Summary
ونحن نقدم نظام ميكرونجيكترودي مصممه لفسيولوجيا الكهربائية والتسليم بمساعده من التحقيقات التجريبية (اي نانونسيرس ، ميكروالكترودات) ، مع ضخ المخدرات اختياري. وتقترن علي نطاق واسع المكونات ميكروفلويدريك المتاحة إلى قني التي تحتوي علي المسبار. يتم تضمين بروتوكول خطوه بخطوه للبناء microinjectrode ، مع النتائج خلال ضخ muscimol في قشره المكاك.
Abstract
تم تصميم هذا النظام microinjectrode لضخ المخدرات ، والفيزيولوجيا الكهربية ، والتسليم واسترجاع المسبارات التجريبية ، مثل الأقطاب المجهرية والنانو ، الأمثل للاستخدام المتكرر في مستيقظا ، والكائنات التي تتصرف. يمكن تكوين نظام microinjectrode لأغراض متعددة: (1) ترتيب بسيط من قني لوضع مسبار التجريبية التي من شانها ان تكون غير ذلك هش جدا لاختراق الام الجافية ، (2) ضخ ميكروفلويدريك من المخدرات ، اما بصوره مستقله أو مقترنة بأكله اللحوم التي تحتوي علي مسبار تجريبي (اي القطب المجهري أو نانوسيسور). في هذا البروتوكول نفسر خطوه بخطوه البناء من microinjectrode ، اقترانه إلى مكونات ميكروفلويديك ، وبروتوكول لاستخدام النظام في الجسم المجري. وتسمح المكونات الصغيرة لهذا النظام بتسليم الكميات علي مقياس نانوليتر ، مع الحد الأدنى من الضرر الناتج عن الاختراق. يمكن ان يتم ضخ المخدرات بشكل مستقل أو في وقت واحد مع تحقيقات تجريبية مثل الأقطاب المجهرية أو نانونسيرس في مستيقظا ، يتصرف الحيوانية. تطبيقات هذا النظام تتراوح من قياس اثار المخدرات علي النشاط الكهربائية القشرية والسلوك ، لفهم وظيفة منطقه معينه من القشرة في سياق الأداء السلوكي استنادا إلى المسبار أو نانونسياو القياسات. لإظهار بعض من قدرات هذا النظام ، ونحن نقدم مثالا علي ضخ muscimol لتنشيط عكسها من حقل العين الجبهي (FEF) في ماكاك الريسوس اثناء مهمة ذاكره العمل.
Introduction
وتستخدم علي نطاق واسع الفيزيولوجيا الكهربية وطرق حقن المخدرات في علم الأعصاب لدراسة النشاط العصبي والسلوك, في الجسم الآخر, في القوارض والرئيسيات. وعلي مدي العقود الثلاثة الماضية ، سمحت التحسينات التي أدخلت علي نماذج الإنجاز المبكر بتقنية أكثر دقه واقل توغلا ، والتسجيل المتزامن وحقن المخدرات في مواقع المخ المحددة1،2،3. بالنسبة لرئيسيات علي وجه الخصوص ، القدرة علي تسليم كميات صغيره بدقه مع الحد الأدنى من تلف الانسجه أمر بالغ الاهميه إذا كانت هذه التقنية لاستخدامها لدراسة الوظائف المعرفية المتقدمة التي تتطلب الحيوانية المدربين تدريبا عاليا. وتشمل التطورات الاخيره القياسات الكهربية الفسيولوجية والكيميائية المزمنة بالاقتران مع التحفيز باستخدام المجسات المزروعة4، وتم مؤخرا تجريب التسجيل المشترك وتوصيل المخدرات ميكروفلويدريك في القوارض5. نظام injectrode الموصوفة هنا يسمح التسجيل الكهربي ، والتحفيز ، وتسليم المخدرات بدقه ، وقد تم بالفعل تنفيذها بنجاح في مختبرات متعددة الرئيسيات6،7،8.
ان التوافر المتزايد لأجهزه الاستشعار الحساسة والمتخصصة ، مثل النانو9،10 مع تطبيقات العلوم العصبية ، يتطلب طريقه موثوقه للحصول علي المسبار من خلال الام الجافية دون اتلاف الاجهزه النانويه الهشة أو نصائح القطب المجهري.
قمنا بتصميم نظام ميكرونجيكترودي الذي يتغلب علي التحديات التقنية للجمع بين هذه الطرق باستخدام المكونات المتاحة بسهوله ، والمنخفضة التكلفة ، ويسهل وظيفتين رئيسيتين: ' 1 ' القدرة علي وضع مسبار تجريبي هش ، مثل القطب المجهري أو نانونسياو ، من خلال الام الجافية والانسجه العصبية ، محمية من اي ضرر. تسمح هذه الوظيفة بوضع المسبار التجريبي في المواقع المستهدفة ، وتسليمه باستخدام الكانولا كدليل من خلال النسيج العصبي. ' 2 ' القدرة علي استخدام القطب المجهري لاجراء تجارب تجمع بين تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية والتحفيز الكهربائي وحقن المخدرات.
يستخدم نظامنا أنبوب دليل لاختراق الجافية ، جنبا إلى جانب مع قني الذي يعمل علي حد سواء لتسليم المخدرات (عند استخدام نظام الضخ المجهري) ويوفر حماية اضافيه للميكروقطب أو نانوسيسور (سواء عندما يمر من خلال الجافية الانسجه العصبية). هذا النظام يمكن بناؤها بسهوله مع المكونات المتاحة تجاريا علي نطاق واسع ، والتي هي غير مكلفه وسهله للعثور علي. نحن تقليل الضرر اختراق باستخدام قني قطر صغير (القطر الخارجي OD = 235 μm ، القطر الداخلي ID = 108 μm).
هنا نقدم تعليمات خطوه بخطوه لبناء microinjectrode والتكوين من النظام ميكروفلويديك. نحن نشرح الخطوات اللازمة لاستخدام microinjectrode ، اما بشكل مستقل أو بالاقتران مع نظام ميكروفلويدريك لحقن المخدرات. ويمكن تطبيق نهج مماثل مع اي مسبار تجريبي هش ، مثل نانوسينسياو9،10. يمكن ان يكون المسبار الامامي أو الخلفي محملا في الكانولا (اعتمادا علي التصميم) ، سيتم حمايته من التلف عند اختراق الانسجه الجافية والعصبية. نحن نقدم مثال البيانات من تجربه في الجسم الخارجي مع الرئيسيات غير البشرية ، والتي استخدمناها القطب الصغير التنغستن لأداء التحفيز الكهربائي ، وبعد ذلك حقن muscimol في مجال العين الاماميه (FEF) في حين ان الحيوانية أداء الذاكرة الموجهة (MGS) مهمة.
Protocol
واتبعت الإجراءات التجريبية الدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية وجمعيه المبادئ التوجيهية والسياسات المتعلقة بالعلوم العصبية. تمت الموافقة علي بروتوكولات الإجراءات التجريبية والسلوكية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه يوتا.
1-بناء ميكروانجيكترودي للتحفيز والتسجيل (الشكل 1ا)
- قياس طول الكانولا والمسبار (في هذا المثال نانونسيور). يجب ان يكون المسبار أطول من الكانولا بالطول الذي يبرزه من طرف الكانولا (اعتمادا علي تصميم المسبار) بالاضافه إلى حوالي 2 سم.
- تحت المكبر أو المجهر (~ 10x التكبير) ، وتحميل التحقيق في cannula. إذا كان ذلك ممكنا التحميل الخلفي هو الأفضل لحماية غيض من التحقيق.
ملاحظه: هذه الخطوة ، التي تتم يدويا ، هي صعبه. فمن المستحسن لممارسه مع القطب الصغير تحت عدسه مكبره قبل محاولة مع مسبار التجريبية الفعلية. -
تمرير قني (التي تحتوي علي المسبار) من خلال الطواده العليا ، T-تقاطع ، والطوير السفلي.
- إذا كان المسبار هو مجرد سلك واحد دون اي مرفقات ، العودة-تحميله في التفت وادراج التجميع في تقاطع T من الطواده السفلي. يجب وضع اعلي من قني (الجانب المسطح النهاية) في منتصف تقاطع T ، داخل الجزء السفلي ولكن ليس الطواده العليا. المسبار التجريبي أو الاستشعار الحيوي يجب ان يبرز فوق قمة الطواده العليا.
ملاحظه: ويمكن أيضا صنع القواعد المخصصة من خلال حفر ثقب في المقابس الطوير باستخدام لقم الحفر الصغرى ، وحجم الحفرة التي تقوم علي القطر اللازم لتشديد قني إلى تقاطع T.
- إذا كان المسبار هو مجرد سلك واحد دون اي مرفقات ، العودة-تحميله في التفت وادراج التجميع في تقاطع T من الطواده السفلي. يجب وضع اعلي من قني (الجانب المسطح النهاية) في منتصف تقاطع T ، داخل الجزء السفلي ولكن ليس الطواده العليا. المسبار التجريبي أو الاستشعار الحيوي يجب ان يبرز فوق قمة الطواده العليا.
- استخدام وجع الطواده لتشديد القواعد علي الجزء العلوي والسفلي من تقاطع T. لا الإفراط في تشديد. ويمكن أضافه قطعه صغيره من الأنابيب لتعزيز دعم القطب داخل الطواده العليا.
- لحام الذهب دبابيس لكل من محطات التحقيق (اشاره ، الأرض ، وما إلى ذلك) ، وفقا للمواصفات التحقيق.
- ضبط الوضع النسبي للتحقيق و cannula. قياس المسافة التي جاحظ المسبار من قني تحت التكبير ، وضبط يدويا من النهاية العليا (المسبار يمكن ان تنزلق بحريه داخل القواعد).
- أضافه الغراء الايبوكسي بين دبابيس الذهب والطواق العلوي لنعلق التحقيق إلى الطواده.
- فك المسمار العلوي لسحب المسبار داخل cannula. بصريا تاكيد ان التحقيق هو تماما داخل قني تحت التكبير.
- ارفق الحقن بالمحرك الصغير.
2. بناء ميكروانجيكترودي لضخ المخدرات (الشكل 1ب)
- نعلق "غير مشطوف" أو نهاية مسطحه من قني إلى الجزء السفلي من تقاطع T باستخدام الطواده. استخدام وجع الطواده لتشديد الطواده.
- نعلق قطعه صغيره من الأنابيب الشعرية (~ 1.5 سم) إلى الجزء العلوي من تقاطع T عن طريق تمريرها من خلال الطواده القياسية. تشديد مع وجع الطواده.
- الخلفي تحميل القطب الصغير من خلال أنابيب شعريه ، T-تقاطع ، قني والقواعد المقابلة.
- تاكد من ان الجزء الخلفي من القطب يبرز اقل من 1 سم من الخلف من الأنابيب الشعرية ، وغيض من القطب يبرز من قني علي المسافة المطلوبة علي الجانب السفلي. يمكن تعديل موضع القطب يدويا من اعلي النهاية.
- جندي دبوس الذهب إلى محطه ميكروالكترود.
- أضافه الغراء الايبوكسي بين دبوس الذهب والطواق العلوي لإرفاق ميكروالكترود للطوير.
- فك المسمار العلوي للتراجع عن المسبار داخل cannula. تاكد بصريا من ان القطب المجهري هو تراجع تماما في cannula.
3-بناء حلبه ميكروفلويديك (الشكل 2)
- وضع لوح الخبز علي سطح مستقر. وضع الصمامات 2 3 الطريقة موازيه لأطول الجانبين من لوح الخبز ، حوالي 6 في. وبصرف الفضل مع منفذ واحد (واحد الذي هو دائما مفتوحة) تواجه بعضها البعض. استخدام مسامير لإصلاح الصمامات إلى لوح الخبز.
- وضع مسطره بجانب الصمامات (لقياس وتتبع حركه السوائل داخل الأنابيب الشعرية).
- تحميل خليط من النفط اللزوجة المنخفضة 1:1 والغذاء التلوين (علامة) في حقنه gastight ومكان في مضخة ماركر. قطع قطعه واحده من الأنابيب الشعرية ، واستخدام القواعد القياسية و Luer-قفل الموصلات لتوصيل حقنه إلى واحده من الموانئ علي صمام الإدخال. هذا هو "خط العلامة".
- قطع قطعه قصيرة من الأنابيب الشعرية ل "خط المسطرة". استخدام القواعد القياسية لتشديد علي الموانئ التي تواجه الصمامات.
- قطع قطعتين أطول من الأنابيب الشعرية لتوصيل صمام الإخراج إلى microinjectrode ، وربط مضخة المخدرات إلى صمام الإدخال (استخدام القواعد القياسية).
ملاحظه: طول هذين الخطين يعتمد علي الاعداد التجريبي ، يجب علي المرء ان يكون طويلا بما يكفي للوصول من جهاز ضخ إلى الحيوانية ، والاخر واحد من مضخة المخدرات إلى صمام الإدخال. استخدام حجر الكشط لقطع الأنابيب الشعرية.
4. تركيب Microinjectrode إلى Microdrive (الشكل 3)
- تاكد من تراجع القطب المجهري/المسبار التجريبي في الكانولا قبل التركيب.
ملاحظه: يجب ان يكون أنبوب دليل في موقف في microdrive. - إرفاق محول مخصصه الصنع إلى microinjectrode.
- الأعلى-تحميل microinjectrode من خلال أنبوب دليل وتامينه للمحول باستخدام مسامير.
- قياس موقف microdrive (العمق) الذي نتوء microinjectrode من أنبوب دليل ، ثم سحبه ~ 1 سم للتحضير للادراج.
- لتجارب التسريب المجهري ، قم بتوصيل "خط الدماغ" إلى فتح تقاطع T غير المستخدمة من microinjectrode. استخدام الطواده القياسية وتشديد مع وجع الطواده.
5. تنظيف واعداد النظام ميكروفلويدريك
- ضع القرص الصغير مع microinjectrode علي دورق النفايات.
- تحميل الكلوركسيدين (علي سبيل المثال ، nolvasan ؛ يذوب في 20 غرام/لتر) في 1 مل حقنه gastight ووضعه في مضخة المخدرات. تحويل اتجاه تدفق الصمامات بحيث ينتقل السائل من ضخ المخدرات من خلال صمام لخط الصمام وخارج "خط الدماغ".
- مسح الدائرة مع الكلوركسيدين باستخدام معدل تدفق منخفض (50-200 μL/min) لمده لا تقل عن 10 دقيقه. كرر الخطوات 5.2 من خلال 5.3 مع المحلول الملحي المعقم ومن ثم الهواء.
ملاحظه: من المهم التحقق من وجود تسرب في هذه المرحلة. تطبيق بلطف مناديل خاليه من الوبر في التقاطعات للمساعدة في الكشف عن اي تسريبات السائل من خلال الطوير. - تحميل الدواء في حقنه gastight 500 μL ، ضغط الهواء ومن ثم وضع في مضخة المخدرات. تدفق في 50 μL/min حتى بضع قطرات تتدفق من microinjectrode.
- نقع في أنبوب دليل في الكلورههيكسيدين (المذاب في 20 غرام/لتر) لمده 15 دقيقه.
- أدر اتجاه صمام الإخراج نحو "خط التنظيف". تقدم مضخة ماركر حتى يتم ملاحظه حافه واضحة من اللون والزيت علي خط المسطرة. تاكد من ان هناك دائما النفط بين المخدرات واللون من أجل عدم مزج اثنين من المواد القابلة للذوبان في الماء وتفقد الحافة الحاده بينهما. وضع علامة بداية لهذا الخط النفط/صبغ (مع قطعه من الشريط أو علامة).
- تحويل اتجاه صمام الإخراج نحو خط الدماغ.
6. أداء التسجيل أو تجربه ضخ
ملاحظه: ستختلف خطوات مناوله الماشية حسب المعمل والتجربة. يتم تنفيذ الخطوات التالية بعد العملية الجراحية اللازمة وقد تم التحضير للكشف عن الجافية. وبعد التجربة ، يجب تنفيذ جميع الخطوات اللازمة لما بعد الإجراءات وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.
- إرفاق microdrive إلى غرفه التسجيل. خفض أنبوب دليل لاختراق الجافية.
ملاحظه: يجب ان أنبوب دليل لا تخترق اي ابعد من الجافية من أجل تجنب اتلاف القشرة. - خفض microinjectrode إلى حوالي 2 مم فوق الموقع للتسجيل/الحقن في الدماغ.
- تشديد الطواده العلوي (جاحظ القطب المجهري/biosensor) وربط دبابيس الذهب إلى نظام التسجيل. الحفاظ علي التقدم في microinjectrode إلى الموقع المستهدف.
ملاحظه: تذكر ان تشمل المسافة التي يمتد القطب الصغير إلى ما بعد قني في الحسابات. - لتجارب التسريب ، استخدم مضخة الحقن المجهرية اليدوية لتحريك عمود الزيت بمقدار 1 سم كل 3 دقائق (~ 60 nL/min). بمجرد ان يتم غرس الحجم المطلوب ، قم بتبديل صمام الإخراج باتجاه خط التنظيف.
ملاحظه: وسوف تختلف حجم غرست استنادا إلى الأنواع النموذجية ومنطقه الدماغ المستهدفة. قد تضر معدلات التدفق الأسرع الانسجه العصبية. - عندما تكون التجارب كامله ، والتراجع microinjectrode داخل أنبوب دليل (ترك المسبار نتوء). ثم قم بازاله microdrive لتنظيف. مسح النظام ميكروفلويديك كما هو موضح في الخطوات 5.1-5.5. للاستعداد لأعاده الاستخدام.
ملاحظه: في تجربتنا ، فان microinjectrode سوف تستمر لعده استخدامات إذا تم اتخاذ الرعاية المناسبة. جوده التسجيل الكهربية تنخفض بشكل أسرع من القدرة علي الحقن.
Representative Results
أجرينا حقن ناهض GABAa (muscimol) لتنشيط عكسها من حقل العين الجبهي (FEF) ، في حين ان الحيوانية أداء الذاكرة الموجهة saccade المهمة11. في هذه المهمة ، يتم تقديم المثبتات الحيوانية وهدف البصرية الطرفية. الحيوانية يحافظ علي التثبيت في حين تذكر الموقع المستهدف ، وبمجرد ان تختفي نقطه التثبيت ، ينفذ حركه العين الرمشه إلى موقع تذكرت للحصول علي مكافاه. تم بناء microinjectrode وفقا للتعليمات الواردة في الشكل 1ب. وكان حجم التسريب للتجربة المثال 850 nL. ويظهر الأداء السلوكي علي الذاكرة الموجهة المهمة (MGS) في مواقع مختلفه والأوقات النسبية لضخ muscimol في الشكل 4. لوحظ العجز أكبر أداء في 2 إلى 3 ح بعد التسريب.
الشكل 1: خطوه بخطوه تلفيق ميكروانجيكترودي. (ا) التكوين للاستخدام بشكل مستقل عن نظام ميكروفلويدريك. يتم قياس cannula والمسبار من أجل التاكد من ان غيض من المسبار يمكن ان تبرز في الطول المطلوب (علي سبيل المثال ، 150 μm). المسبار الامامي محمل في المصنع يتم تمرير قني من خلال تقاطع t وتعلق علي الجانب السفلي ، مع نهاية مسطحه في منتصف تقاطع t ؛ النهاية الخلفية لمسبار يستمر من خلال الطواده العليا. يتم الانتهاء من microinjectrode من قبل دبابيس الذهب لحام علي كل من محطات التحقيق وأضافه الغراء بينهما والطوير الأعلى للاستقرار. يعتمد توصيل إلى الاكتساب نظامه علي التصميم من التحقيق. في هذا المثال ، المسبار الخاص بنا هو نانوسينسياو مع ثلاثه خيوط. (ب) التكوين للاستخدام مع نظام ميكروفلويدريك. للزوجين microinjectrode إلى النظام ميكروفلويديك ، يتم استخدام قطعه من الأنابيب الشعرية للجانب العلوي من تقاطع T. يمكن ان يكون المسبار الامامي أو الخلفي تحميل. ثم يتم توصيل خط ميكروفلويديك إلى افتتاح تقاطع T الثالث. في هذا المثال استخدمنا ميكروالكترود. انظر الصورة المكبرة لغيض من قني الذي نتوء القطب الصغير من خلال تشديد الطواده العليا. انظر جدول المواد للاطلاع علي قائمه بالأصناف المستخدمة في البناء. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظام ميكروفلويدريك. يسمح تكوين الصمامين بالتحكم في اتجاه التدفق نحو microinjectrode أو نحو خط التنظيف لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الدائرة تعتمد علي اثنين من 3-ميناء الصمامات المتصلة باستخدام أنابيب الشعرية والقواعد القياسية. وتستخدم المحاقن gastight لحمل وحقن المخدرات التسريب وعلامة. مضخة حقنه قابله للبرمجة يسمح لتنظيف التلقائي للنظام وتحميل المخدرات. مضخة ميكرومحقنه يدوية تسمح بالحقن المتحكم به والتصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تركيب microinjectrode إلى ميكرودرايف هيدروليكي مع وبدون قدره الحقن. الخطوة 4.1: محول مخصص الصنع يسمح للمرفق ميكرونجيكترودي إلى microdrive. برغي واحد يربط المحول إلى microdrive. اثنين من مسامير الأمن ميكرونجيكترودي إلى المحول. يجب ان يكون الطواق العلوي غير ثمل علي الأقل 2 يتحول من أجل حماية غيض من القطب المجهري/المسبار التجريبي عند تحميل microinjectrode في أنبوب دليل من microelectrode. الخطوة 4.3: ادراج ميكروانجيكترودي في أنبوب دليل من الأعلى. الخطوة 4.4: إذا كنت تقوم بالضخ المجهري ، قم بتوصيل خط المخدرات بفتحه التقاطع T الثالثة باستخدام الطواده البلاستيكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الذاكرة الموجهة المهمة saccade خلال ضخ muscimol في FEF. (ا) وضع الحقن المجهري في النصف الأيمن من الكره الارضيه ، منطقه الاتحاد. (ب) الأداء السلوكي اثناء مهمة MGS التي يتم فيها وضع ثمانيه أهداف محيطيا. ركضنا 4 كتل من المهمة MGS ، قبل وفي ثلاث مرات بعد الحقن. المؤامرة القطبية يظهر الأداء (الانحراف) في كل من هذه الأوقات (اللون) ، لمواقع مختلفه بالنسبة لنقطه التثبيت (زاوية علي المؤامرة القطبية). انخفاض الأداء بوضوح في اليسار hemifield البصرية 2 ح بعد الحقن (الأزرق تتبع ، النصف الأيسر من المؤامرة القطبية). (c) اثار saccade ل 8 مواقع الذاكرة الطرفية قبل (اليسار) وبعد حقن muscimol في fef (الحق ، 1 و 3 ح بعد التسريب). وانخفضت دقه saccade في hemifield البصرية اليسرى (النصف الأيسر من المؤامرات القطبية) بعد حقن muscimol. المقياس بدرجات الزاوية البصرية (dva). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تتوفر العديد من الطرق حاليا لتنفيذ التسليم في وقت واحد المخدرات والكهربية. والمقصود من نظامنا ان يكون المرونة التي يمكن استخدامها للتسجيلات اما بشكل مستقل أو بالاشتراك مع حقن المخدرات ، وان يكون القدرة علي وضع بدقه اي مسبار التجريبية الهشة ، مثل نانوسيسور أو ميكروالكترود ، محمية من اي ضرر ، من خلال الام الجافية والانسجه العصبية. يسمح النظام بالتحكم الدقيق في كميات تسريب المخدرات بالعين المجردة (17 nL الدقة المبينة في الدراسات السابقة في مختبرنا3).
هناك أكثر يختص نظامات لضغطه حقنه مع أقطار صغيره12. وتسمح هذه النظم بمواقع تسجيل متعددة ، ولكن الاعداد المعقد للبرامج والاجهزه اللازمة للسيطرة علي النظام يحمل تكاليف اعلي لكل مكون ، ولديه مرونة اقل في التفاعل مع المسبارات التجريبية التي لم يتم تسويقها بعد علي نطاق واسع. وعلاوة علي ذلك ، فان الحقن الخاصة بنا لا تتطلب زرعا مزمنا وتوفر درجه كبيره من المرونة: متوافقة مع المواد البيولوجية لقياس الإشارات الكيميائية والكهربية ، وقادره علي غرس المخدرات أيضا ، مع امكانيه قياس تاثير ضخ المخدرات الموضعية علي هذه الاستجابات.
ويسمح التصميم ببروز المسبار التجريبي بعد اختراق الجافية من أجل تجنب الاضرار التي لحقت بهيكل المسبار. هذه الميزة تسمح لتعدد وظائف الجهاز ، لاختراق الجافية دون المخاطرة بالضرر من اي مسبار التجريبية مثل نانومتر مقياس نانوسينسيرس10. ومع ذلك ، هناك قيود علي طول التي يمكن ان تكون نتوء ، مقيده بعدد من المنعطفات من الطوير ، وتقتصر علي ~ 1 مم للقواعد القياسية. هناك الحد الأدنى من تلف الانسجه نظرا لقطر قني الصغيرة (228 μm).
في التجربة التي أظهرناها ، تم استخدام النظام لأداء التسليم المراقب من muscimol لتعطيل عكسها من FEF ، في وقت واحد مع اما التحفيز الكهربائي أو تسجيل خارج الخلية (الخلايا العصبية واحده ، وإمكانات المجال المحلي) باستخدام الميكروالكترود. هذه التجربة في FEF يتطلب التحفيز المجهري لل FEF لتاكيد ناقلات saccade قبل التعطيل ، وتم غرس المخدرات لدراسة الذاكرة العاملة اثناء التنشيط FEF عكسها. ومن غير المرجح ان التسجيل من نفس الخلايا العصبية واحده معزولة يمكن الحفاظ عليها قبل وبعد حقن المخدرات; ومع ذلك ، تمكنا من تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية قبل وبعد التسريب. هنا ، نعرض تجربه تجمع بين الحقن والتسجيل والتحفيز الكهربائي.
بمجرد ان يتم اعدادها ، وطريقه موثوقه جدا وقويه. ومع ذلك ، بسبب هطول الامطار من جزيئات صغيره (علي سبيل المثال ، الملح) داخل أنبوب صغير والموانئ ، مطلوب تنظيف شامل بعد كل تجربه من أجل الحفاظ علي موائع خاليه من العوائق والتسريبات. نظرا لبساطه الدائرة بأكملها ، يمكن استبدال كل مكون بشكل مستقل لسهوله استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
علي الرغم من انه تم التدليل علي هذه الطريقة في منطقه FEF في الرئيسيات غير البشرية ، يمكن تطبيق هذا المبدا علي اي منطقه الدماغ الأخرى حيث الرغبة في الجمع بين التحفيز الكهربائي ، وتسجيل ، وحقن المخدرات المطلوبة ، في الأنواع من حجم القوارض أو أكبر.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة ، ومنح EY026924 و EY014800 (إلى B.N.) ، وهو منحه غير مقيده من البحوث لمنع العمي ، وشركه ، نيويورك ، NY إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية ، جامعه من ولاية يوتا ، وأموال البدء المقدمة إلى R.E. من قبل مدرسه هنري صامويل للهندسة وقسم الهندسة الكهربائية في جامعه كاليفورنيا ، ايرفين. ويستند هذا الأسلوب علي تقرير سابق من طريقه مماثله وضعت في مختبر الدكتور Tirin مور, نشرت في نودووست & مور 2011, مجلة أساليب العلوم العصبية. ويشكر المؤلفون الدكتورة كيلسي كلارك علي تعليقاتها علي المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson's disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
