Vi presenterar ett microinjectrode-system som är utformat för elektrofysiologi och assisterad leverans av experimentella sonder (dvs. nanosensorer, mikroelektroder), med valfri drog infusion. Allmänt tillgängliga mikroflödessystem komponenter är kopplade till en kanyl som innehåller sonden. Ett steg-för-steg-protokoll för microinjectrode konstruktion ingår, med resultat under muscimol infusion i makak cortex.
Detta microinjectrode systemet är utformat för drog infusion, elektrofysiologi, och leverans och hämtning av experimentella sonder, såsom mikroelektroder och nanosensorer, optimerad för upprepad användning i vaken, beter sig djur. Microinjectrode systemet kan konfigureras för flera ändamål: (1) enkel arrangemang av kanyl för placering av en experimentell sond som annars skulle vara alltför bräcklig för att penetrera dura mater, (2) mikroflödessystem infusion av ett läkemedel, antingen eller kopplad till en kanyl som innehåller en experimentell sond (dvs. mikroelektrod, nanosensor). I detta protokoll förklarar vi steg för steg byggandet av microinjectrode, dess koppling till mikroflödessystem komponenter, och protokollet för användning av systemet in vivo. Mikroflödessystem komponenter i detta system möjliggör leverans av volymer på nanoliter skala, med minimal penetration skador. Drug infusion kan utföras självständigt eller samtidigt med experimentella sonder såsom mikroelektroder eller nanosensorer i en vaken, beter sig djur. Tillämpningar av detta system sträcker sig från att mäta effekterna av en drog på kortikala elektrisk aktivitet och beteende, att förstå funktionen av en viss region av cortex i samband med beteendemässiga prestanda baserat på sond eller nanosensor mätningar. För att demonstrera några av funktionerna i detta system, presenterar vi ett exempel på muscimol infusion för reversibel inaktivering av främre ögat fältet (FEF) i Rhesus makak under en arbetsminne uppgift.
Elektrofysiologi och drog injektion metoder används ofta i neurovetenskap för att studera neuronala aktivitet och beteende, in vivo, hos gnagare och primater. Under de senaste tre decennierna, förbättringar av tidig injectrode modellerna tillät en mer exakt och mindre invasiv teknik, och samtidig inspelning och läkemedels injektion på specifika hjärn platser1,2,3. För primater i synnerhet är förmågan att exakt leverera små volymer med minimal vävnadsskada avgörande om tekniken ska användas för studiet av avancerade kognitiva funktioner som kräver högutbildade djur. Senaste framstegen omfattar kroniska elektrofysiologiska och kemiska mätningar i kombination med stimulering med hjälp av implanterade sonder4, och kombinerad inspelning och mikrofluidic läkemedelsleverans har nyligen lovad i gnagare5. Den injectrode systemet beskrivs här tillåter elektrofysiologiska inspelning, stimulering, och exakt läkemedelsleverans, och det har redanframgångsrikt genomförts i flera primater Labs6,7,8.
Den ökande tillgängligheten av ömtåliga, specialiserade sensorer, såsom nanosensorer9,10 med neurovetenskap applikationer, kräver en tillförlitlig metod för att få sonden genom dura mater utan att skada den bräckliga nanoskala enheter eller mikroelektrod tips.
Vi konstruerade en microinjectrode system som övervinner de tekniska utmaningarna med att kombinera dessa metoder med lätt tillgängliga, billiga komponenter, och underlättar två huvudfunktioner: (i) förmågan att placera en bräcklig experimentell sond, såsom en mikroelektrod eller nanosensor, genom dura mater och neurala vävnad, skyddas från eventuella skador. Denna funktion möjliggör placering av experimentell sond på riktade platser, levereras med hjälp av kanyl som en guide genom neurala vävnad. (II) förmågan att använda en mikroelektrod för att utföra experiment som kombinerar elektrofysiologi inspelningar och elektrisk stimulering med injektion av läkemedel.
Vårt system använder ett styr rör för att penetrera Dura, tillsammans med en kanyl som fungerar både för läkemedelsleverans (när du använder systemet för mikroinfusion) och ger ytterligare skydd för mikroelektroden eller nanosensorn (både när passerar genom Dura och nervvävnad). Detta system kan enkelt konstrueras med allmänt kommersiellt tillgängliga komponenter, som är billiga och lätta att hitta. Vi minimerar penetration skador genom att använda en liten diameter kanyl (yttre diameter OD = 235 μm, innerdiameter ID = 108 μm).
Här presenterar vi steg-för-steg instruktioner för microinjectrode konstruktion och konfiguration av mikroflödessystem systemet. Vi förklarar de steg som behövs för användning av microinjectrode, antingen självständigt eller kopplat till mikroflödessystem system för injektion av läkemedel. En liknande metod kan tillämpas med alla ömtåliga experimentella sond, såsom en nanosensor9,10. Sonden kan vara fram-eller back-Loaded i kanyl (beroende på design), och kommer att skyddas från skador när penetrerande Dura och neurala vävnad. Vi tillhandahåller exempeldata från ett in vivo experiment med icke-mänskliga primater, där vi använde en volfram mikroelektrod för att utföra elektrisk stimulering, och därefter injiceras muscimol i frontal ögat fältet (FEF) medan djuret utfört en minne guidad Saccade (MGS) uppgift.
Flera metoder finns för närvarande för att utföra samtidig läkemedelsleverans och elektrofysiologi. Vårt system är avsett att ha flexibiliteten att användas för inspelningar antingen självständigt eller i kombination med läkemedels injektion, och att ha förmågan att exakt Placera någon bräcklig experimentell sond, såsom en nanosensor eller en mikroelektrod, skyddad från eventuella skador, genom dura mater och neurala vävnad. Systemet möjliggör exakt kontroll av infusionspåsar för infusion med blotta ögat (17 nL precision visas i tidigare studier i vårt labb3).
Det finns mer specialiserade system för pressa injektionen med mindre diametrar12. Dessa system tillåter flera inspelningsplatser, men den komplexa installationen av programvara och hårdvara som krävs för kontroll av systemet medför högre kostnader för var och en av komponenterna, och har mindre flexibilitet att samverka med experimentella sonder som ännu inte kommersialiseras i stor skala. Dessutom, vår injectrode kräver inte ett kroniskt implantat och ger en stor grad av flexibilitet: kompatibel med biosensorer för att mäta kemiska och elektrofysiologiska signaler, och kan infusion droger också, med potential att mäta effekten av lokaliserade drog infusioner på dessa svar.
Konstruktionen gör det möjligt för den experimentella sonden att sticka ut efter Dura penetration för att undvika skador på probens struktur. Denna funktion gör det möjligt för multifunktionaliteten av enheten, att tränga in i Dura utan att riskera skador på någon experimentell sond som nanometer-skala nanosensorer10. Det finns dock en begränsning av längden som kan sticka ut, begränsas av antalet varv av Ferrule, begränsad till ~ 1 mm för standard Ferrules. Det finns minimal vävnadsskada på grund av den lilla kanyldiametern (228 μm).
I experimentet vi visade, systemet användes för att utföra kontrollerad leverans av muscimol för reversibel inaktivering av FEF, samtidigt med antingen elektrisk stimulering eller extracellulär inspelning (Single neuron, lokal fältpotential) med hjälp av en mikroelektrod. Detta experiment i FEF kräver mikrostimulering av FEF för att bekräfta Saccade vektorer före inaktivering, och läkemedlet infunderas för att studera arbetsminnet under reversibel FEF inaktivering. Det är osannolikt att en inspelning från samma isolerade enda neuron kan upprätthållas före och efter drogen injektion; emellertid, vi kunde spela in lokala fältpotentialer före och efter infusion. Här visar vi ett experiment som kombinerar injektion, inspelning och elektrisk stimulering.
När den är inställd, är metoden mycket tillförlitlig och robust. Men på grund av utfällning av små molekyler (t. ex. salt) inom det lilla röret och hamnar, krävs en grundlig spolning efter varje experiment för att hålla mikrofluidik fri från hinder och läckor. På grund av enkelheten i hela kretsen kan varje komponent bytas ut oberoende för enkel felsökning.
Även om metoden visades i FEF området i en icke-mänsklig primat, principen kan tillämpas på alla andra hjärnområden där en kombination av elektrisk stimulering, inspelning, och injektion av läkemedel önskas, i arter av gnagare storlek eller större.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (NIH), bidrag EY026924 och EY014800 (till B.N.), ett fritt bidrag från forskning för att förhindra blindhet, Inc., New York, NY till Institutionen för oftalmologi och visuell vetenskap, universitet av Utah, och start-up medel ges till re av Henry samueli School of Engineering och Institutionen för elektroteknik vid University of California, Irvine. Denna metod är baserad på en tidigare rapport av en liknande metod som utvecklats i Dr Tirin Moore ‘ s Lab, publicerad i Noudoost & Moore 2011, Journal of neurovetenskap Methods. Författarna tackar Dr Kelsey Clark för hennes kommentarer på manuskriptet.
3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |