초기 인젝트로드 모델의 개선은 보다 정밀하고 덜 침습적인 기술을 허용했으며, 특정 뇌 부위에서 동시 기록 및 약물주사를1,2,3. 특히 영장류의 경우, 고도로 훈련된 동물을 필요로 하는 고급 인지 기능 연구에 이 기술을 사용하려면 최소한의 조직 손상으로 소량을 정확하게 전달하는 능력이 중요합니다. 최근 진보는 이식된프로브4를이용한 자극과 함께 만성 전기생리학적 및 화학적 측정을 포함하고 있으며, 결합된 기록 및 미세유체 약물 전달은 최근 설치류5에서시범적으로 시험되고 있다. 여기서 설명된 인젝트로드 시스템은 전기생리학적 기록, 자극 및 정밀한 약물 전달을 허용하며, 이미 여러 영장류실험실에서성공적으로 구현되어 있다6,7,8.
신경 과학 응용 분야가 있는 나노 센서9,10과 같은 섬세한 특수 센서의 가용성이 증가함에 따라 깨지기 쉬운 나노 스케일 장치 또는 마이크로 전극 팁을 손상시키지 않으면서 경질 미터를 통해 프로브를 얻을 수 있는 신뢰할 수 있는 방법이 요구됩니다.
우리는 쉽게 사용할 수있는 저렴한 구성 요소를 사용하여 이러한 방법을 결합하는 기술적 인 문제를 극복하고 두 가지 주요 기능을 용이하게하는 마이크로 인젝트 로드 시스템을 설계했습니다. 마이크로 전극 또는 나노 센서, 경막 미더 및 신경 조직을 통해, 어떤 손상으로부터 보호. 이 기능을 사용하면 대상 위치에 실험 프로브를 배치 할 수 있으며, 신경 조직을 통해 가이드로 캐뉼라를 사용하여 전달됩니다. (ii) 전기 생리학 기록 및 약물 주입과 전기 자극을 결합한 실험을 수행하기 위해 마이크로 전극을 사용하는 능력.
우리의 시스템은 경도를 관통하는 가이드 튜브를 사용, 약물 전달을 위해 모두 기능 캐뉼라와 함께 (미세 주입시스템을 사용하는 경우) 마이크로 전극 또는 나노 센서에 대한 추가 보호를 제공합니다 (둘 다 경막을 통과 할 때 및 신경 조직). 이 시스템은 저렴하고 쉽게 찾을 수있는 널리 상업적으로 사용할 수있는 구성 요소로 쉽게 구성 할 수 있습니다. 우리는 작은 직경 의 캐뉼라 (외경 OD = 235 μm, 내경 ID = 108 μm)를 사용하여 침투 손상을 최소화합니다.
여기서 우리는 미세 유체 시스템의 미세 주입 로드 구성 및 구성에 대한 단계별 지침을 제시합니다. 우리는 약물 주입을 위한 microfluidic 시스템에 독립적으로 또는 결합된 microinjectrode의 사용을 위해 필요한 단계를 설명합니다. 나노센서9,10과같은 깨지기 쉬운 실험 프로브에도 유사한 접근법을 적용할 수 있다. 프로브는 캐뉼라에 전면 또는 후적재(설계에 따라 다름)할 수 있으며, 경막및 신경 조직을 관통할 때 손상으로부터 보호됩니다. 우리는 비 인간 영장류를 이용한 생체 내 실험에서 예제 데이터를 제공하며, 이 실험에서 우리는 전기 자극을 수행하기 위해 텅스텐 마이크로 전극을 사용하고, 이어서 동물이 기억 유도 사카데 (MGS) 작업을 수행하는 동안 전두엽 안구 (FEF)에 muscimol을 주입했습니다.
몇몇 방법은 현재 동시 약물 전달 및 전기 생리학을 능력을 발휘하기 위하여 유효합니다. 우리의 시스템은 독립적으로 또는 약물 주입과 함께 기록에 사용할 수있는 유연성을 가지고, 정밀하게 나노 센서 또는 마이크로 전극과 같은 깨지기 쉬운 실험 프로브를 배치 할 수있는 능력을 가지고, 어떤 손상으로부터 보호, 경구 마더 및 신경 조직을 통해. 이 시스템은 육안으로 약물 주입 볼륨을 정밀하게 제어 할 수 있습니다 (실험실3의이전 연구에서 나타난 17 nL 정밀도).
더 작은 직경12압력주입을 위한 더 전문화된 시스템이 있습니다. 이러한 시스템은 여러 기록 사이트를 허용하지만 시스템 제어에 필요한 소프트웨어 및 하드웨어의 복잡한 설정은 각 구성 요소에 대해 더 높은 비용을 수반하며 아직 대규모로 상용화되지 않은 실험 용 프로브와 인터페이스할 수 있는 유연성이 적습니다. 또한, 우리의 injectrode는 만성 임플란트를 필요로하지 않으며 유연성의 큰 정도를 제공합니다 : 화학 및 전기 생리 학적 신호를 측정하는 바이오 센서와 호환, 뿐만 아니라 약물을 주입 할 수있는, 이러한 응답에 국부적 인 약물 주입의 효과를 측정 할 수있는 가능성.
이 설계는 프로브의 구조에 손상을 방지하기 위해 듀라 침투 후 실험 프로브를 돌출 할 수 있습니다. 이 기능은 나노미터 규모의나노센서(10)와같은 임의의 실험 프로브의 손상을 위험없이, 장치의 다기능성, 경구를 관통할 수 있게 한다. 그러나, 표준 페룰에 대해 ~1 mm로 제한되는 페룰의 회전 수에 의해 제한되는 돌출될 수 있는 길이의 한계가 있다. 작은 캐뉼라 직경 (228 μm)으로 인한 최소한의 조직 손상이 있습니다.
우리가 보여 준 실험에서, 시스템은 FEF의 가역적 불활성화를 위한 muscimol의 통제된 전달을 능력을 발휘하기 위하여 이용되었습니다, 동시에 전기 자극 또는 세포외 기록 (단일 뉴런, 국부적인 필드 전위)를 사용하여 마이크로 전극. FEF에서의 이 실험은 불활성화 전에 삭케이드 벡터를 확인하기 위해 FEF의 미세 자극을 필요로 하며, 약물은 가역적 FEF 불활성화 동안 작업 기억을 연구하기 위해 주입되었다. 약물 주사 전후에 동일한 단하나 뉴런의 기록이 유지될 가능성은 희박합니다. 그러나 주입 전후에 로컬 필드 잠재력을 기록할 수 있었습니다. 여기서, 우리는 주입, 기록 및 전기 자극을 결합한 실험을 보여준다.
일단 설정되면 이 방법은 매우 안정적이고 견고합니다. 그러나, 작은 튜브 및 포트 내의 작은 분자 (예를 들어, 소금)의 침전으로 인해, 장애물과 누출의 미세 유체를 유지하기 위해 각 실험 후 철저한 플러싱이 필요합니다. 전체 회로의 단순성으로 인해 각 구성 요소를 독립적으로 교체하여 쉽게 문제를 해결할 수 있습니다.
이 방법은 인간이 아닌 영장류에서 FEF 영역에서 입증되었지만, 원리는 설치류 크기 또는 그 이상 종에서 전기 자극, 기록 및 약물 주입의 일부 조합이 바람직한 다른 뇌 영역에 적용될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 보건원 (NIH)의 자금 지원으로 지원되었으며, EY026924 및 EY014800 (B.N.에), 실명을 방지하기 위한 연구에서 무제한 보조금, Inc., 뉴욕, 뉴욕, 안과 및 시각 과학부에, 대학 헨리 사무엘리 공과대학과 캘리포니아 대학교 어바인 전기공학과에서 R.E.에 제공한 창업 기금. 이 방법은 Noudoost & 무어 2011, 신경 과학 방법의 전표에 간행된 Tirin Moore 박사의 실험실에서 개발된 유사한 방법의 이전 보고를 근거로 합니다. 저자들은 원고에 대한 그녀의 의견에 대해 켈시 클라크 박사에게 감사를 표합니다.
3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |